Name: Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung thrombolytischer Tests durch Integration der Strömungsdynamik in In-vitro-Modellen
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

Die in dieser Veröffentlichung berichtete Forschung wurde vom National Heart, Lung, And Blood Institute der National Institutes of Health unter der Preisnummer R01HL167877 unterstützt. Der Inhalt liegt in der alleinigen Verantwortung der Autoren und gibt nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health wieder.

Alle unten genannten Methoden stehen in Übereinstimmung mit den Protokollen des Institutional Review Board (IRB) und der institutionellen Ethikkommission für die Humanforschung. Alle gesunden Freiwilligen gaben vor der Blutspende eine schriftliche und informierte Einverständniserklärung ab. Zu beachten ist, dass alle Materialien, auf die im Protokoll verwiesen wird, in der Materialtabelle zu finden sind. Während humaner WB und Plasma in diesem Protokoll diskutiert werden, kann die Verwendung von For...

Kombination von Chandler Loop und RT-FluFF für die ex vivo Überwachung der Gerinnsellyse

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	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

Gerinnselbildung und -kennzeichnung Es wurde gezeigt, dass die Chandler-Schleife ein einfaches und effektives Mittel zur reproduzierbaren Erzeugung von Gerinnseln darstellt, die In-vivo-Thromben nachahmen 16. Die Feinabstimmung von Parametern wie Schlauchgröße, Drehzahlen, Trommeldurchmesser und Gerinnungszeit ermöglicht die schnelle Bildung von Gerinnseln unter unterschiedlichen Scherbedingungen, die architektonische Merkmale erfassen können, die bei einer Reihe v...

