Name: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser les tests thrombolytiques en intégrant la dynamique des écoulements dans les modèles in vitro
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

La recherche rapportée dans cette publication a été soutenue par le National Heart, Lung, And Blood Institute des National Institutes of Health sous le numéro de prix R01HL167877. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health.

Toutes les méthodes mentionnées ci-dessous sont conformes aux protocoles du comité d’examen institutionnel (IRB) et du comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement. Tous les volontaires en bonne santé ont fourni un consentement écrit et éclairé avant le don de sang. Il convient de noter que tous les documents mentionnés dans le protocole se trouvent dans le Tableau des matériaux. Bien que la WB et le plasma humains soient abordés tout au long de ce protocole, l’utilisa...

Combinaison de la boucle de Chandler et du RT-FluFF pour la surveillance ex vivo de la lyse des caillots

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	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

Formation et étiquetage des caillots Il a été démontré que la boucle de Chandler fournit un moyen facile et efficace de générer de manière reproductible des caillots qui imitent les thrombus16 in vivo. Des paramètres de réglage précis tels que la taille du tube, les vitesses de rotation, le diamètre du tambour et le temps de coagulation permettent la génération rapide de caillots dans différentes conditions de cisaillement qui peuvent capturer des caract...

Les maladies découlant fondamentalement d’étiologies thrombo-emboliques représentent une source majeure de morbidité et de mortalité dans la société actuelle. Les manifestations de la pathogenèse thrombo-embolique comprennent, sans s’y limiter, les infarctus du myocarde, les accidents vasculaires cérébraux ischémiques, les thromboses veineuses profondes et les embolies pulmonaires1. Une énorme quantité de recherches en cours, couvrant plusieurs disciplines, tourne autour de la mise au point de méthodes sûres et efficaces pour traiter la thrombose pathogène. Les variations dans les manifestations artérielles et veineuses de la thrombose et les différentes localisations anatomiques ont entraîné le développement de différentes approches de traitement. Cependant, le traitement aigu repose généralement sur l’utilisation d’une thrombolyse pharmacologique via des activateurs du plasminogène avec un potentiel de thrombectomie mécanique dans certaines circonstances cliniques2.
Le développement de nouvelles stratégies de traitement pharmacologique repose fondamentalement sur des modèles animaux in vivo et des modèles de digestion in vitro pour les essais précliniques 3,4. Les modèles in vivo bénéficient naturellement de leur capacité à capturer l’interaction complexe de divers paramètres physiologiques sur l’efficacité du traitement, y compris la clairance des agents pharmaceutiques ainsi que les interactions cellulaires avec les médicaments. Cependant, cette même complexité rend souvent ces modèles très coûteux et pose des problèmes supplémentaires lorsqu’il s’agit d’isoler la pharmacodynamique/cinétique sous-jacente chez les animaux qui diffère considérablement de la physiologie humaine. Le développement de modèles in vitro a contribué à faciliter un cadre de test distillé dans lequel le développement et le criblage de médicaments peuvent être effectués, mais manque souvent de la fidélité nécessaire pour récapituler l’état pathologique étudié.
Les protocoles in vitro courants pour tester de nouveaux thrombolytiques reposent sur l’utilisation de caillots formés et lysés dans des conditions statiques où la masse résiduelle du caillot sert de critère d’évaluation principal 5,6. Malheureusement, ces techniques ne tiennent pas compte des aspects mécaniques de la lyse des caillots, tels que l’écoulement turbulent et les chutes de pression trans-thrombus qui peuvent modifier considérablement la pharmacodynamique des médicaments testés. De plus, les caillots formés dans des conditions statiques contiennent une microarchitecture qui diffère des caillots physiologiques. Il a été démontré de manière reproductible que la présence d’un cisaillement lors de la formation d’un caillot a un impact sur les caractéristiques du caillot résultant, telles que l’activation plaquettaire et la réticulation de la fibrine. Les caillots produits sous l’effet d’un écoulement de cisaillement présentent une hétérogénéité complexe de la pointe à la queue qui est absente dans les caillots formés statiquement 7,8. De tels écarts par rapport à l’architecture physiologique du caillot peuvent avoir un impact important sur la caractérisation du développement de médicaments, y compris la pénétration du médicament dans un thrombus et l’efficacité de la lyse ultérieure9.
Pour remédier à certaines de ces limitations associées à l’utilisation de modèles statiques de coagulation/lyse de caillot, l’adoption de la boucle de Chandler pour la formation de caillots et la lyse de caillots en présence de cisaillement a entraîné une résurgence10. Bien que de tels systèmes permettent une meilleure représentation de la dynamique de l’écoulement et génèrent des caillots avec une architecture plus pertinente sur le plan physiologique par rapport aux tests relativement statiques, leurs conditions d’écoulement simplifiées représentent tout de même un écart par rapport aux conditions physiologiques. Enfin, des approches microfluidiques ont également été entreprises en raison de leur facilité d’imagerie et de leurs modèles d’écoulement uniformes ; Cependant, ils restent une élimination significative des conditions physiologiques attendues dans les gros vaisseaux principalement affectés dans la plupart des troubles thrombo-emboliques cliniquement pertinents11,12.
En gardant à l’esprit la discussion ci-dessus, nous avons développé un modèle de thrombolyse in vitro haute fidélité pour le dépistage préclinique des médicaments thrombolytiques. Le modèle vise à s’attaquer à certains des pièges actuels décrits ci-dessus dans le domaine du dépistage des nouvelles thérapies thrombolytiques et a été validé pour sa reproductibilité et sa sensibilité à des concentrations variables d’activateur tissulaire du plasminogène (tPA). Le système décrit dans le présent document offre des écoulements de cisaillement physiologiques à l’aide d’une pompe péristaltique, d’un amortisseur de pression, d’un réservoir chauffé, de deux capteurs de pression, d’un fluorimètre en ligne et d’un analogue de caillot formé par cisaillement en boucle de Chandler marqué par fluorescence pour faciliter le suivi en temps réel de la fibrinolyse13. Dans l’ensemble, le système global s’appelle le test de fibrinolyse à flux fluorométrique en temps réel (RT-FluFF Assay)14 et ce manuscrit aborde les subtilités de la mise en place et de l’exécution réussies des tests dans ce modèle de thrombolyse in vitro haute fidélité.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

