Name: 저자 스포트라이트: In Vitro 모델에 유동 역학을 통합하여 혈전용해 검사의 발전
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 심장, 폐 및 혈액 연구소(National Heart, Lung, and Blood Institute)의 지원을 받아 수상 번호 R01HL167877에 따라 수행되었습니다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 National Institutes of Health의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다.

아래에 언급된 모든 방법은 IRB(Institutional Review Board) 프로토콜 및 기관 인간 연구 윤리 위원회(Institutional Human Research Ethics Committee)를 따릅니다. 모든 건강한 자원봉사자는 헌혈 전에 서면 동의서를 제출했습니다. 참고로, 프로토콜 내에서 참조되는 모든 자료는 재료 목차에서 찾을 수 있습니다. 인간 WB 및 혈장이 이 프로토콜 전반에 걸쳐 논의되는 동안, 연구 동물 혈액 및 인자 고갈 혈?...

Chandler Loop와 RT-FluFF를 결합하여 Ex vivo 응고 용해 모니터링

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	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

응고 형성 및 라벨링 챈들러 루프(Chandler loop)는 생체 내 혈전16을 모방한 혈전을 재현성 있게 생성하는 쉽고 효과적인 수단을 제공하는 것으로 입증되었습니다. 튜빙 크기, 회전 속도, 드럼 직경 및 응고 시간과 같은 매개변수를 미세 조정하면 다양한 전단 조건에서 혈전을 빠르게 생성할 수 있으며, 동맥 및 정맥 소스를 모두 모방하는 다양한 혈전에서 높이 ...

근본적으로 혈전색전증 병인에서 비롯된 질병은 현대 사회에서 이환율과 사망률의 주요 원인입니다. 혈전색전증의 발병기전으로는 심근경색, 허혈성 뇌졸중, 심부 정맥 혈전증, 폐색전증 등이 있으나 이에 국한되지 않는다1. 병원성 혈전증을 치료하기 위한 안전하고 효과적인 방법의 개발을 중심으로 여러 분야에 걸쳐 엄청난 양의 지속적인 연구가 진행되고 있습니다. 혈전증의 동맥 및 정맥 증상의 변화와 다양한 해부학적 위치로 인해 다양한 치료 접근법이 개발되었습니다. 그러나 급성 치료는 일반적으로 플라스미노겐 활성제를 통한 약물적 혈전용해술에 의존하며, 특정 임상 상황에서 기계적 혈전절제술을 시행할 수 있다2.
새로운 약리학적 치료 전략의 개발은 근본적으로 전임상 시험을 위한 체내 동물 모델과 체외 소화 모델 모두에 의존합니다 3,4. 생체 내 모델은 의약품의 제거뿐만 아니라 약물과의 세포 상호 작용을 포함하여 치료 효능에 대한 다양한 생리학적 매개변수의 복잡한 상호 작용을 포착할 수 있는 능력의 이점을 자연스럽게 누릴 수 있습니다. 그러나 이와 동일한 복잡성으로 인해 이러한 모델은 종종 상당한 비용이 들고 인간의 생리학과 크게 다른 동물에서 근본적인 약력역학/동역학을 분리하려고 할 때 추가적인 문제가 발생합니다. 체외 모델의 개발은 약물 개발 및 스크리닝을 수행할 수 있는 증류 테스트 환경을 촉진하는 데 도움이 되었지만 연구 중인 질병 상태를 재현하는 데 필요한 충실도가 부족한 경우가 많습니다.
새로운 혈전용해제를 테스트하기 위해 일반적으로 발견되는 시험관 내 프로토콜은 잔류 혈전 질량이 1차 종점 역할을 하는 정적 조건에서 형성되고 용해된 혈전의 활용에 의존합니다 5,6. 불행히도, 이러한 기술은 시험 약물의 약력학을 크게 변화시킬 수 있는 난류 및 트랜스 혈전 압력 강하와 같은 혈전 용해의 기계적 측면을 설명하지 못합니다. 또한, 정적 조건에서 형성된 혈전은 생리적 혈전과 다른 미세구조를 포함하고 있습니다. 혈전 형성 중 전단의 존재는 혈소판 활성화 및 피브린 교차결합과 같은 결과적인 응고 특성에 영향을 미치는 것으로 재현 가능한 것으로 나타났습니다. 전단 흐름 하에서 생성되는 응고는 정적으로 형성된 응고 7,8에는 없는 팁에서 꼬리까지 복잡한 이질성을 나타냅니다. 이러한 생리적 응고 구조로부터의 이탈은 혈전 내 약물 침투 및 후속 용해 효율을 포함하는 중요한 약물 개발 특성 분석에 영향을 미칠 수 있다9.
정적 응고/응고-용해 모델의 사용과 관련된 이러한 제한 사항 중 일부를 해결하기 위해, 전단이 있는 상태에서 응고 형성 및 응고 용해 모두에 대해 챈들러 루프(Chandler loop)를 채택하면서10이 부활했다. 이러한 시스템은 유동 역학을 더 잘 표현하고 상대적으로 정적인 분석에 비해 생리학적으로 더 관련성이 높은 구조를 가진 응고를 생성할 수 있지만, 단순화된 유동 조건은 여전히 생리학적 조건과의 편차를 나타냅니다. 마지막으로, microfluidic 접근은 또한 화상 진찰의 그들의 용이함 및 획일한 교류 본 때문에 착수되었습니다; 그러나, 이는 임상적으로 가장 관련성이 높은 혈전색전증 질환에서 주로 영향을 받는 더 큰 혈관 내에서 예상되는 생리적 조건으로부터 상당한 제거로 남아 있다11,12.
위의 논의를 염두에 두고 우리는 전임상 혈전용해제 약물 스크리닝을 위한 충실도가 높은 체외 혈전용해 모델을 개발했습니다. 이 모델은 새로운 혈전용해 요법 스크리닝 영역에서 위에서 자세히 설명한 현재의 일부 위험을 해결하는 것을 목표로 하며 다양한 농도의 조직 플라스미노겐 활성제(tPA)에서 재현성 및 민감도에 대해 검증되었습니다. 본 명세서에 기술된 시스템은 연동 펌프, 압력 댐퍼, 가열 저장소, 2개의 압력 센서, 인라인 형광측정기, 및 형광 표지된 챈들러 루프 전단 성형 응고 아날로그를 활용하여 생리학적 전단 흐름을 제공하여 섬유소 용해증의 실시간 추적을 용이하게 한다13. 종합하면, 전체 시스템을 RT-FluFF Assay(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)14 라고 하며, 이 원고에서는 이 고충실도 체 외 혈전용해 모델에서 어세이를 성공적으로 설정하고 실행하는 복잡성에 대해 설명합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