Krankheiten, die im Wesentlichen auf thromboembolische Ätiologien zurückzuführen sind, stellen in der heutigen Gesellschaft eine Hauptursache für Morbidität und Mortalität dar. Zu den Manifestationen der thromboembolischen Pathogenese gehören unter anderem Myokardinfarkte, ischämische Schlaganfälle, tiefe Venenthrombosen und Lungenembolien1. Ein enormer Teil der laufenden Forschung, die sich über mehrere Disziplinen erstreckt, dreht sich um die Entwicklung sicherer und wirksamer Methoden für den Umgang mit pathogenen Thrombosen. Unterschiedliche arterielle und venöse Manifestationen der Thrombose und unterschiedliche anatomische Lokalisationen haben zur Entwicklung unterschiedlicher Behandlungsansätze geführt. Die Akutbehandlung beruht jedoch im Allgemeinen auf dem Einsatz einer pharmakologischen Thrombolyse über Plasminogenaktivatoren, die unter bestimmten klinischen Umständen eine mechanische Thrombektomie ermöglichenkönnen 2.
Die Entwicklung neuartiger pharmakologischer Behandlungsstrategien stützt sich grundsätzlich sowohl auf In-vivo-Tiermodelle als auch auf In-vitro-Verdauungsmodelle für die präklinische Erprobung 3,4. In-vivo-Modelle profitieren natürlich von ihrer Fähigkeit, das komplexe Zusammenspiel verschiedener physiologischer Parameter auf die Wirksamkeit der Behandlung zu erfassen, einschließlich der Clearance von pharmazeutischen Wirkstoffen sowie zellulärer Wechselwirkungen mit Arzneimitteln. Dieselbe Komplexität macht solche Modelle jedoch oft recht kostspielig und führt zu zusätzlichen Problemen beim Versuch, die zugrunde liegende Pharmakodynamik/Kinetik bei Tieren zu isolieren, die sich erheblich von der menschlichen Physiologie unterscheidet. Die Entwicklung von In-vitro-Modellen hat dazu beigetragen, dass eine destillierte Testumgebung ermöglicht wurde, in der die Entwicklung und das Screening von Arzneimitteln durchgeführt werden können, die jedoch oft nicht die erforderliche Genauigkeit aufweisen, um den untersuchten Krankheitszustand zu rekapitulieren.
Häufig anzutreffende In-vitro-Protokolle zur Erprobung neuartiger Thrombolytika beruhen auf der Verwendung von Gerinnseln, die unter statischen Bedingungen gebildet und lysiert werden, wobei die verbleibende Gerinnselmasse als primärer Endpunkt dient 5,6. Leider berücksichtigen solche Techniken nicht die mechanischen Aspekte der Gerinnsellyse, wie z. B. turbulente Strömung und transthrombusische Druckabfälle, die die Pharmakodynamik von Testmedikamenten erheblich verändern können. Darüber hinaus enthalten Gerinnsel, die unter statischen Bedingungen gebildet werden, eine Mikroarchitektur, die sich von physiologischen Gerinnseln unterscheidet. Es wurde reproduzierbar gezeigt, dass das Vorhandensein von Scherung während der Gerinnselbildung die resultierenden Gerinnseleigenschaften wie Thrombozytenaktivierung und Fibrinvernetzung beeinflusst. Gerinnsel, die unter Scherströmung erzeugt werden, weisen eine komplexe Heterogenität von der Spitze bis zum Ende auf, die bei statisch gebildeten Gerinnseln nicht vorhanden ist 7,8. Solche Abweichungen von der physiologischen Gerinnselarchitektur können sich auf die Charakterisierung wichtiger Arzneimittelentwicklungen auswirken, die die Wirkstoffpenetration innerhalb eines Thrombus und die anschließende Lyseeffizienz umfassen9.
Um einige dieser Einschränkungen im Zusammenhang mit der Verwendung von statischen Gerinnungs-/Gerinnungslysemodellen zu beheben, hat die Einführung der Chandler-Schleife sowohl für die Gerinnselbildung als auch für die Gerinnsellyse in Gegenwart von Scherung ein Wiederaufleben erlebt10. Obwohl solche Systeme eine bessere Darstellung der Strömungsdynamik ermöglichen und Gerinnsel mit einer physiologisch relevanteren Architektur im Vergleich zu relativ statischen Assays erzeugen, stellen ihre vereinfachten Strömungsbedingungen immer noch eine Abweichung von den physiologischen Bedingungen dar. Schließlich wurden auch mikrofluidische Ansätze aufgrund ihrer einfachen Bildgebung und ihrer gleichmäßigen Strömungsmuster verfolgt. Sie bleiben jedoch eine signifikante Entfernung von den physiologischen Bedingungen, die bei den größeren Gefäßen erwartet werden, die hauptsächlich von den meisten klinisch relevanten thromboembolischen Erkrankungen betroffen sind11,12.
Vor dem Hintergrund der obigen Diskussion haben wir ein hochgenaues In-vitro-Thrombolysemodell für das präklinische Thrombolytik-Screening entwickelt. Das Modell zielt darauf ab, einige der oben beschriebenen aktuellen Fallstricke im Bereich des neuartigen thrombolytischen Therapie-Screenings zu beheben und wurde auf Reproduzierbarkeit und Sensitivität bei unterschiedlichen Konzentrationen von Gewebeplasminogenaktivator (tPA) validiert. Das hierin beschriebene System bietet physiologische Scherströmungen unter Verwendung einer Peristaltikpumpe, eines Druckdämpfers, eines beheizten Reservoirs, zweier Drucksensoren, eines Inline-Fluorometers und eines fluoreszenzmarkierten Chandler-Schleifen-schergebildeten Gerinnselanalogons, um die Echtzeitverfolgung der Fibrinolyse13 zu erleichtern. Zusammengenommen wird das Gesamtsystem als Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 bezeichnet, und in diesem Manuskript werden die Feinheiten der erfolgreichen Einrichtung und Durchführung von Assays in diesem hochpräzisen In-vitro-Thrombolysemodell erörtert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

