Name: מחבר זרקור: קידום בדיקות טרומבוליטיות על ידי שילוב דינמיקת זרימה במודלים חוץ גופיים
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

המחקר שדווח בפרסום זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר R01HL167877. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

כל השיטות המוזכרות להלן הן בהתאם לפרוטוקולים של ועדת הביקורת המוסדית (IRB) וועדת האתיקה המוסדית למחקר אנושי. כל המתנדבים הבריאים נתנו הסכמה בכתב ומדעת לפני תרומת הדם. שימו לב, ניתן למצוא את כל החומרים המוזכרים בפרוטוקול בטבלת החומרים. בעוד ש-WB ופלזמה אנושיים נידונים לאורך פרוטוקול ...

שילוב של לולאת צ'נדלר ו-RT-FluFF לניטור ליזה של קריש דם Ex Vivo

<ol>
	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

היווצרות קריש דם ותיוג לולאת צ'נדלר הוכחה כמספקת אמצעי קל ויעיל ליצירת קרישי דם המחקים תרומבי 16 in-vivo. פרמטרים של כוונון עדין כגון גודל צינורות, מהירויות סיבוב, קוטר תוף וזמן קרישה מאפשרים יצירה מהירה של קרישי דם בתנאי גזירה שונים שיכולים ללכוד תכונות אדריכליות ...