혈전색전증 및 관련 합병증은 전 세계적으로 이환율 및 사망률의 주요 원인이며, in vitro 및 in vivo 모두에서 혈전용해제 약물 효과를 테스트하기 위해 다양한 분석법이 개발되었습니다. 인간 생리학으로의 번역성이 부족한 경우가 많을 뿐만 아니라 동물 모델과 관련된 복잡성과 비용으로 인해 약물 개발을 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 체외 혈전 모델에 대한 수요가 증가하고 있습니다. 유량, 압력 및 전단 속도는 순환계의 중요한 특성이며, 흐름에 따라 형성된 응고는 정적으로 형성된 혈전과 다른 형태 및 소화 특성을 나타냅니다. 이러한 요인은 기존의 체외 혈전 분해 분석에서는 나타나지 않는 경우가 많으며, 이는 약물 번역 성공률에 영향을 미치는 약리학적 영향을 미칠 수 있습니다.
RT-FluFF(Real-T ime Flu Fluorometric Flowing Fibrinolysis) 분석은 전단 흐름 하에서 형성된 형광 태그 응고를 사용하는 고충실도 혈전 용해 검사 플랫폼으로 개발되었으며, 이 혈전은 섬유소 용해제의 유무에 관계없이 순환 플라즈마를 사용하여 분해됩니다. 혈전 형성 및 혈전 소화 단계의 유속을 수정하면 시스템이 매우 다양한 실험 설정에서 동맥, 폐 및 정맥 상태를 모방할 수 있습니다. 측정은 인라인 형광측정기를 사용하거나 이산 시점을 사용하여 연속적으로 수행할 수 있으며, 기존의 종말점 응고 질량 측정도 수행할 수 있습니다. RT-FluFF assay는 체외 검사 시스템의 제어 및 재현성을 유지하면서 생체 내 생리학적 조건을 보다 정확하게 나타내는 유동 조건에서 혈전 분해를 실시간으로 추적할 수 있는 유연한 시스템입니다.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

저자 스포트라이트: In Vitro 모델에 유동 역학을 통합하여 혈전용해 검사의 발전

체외 혈전용해 모델에서 전단 흐름에 따른 Chandler Loop-Formed 전혈의 Fibrinolysis 추적

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

챈들러 루프 응고 형성 혈전을 형성할 때, 우리는 일반적으로 혈전 이상치(총 형태 및 질량 기반)가 존재하는 경우에도 삼중 혈전용해 분석을 실행할 수 있는 능력을 보장하기 위해 4중을 목표로 했습니다. 최적의 로딩 조건을 가정할 때, 혈전은 그림 3과 같이 길이(~3.3cm), 무게(~100mg) 및 외관이 모두 균일해야 합니다. FITC-Fg를 사용할 때, 우리는 또한 응고 내 불?...

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체외 혈전용해 분석은 소화되는 모델 혈전이나 혈전용해가 발생하는 환경에서 생체 내 조건을 복제하는 데 어려움을 겪는 경우가 많습니다. 여기에서는 챈들러 루프와 RT-FluFF(Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay)를 결합하여 고충실도, 생체 외 혈전 용해 모니터링을 수행하는 방법을 살펴봅니다.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

혈전증은 수많은 의학적 상태와 관련이 있으며 현재 치료법은 심각한 출혈의 위험이 있습니다. 순환계 흐름은 혈전 구조에 큰 영향을 미칩니다. 체외 모델에 플로우를 통합하면 생리학적 관련성이 향상되어 생체 내 테스트를 위한 더 나은 후보 물질의 선택이 향상될 수 있습니다.섬유소 용해제 연구를 위한 분석은 주로 정적 응고 또는 미세유체 시스템을 사용하여 용해 시간, 응고 구조 또는 점탄성과 같은 특성을 평가합니다. 정적 응고 용해 분석은 일반적으로 섬유소 용해 효율을 평가하기 위한 종점으로 분광광도계 측정 또는 응고 질량 측정에 의존합니다. 현재의 혈전용해 검사는 정적으로 형성된 혈전을 사용하는데, 이는 유동 조건에서 형성된 혈전과 구조적으로 다릅니다.미세유체 시스템은 유동 역학을 고려하지만 더 작은 규모는 고유한 혈류역학 및 응고 구조를 생성합니다. 현재 개발된 RT-FluFF 분석법은 생리학적 흐름 조건에서 실시간으로 섬유소 용해를 쉽게 모니터링할 수 있습니다. 이는 이제 새로운 혈전용해제를 스크리닝할 때 더 나은 번역을 위해 생체 내 연구 모델에 더 가까운 조건을 모방하기 위해 여러 매개변수를 제어할 수 있는 플랫폼을 갖게 되었음을 의미합니다.

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.