Thromboembolien und damit verbundene Komplikationen sind weltweit eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität, und es wurden verschiedene Assays entwickelt, um die Wirksamkeit thrombolytischer Arzneimittel sowohl in vitro als auch in vivo zu testen. Die Nachfrage nach physiologisch relevanteren In-vitro-Gerinnselmodellen für die Arzneimittelentwicklung steigt aufgrund der Komplexität und der Kosten, die mit Tiermodellen verbunden sind, sowie ihrer oft fehlenden Übertragbarkeit auf die Humanphysiologie. Strömung, Druck und Schergeschwindigkeit sind wichtige Eigenschaften des Kreislaufsystems, wobei Gerinnsel, die unter Fluss gebildet werden, eine andere Morphologie und Verdauungseigenschaften aufweisen als statisch gebildete Gerinnsel. Diese Faktoren sind in herkömmlichen In-vitro-Assays für den Gerinnselverdau oft nicht vertreten, was pharmakologische Implikationen haben kann, die sich auf die translationalen Erfolgsraten von Arzneimitteln auswirken.
Der Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) Assay wurde als High-Fidelity-Thrombolyse-Testplattform entwickelt, bei der fluoreszenzmarkierte Gerinnsel verwendet werden, die unter Scherfluss gebildet und dann mit zirkulierendem Plasma in Gegenwart oder Abwesenheit von fibrinolytischen pharmazeutischen Wirkstoffen verdaut werden. Die Modifikation der Flussraten sowohl der Gerinnselbildung als auch der Gerinnselverdauungsschritte ermöglicht es dem System, arterielle, pulmonale und venöse Erkrankungen in sehr unterschiedlichen Versuchsanordnungen zu imitieren. Die Messungen können kontinuierlich mit einem Inline-Fluorometer oder durch Messung diskreter Zeitpunkte sowie mit einer herkömmlichen Endpunkt-Gerinnselmassenmessung durchgeführt werden. Der RT-FluFF-Assay ist ein flexibles System, das die Echtzeit-Verfolgung des Gerinnselverdaus unter Flussbedingungen ermöglicht, die die physiologischen Bedingungen in vivo genauer darstellen und gleichzeitig die Kontrolle und Reproduzierbarkeit eines In-vitro-Testsystems beibehalten.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

Autor im Rampenlicht: Weiterentwicklung thrombolytischer Tests durch Integration der Strömungsdynamik in In-vitro-Modellen

Verfolgung der Fibrinolyse von Chandler-Schleifen-gebildeten Vollblutgerinnseln unter Scherströmung in einem In-vitro-Thrombolysemodell

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

Bildung von Chandler-Schlingengerinnseln Bei der Bildung von Gerinnseln strebten wir im Allgemeinen Vierfachpräparate an, um sicherzustellen, dass wir auch im Falle von Gerinnselausreißern (basierend auf der Bruttomorphologie und -masse) in der Lage waren, dreifache Thrombolysetests durchzuführen. Unter der Annahme optimaler Belastungsbedingungen sollten alle Gerinnsel in Länge (~3,3 cm), Gewicht (~100 mg) und Aussehen ziemlich einheitlich sein, wie in Abbildung 3 dar...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

In-vitro-Thrombolyse-Assays haben oft Schwierigkeiten, In-vivo-Bedingungen zu replizieren, sei es im Modellthrombus, der verdaut wird, oder in der Umgebung, in der die Thrombolyse stattfindet. Im Folgenden untersuchen wir, wie die Kopplung des Chandler-Loops und des Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) für eine hochgenaue Ex-vivo-Überwachung der Gerinnsellyse verwendet wird.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Thrombosen werden mit zahlreichen Erkrankungen in Verbindung gebracht, und die derzeitigen Behandlungen bergen das Risiko schwerer Blutungen. Der Fluss des Kreislaufsystems hat einen erheblichen Einfluss auf die Struktur der Blutgerinnsel. Die Einbeziehung der Strömung in In-vitro-Modelle kann deren physiologische Relevanz verbessern und die Auswahl besserer Kandidaten für In-vivo-Tests verbessern.Die Assays für die Untersuchung von Fibrinolytika verwenden überwiegend statische Gerinnsel- oder mikrofluidische Systeme, um Eigenschaften wie Lysezeit, Gerinnselstruktur oder Viskoelastizität zu beurteilen. Assays zur statischen Gerinnsellyse stützen sich in der Regel auf spektrophotometrische Messungen oder die Bestimmung der Gerinnselmasse als Endpunkte zur Bewertung der Fibrinolyseeffizienz. Bei den derzeitigen thrombolytischen Tests werden statisch gebildete Gerinnsel verwendet, die sich strukturell von denen unterscheiden, die unter Strömungsbedingungen gebildet werden.Mikrofluidische Systeme berücksichtigen die Strömungsdynamik, aber ihre kleineren Skalen erzeugen eine einzigartige Hämodynamik und Gerinnselstrukturen. Der derzeit entwickelte RT-FluFF-Assay erleichtert die Überwachung der Fibrinolyse in Echtzeit unter physiologischen Flussbedingungen. Das bedeutet, dass wir jetzt über eine Plattform verfügen, die die Kontrolle über mehrere Parameter ermöglicht, um Bedingungen nachzuahmen, die näher an In-vivo-Studienmodellen liegen, um eine bessere Translation beim Screening neuer Thrombolytika zu ermöglichen.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.