La thromboembolie et les complications qui y sont associées sont l’une des principales causes de morbidité et de mortalité dans le monde, et divers tests ont été mis au point pour tester l’efficacité des médicaments thrombolytiques in vitro et in vivo. Il existe une demande croissante de modèles de caillots in vitro plus pertinents sur le plan physiologique pour le développement de médicaments en raison de la complexité et du coût associés aux modèles animaux, en plus de leur manque souvent de translatibilité à la physiologie humaine. Le débit, la pression et le taux de cisaillement sont des caractéristiques importantes du système circulatoire, les caillots qui se forment sous l’écoulement présentant des caractéristiques de morphologie et de digestion différentes de celles des caillots formés statiquement. Ces facteurs sont souvent non représentés dans les tests conventionnels de digestion par caillot in vitro , ce qui peut avoir des implications pharmacologiques qui ont un impact sur les taux de réussite de la traduction des médicaments.
Le testd’ibrinolyse orométrique F lowing FR eal-T ime Flu(RT-FluFF) a été développé en tant que plate-forme de test de thrombolyse haute fidélité qui utilise des caillots marqués par fluorescence formés sous écoulement de cisaillement, qui sont ensuite digérés à l’aide de plasma circulant en présence ou en l’absence d’agents pharmaceutiques fibrinolytiques. La modification des débits des étapes de formation et de digestion des caillots permet au système d’imiter les conditions artérielles, pulmonaires et veineuses dans des configurations expérimentales très diverses. Les mesures peuvent être prises en continu à l’aide d’un fluorimètre en ligne ou en prenant des points temporels discrets, ainsi qu’une mesure conventionnelle de la masse du caillot final. Le test RT-FluFF est un système flexible qui permet le suivi en temps réel de la digestion des caillots dans des conditions d’écoulement qui représentent plus précisément les conditions physiologiques in vivo tout en conservant le contrôle et la reproductibilité d’un système de test in vitro.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser les tests thrombolytiques en intégrant la dynamique des écoulements dans les modèles in vitro

Suivi de la fibrinolyse de caillots de sang total formés en boucle de Chandler sous flux de cisaillement dans un modèle de thrombolyse in vitro

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

Formation de caillot en boucle de Chandler Lors de la formation des caillots, nous avons généralement visé des quadruples pour nous assurer que s’il existait des valeurs aberrantes de caillots (basées sur la morphologie et la masse macroscopiques), nous avions toujours la capacité d’effectuer des tests de thrombolyse en triple. En supposant des conditions de charge optimales, les caillots devraient tous être assez uniformes en longueur (~3,3 cm), en poids (~100 mg) et en apparence, comme le ...

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Les tests de thrombolyse in vitro ont souvent eu du mal à reproduire les conditions in vivo, que ce soit dans le thrombus modèle digéré ou dans l’environnement dans lequel la thrombolyse se produit. Dans cet article, nous explorons comment le couplage de la boucle de Chandler et du test de fibrinolyse par écoulement fluorométrique en temps réel (RT-FluFF) est utilisé pour la surveillance de la lyse des caillots haute fidélité, ex-vivo.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

La thrombose est associée à de nombreuses conditions médicales et les traitements actuels risquent de provoquer des saignements graves. Le flux circulatoire a un impact significatif sur la structure des caillots sanguins. L’intégration du flux dans les modèles in vitro peut améliorer leur pertinence physiologique, ce qui améliorera la sélection de meilleurs candidats pour les tests in vivo.Les tests pour l’étude des fibrinolytiques utilisent principalement des caillots statiques ou des systèmes microfluidiques pour évaluer des propriétés telles que le temps de lyse, la structure du caillot ou la viscoélasticité. Les tests de lyse statique des caillots reposent généralement sur des mesures spectrophotométriques ou la détermination de la masse du caillot comme critères d’évaluation de l’efficacité de la fibrinolyse. Les tests thrombolytiques actuels utilisent des caillots formés statiquement, qui diffèrent structurellement de ceux formés dans des conditions d’écoulement.Les systèmes microfluidiques prennent en compte la dynamique de l’écoulement, mais leurs échelles plus petites créent une hémodynamique et des structures de caillot uniques. Le test RT-FluFF actuellement développé facilite le suivi de la fibrinolyse en temps réel dans des conditions de flux physiologiques. Cela signifie que nous disposons désormais d’une plate-forme qui permet de contrôler plusieurs paramètres pour imiter les conditions plus proches des modèles d’étude in vivo pour une meilleure traduction lors du criblage de nouveaux thrombolytiques.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.