מחלות הנובעות ביסודן מאטיולוגיות טרומבו-אמבוליות מהוות מקור עיקרי לתחלואה ולתמותה בחברה של ימינו. ביטויים של פתוגנזה טרומבו-אמבולית כוללים, אך אינם מוגבלים לאוטם שריר הלב, שבץ איסכמי, פקקת ורידים עמוקים ואמבולי ריאתי1. כמות עצומה של מחקר מתמשך, המתפרש על פני דיסציפלינות רבות, סובבת סביב פיתוח שיטות בטוחות ויעילות להתמודדות עם פקקת פתוגנית. שינויים בביטויים עורקיים וורידיים של פקקת ומיקומים אנטומיים משתנים הביאו לפיתוח גישות טיפול שונות. עם זאת, טיפול אקוטי מסתמך בדרך כלל על שימוש תרומבוליזה פרמקולוגית באמצעות מפעילי פלסמינוגן עם פוטנציאל לכריתת תרומבקטומיה מכנית בנסיבות קליניות מסוימות2.
הפיתוח של אסטרטגיות טיפול פרמקולוגיות חדשניות מסתמך ביסודו הן על מודלים של בעלי חיים in-vivo והן על מודלים של עיכול במבחנה לבדיקות פרה-קליניות 3,4. מודלים של In-vivo נהנים באופן טבעי מיכולתם ללכוד את האינטראקציה המורכבת של פרמטרים פיזיולוגיים שונים על יעילות הטיפול הכוללים פינוי של חומרים פרמצבטיים כמו גם אינטראקציות תאיות עם תרופות. עם זאת, אותה מורכבות הופכת לעתים קרובות מודלים כאלה ליקרים למדי ומציגה בעיות נוספות כאשר מנסים לבודד את הפרמקו-דינמיקה/קינטיקה הבסיסית בבעלי חיים השונים באופן משמעותי מהפיזיולוגיה האנושית. הפיתוח של מודלים במבחנה סייע בכך שהקל על סביבת בדיקות מזוקקות שבה ניתן לבצע פיתוח תרופות ובדיקות סקר, אך לעתים קרובות חסרה את הנאמנות הדרושה כדי לשחזר את מצב המחלה הנחקר.
פרוטוקולים במבחנה נפוצים לבדיקת טרומבוליטיקה חדשנית מסתמכים על ניצול קרישי דם שנוצרו וליזה בתנאים סטטיים שבהם מסת הקריש השיורית משמשת כנקודת הקצה העיקרית 5,6. למרבה הצער, טכניקות כאלה אינן מסתיירות בהיבטים המכניים של ליזה קרישה כגון זרימה טורבולנטית וטיפות לחץ טרנס-טרומבוס שיכולות לשנות באופן משמעותי את הפרמקודינמיקה של תרופות בדיקה. בנוסף, קרישי דם הנוצרים בתנאים סטטיים מכילים מיקרו-ארכיטקטורה השונה מקרישי דם פיזיולוגיים. נוכחות של גזירה במהלך היווצרות קריש הוכחה כמשפיעה על מאפייני הקריש המתקבלים כגון הפעלת טסיות דם וקישור פיברין. קרישי דם המיוצרים תחת זרימת גזירה מפגינים הטרוגניות מורכבת מקצה לזנב הנעדרת בקרישי דם שנוצרו סטטית 7,8. סטיות כאלה מארכיטקטורת הקריש הפיזיולוגי עשויות להשפיע על אפיון פיתוח תרופות חשוב הכולל חדירת תרופה בתוך פקקת ויעילות ליזה לאחר מכן9.
כדי להתמודד עם חלק מהמגבלות הללו הקשורות לשימוש במודלים סטטיים של קרישה / קריש דם, אימוץ לולאת צ'נדלר הן ליצירת קריש והן לליזה של קריש דם בנוכחות גזירה ראה התעוררות מחודשת10. למרות שמערכות כאלה מאפשרות ייצוג טוב יותר של דינמיקת זרימה ומייצרות קרישי דם עם ארכיטקטורה רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית בהשוואה לבדיקות סטטיות יחסית, תנאי הזרימה הפשוטים שלהן עדיין מייצגים סטייה מהתנאים הפיזיולוגיים. לבסוף, גישות מיקרופלואידיות ננקטו גם בשל קלות ההדמיה ודפוסי הזרימה האחידים שלהן; עם זאת, הם עדיין מהווים הסרה משמעותית מהתנאים הפיזיולוגיים הצפויים בתוך כלי הדם הגדולים יותר המושפעים בעיקר ברוב הפרעות טרומבו-אמבוליות רלוונטיות מבחינה קלינית11,12.
בהתחשב בדיון לעיל, פיתחנו מודל תרומבוליזה במבחנה באיכות גבוהה לבדיקת תרופות תרומבוליטיות פרה-קליניות. המודל נועד לטפל בכמה מהמלכודות הנוכחיות שפורטו לעיל בתחום הסינון החדשני לטיפול תרומבוליטי ואומת לשחזור ורגישות בריכוזים משתנים של מפעיל פלסמינוגן רקמתי (tPA). המערכת המתוארת כאן מציעה זרמי גזירה פיזיולוגיים באמצעות משאבה פריסטלטית, מדכאת לחץ, מאגר מחומם, שני חיישני לחץ, פלואורומטר מובנה ואנלוג צ'נדלרי בצורת קריש גזירה עם תווית פלואורסצנטית כדי להקל על מעקב בזמן אמת אחר פיברינוליזה13. יחד, המערכת הכוללת נקראת Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 וכתב יד זה ידון במורכבויות של הקמה והפעלה מוצלחת של בדיקות במודל טרומבוליזה חוץ-גופית זה באיכות גבוהה.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

טרומבואמבוליזם וסיבוכים נלווים הם גורם מוביל לתחלואה ותמותה ברחבי העולם ובדיקות שונות פותחו כדי לבדוק את יעילות התרופה הטרומבוליטית הן במבחנה והן in vivo. יש ביקוש גובר למודלים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית של קריש דם במבחנה לפיתוח תרופות בשל המורכבות והעלות הכרוכות במודלים של בעלי חיים, בנוסף לחוסר התרגום שלהם לעתים קרובות לפיזיולוגיה האנושית. זרימה, לחץ וקצב גזירה הם מאפיינים חשובים של מערכת הדם, כאשר קרישי דם הנוצרים תחת זרימה מציגים מורפולוגיה ומאפייני עיכול שונים מאשר קרישי דם שנוצרו באופן סטטי. גורמים אלה לעתים קרובות אינם מיוצגים בבדיקות קונבנציונליות של עיכול קרישי דם במבחנה , אשר יכולות להיות להן השלכות פרמקולוגיות המשפיעות על שיעורי ההצלחה של תרופות.
בדיקת Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) פותחה כפלטפורמת בדיקת פקקת באיכות גבוהה המשתמשת בקרישי דם מתויגים פלואורסצנטית הנוצרים תחת זרימת גזירה, אשר מתעכלים לאחר מכן באמצעות פלזמה במחזור בנוכחות או היעדר חומרים פרמצבטיים פיברינוליטיים. שינוי קצבי הזרימה הן של שלבי היווצרות קרישי הדם והן של שלבי עיכול הקריש מאפשר למערכת לחקות מצבים עורקיים, ריאתיים וורידיים על פני מערכי ניסוי מגוונים ביותר. ניתן לבצע מדידות ברציפות באמצעות פלואורומטר בתוך הקו או על ידי לקיחת נקודות זמן בדידות, כמו גם מדידת מסת קריש נקודת קצה קונבנציונלית. בדיקת RT-FluFF היא מערכת גמישה המאפשרת מעקב בזמן אמת אחר עיכול קריש דם בתנאי זרימה המייצגים בצורה מדויקת יותר תנאים פיזיולוגיים in-vivo תוך שמירה על הבקרה והשחזור של מערכת בדיקות במבחנה.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

מחבר זרקור: קידום בדיקות טרומבוליטיות על ידי שילוב דינמיקת זרימה במודלים חוץ גופיים

מעקב אחר פיברינוליזה של קרישי דם שלמים שנוצרו בלולאה של צ'נדלר תחת זרימת גזירה במודל פקקת חוץ גופית

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

היווצרות קריש לולאת צ'נדלר ביצירת קרישי דם, כיוונו בדרך כלל למרובעים כדי להבטיח שאם קיימים חריגים כלשהם של קריש דם (בהתבסס על מורפולוגיה גסה ומסה), עדיין תהיה לנו היכולת להריץ בדיקות תרומבוליזה משולשות. בהנחה של תנאי העמסה אופטימליים, קרישי הדם צריכים להיות אחידים למדי באורך (~3.3 ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

בדיקות טרומבוליזה חוץ-גופית נאבקו לעתים קרובות לשכפל תנאי in-vivo בין אם בפקקת המודל המעוכלת או בסביבה שבה מתרחשת פקקת. במאמר זה, אנו חוקרים כיצד צימוד לולאת צ'נדלר ובדיקת פיברינוליזה פלואורומטרית זורמת בזמן אמת (RT-FluFF) משמש לניטור ליזה של קרישי דם באיכות גבוהה, ex-vivo.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

פקקת קשורה למצבים רפואיים רבים והטיפולים הנוכחיים מסתכנים בדימום חמור. זרימת מערכת הדם משפיעה באופן משמעותי על מבנה קרישי הדם. שילוב זרימה במודלים במבחנה עשוי לשפר את הרלוונטיות הפיזיולוגית שלהם, ולשפר את הבחירה של מועמדים טובים יותר לבדיקות in-vivo.הבדיקות לחקר פיברינוליטיקה משתמשות בעיקר בקריש סטטי או במערכות מיקרופלואידיות כדי להעריך תכונות כגון זמן ליזיס, מבנה קריש או צמיגות. מבחני קריש דם סטטיים מסתמכים בדרך כלל על מדידות ספקטרופוטומטריות או קביעת מסת קריש כנקודות קצה להערכת יעילות הפיברינוליזה. בדיקות טרומבוליטיות נוכחיות משתמשות בקרישי דם שנוצרו באופן סטטי, השונים מבחינה מבנית מאלה שנוצרו בתנאי זרימה.מערכות מיקרופלואידיות מתחשבות בדינמיקת זרימה, אך הקשקשים הקטנים יותר שלהן יוצרים המודינמיקה ייחודית ומבני קרישי דם. בדיקת RT-FluFF שפותחה כיום מספקת קלות בניטור פיברינוליזה בזמן אמת בתנאי זרימה פיזיולוגיים. משמעות הדבר היא שיש לנו כעת פלטפורמה המאפשרת שליטה על פרמטרים מרובים כדי לחקות תנאים קרובים יותר למודלים של מחקר in-vivo לתרגום טוב יותר בעת סינון תרומבוליטיקה חדשה.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.