Name: Forfatter i søkelyset: Fremme trombolytisk testing ved å integrere strømningsdynamikk i in vitro-modeller
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

Forskning rapportert i denne publikasjonen ble støttet av National Heart, Lung, And Blood Institute of the National Institutes of Health under tildelingsnummer R01HL167877. Innholdet er utelukkende forfatternes ansvar og representerer ikke nødvendigvis de offisielle synspunktene til National Institutes of Health.

Alle metodene nevnt nedenfor er i samsvar med protokoller fra Institutional Review Board (IRB) og den institusjonelle komiteen for menneskelig forskning. Alle friske frivillige ga skriftlig og informert samtykke før bloddonasjon. Merk at alt materiale det refereres til i protokollen finnes i materialfortegnelsen. Mens human WB og plasma diskuteres gjennom denne protokollen, kan bruk av forskningsdyreblod og faktorutarmede blodprodukter kjøpes og erstattes.
1. Innsamlin...

Kombinere Chandler Loop og RT-FluFF for Ex Vivo koagulasjonslysovervåking

<ol>
	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

Dannelse og merking av blodpropp Chandler-sløyfen har vist seg å gi en enkel og effektiv måte å reprodusere blodpropper som etterligner in vivo trombi16. Finjusteringsparametere som rørstørrelse, rotasjonshastigheter, trommeldiameter og koagulasjonstid muliggjør rask generering av blodpropper under forskjellige skjærforhold som kan fange opp arkitektoniske trekk verdsatt i en rekke tromber som etterligner både arterielle og venøse kilder. Den ekstra fleksibil...

Sykdommer som i utgangspunktet stammer fra tromboemboliske etiologier utgjør en viktig kilde til sykelighet og dødelighet i dagens samfunn. Manifestasjoner av tromboembolisk patogenese inkluderer, men er ikke begrenset til, hjerteinfarkt, iskemiske slag, dype venetromboser og lungeembolier1. En enorm mengde pågående forskning, som spenner over flere disipliner, dreier seg om utvikling av trygge og effektive metoder for å håndtere patogen trombose. Variasjoner i arterielle og venøse manifestasjoner av trombose og varierende anatomiske lokalisasjoner har resultert i utvikling av ulike behandlingstilnærminger. Imidlertid er akutt behandling generelt avhengig av bruk av farmakologisk trombolyse via plasminogenaktivatorer med potensial for mekanisk trombektomi under visse kliniske omstendigheter2.
Utviklingen av nye farmakologiske behandlingsstrategier er fundamentalt avhengig av både in vivo dyremodeller og in vitro fordøyelsesmodeller for preklinisk testing 3,4. In-vivo-modeller drar naturlig nytte av deres evne til å fange opp den komplekse interaksjonen mellom ulike fysiologiske parametere på behandlingseffektivitet som inkluderer clearance av farmasøytiske midler så vel som cellulære interaksjoner med legemidler. Imidlertid gjør den samme kompleksiteten ofte slike modeller ganske kostbare og introduserer ytterligere problemer når man forsøker å isolere underliggende farmakodynamikk/kinetikk hos dyr som skiller seg vesentlig fra menneskelig fysiologi. Utviklingen av in vitro-modeller har bidratt ved å legge til rette for en destillert testsetting der legemiddelutvikling og screening kan utføres, men som ofte mangler den troskapen som er nødvendig for å rekapitulere sykdomstilstanden som studeres.
Vanlige in vitro-protokoller for testing av nye trombolytika er avhengige av bruk av blodpropper dannet og lysert under statiske forhold der den gjenværende koagulasjonsmassen fungerer som det primære endepunktet 5,6. Dessverre klarer ikke slike teknikker å redegjøre for de mekaniske aspektene ved koagullyse, som turbulent strømning og transtrombetrykkfall som kan endre farmakodynamikken til testmedisiner betydelig. I tillegg inneholder blodpropper dannet under statiske forhold mikroarkitektur som skiller seg fra fysiologiske blodpropper. Tilstedeværelsen av skjær under koagulasjonsdannelse har vist seg å påvirke de resulterende koagulasjonsegenskapene som blodplateaktivering og fibrin-tverrbinding. Blodpropper som produseres under skjærstrøm viser kompleks heterogenitet fra spiss til hale som er fraværende i statisk dannede blodpropper 7,8. Slike avvik fra fysiologisk koagulasjonsarkitektur kan påvirke viktig karakterisering av legemiddelutvikling som inkluderer legemiddelpenetrasjon i en trombe og påfølgende lysiseffektivitet9.
For å løse noen av disse begrensningene knyttet til bruken av statiske koagulasjons-/koagulasjonslysemodeller, har adopsjonen av Chandler-sløyfen for både koagulasjonsdannelse og koagullyselyse i nærvær av skjær sett en gjenoppblomstring10. Selv om slike systemer tillater en bedre representasjon av strømningsdynamikk og genererer blodpropper med mer fysiologisk relevant arkitektur sammenlignet med relativt statiske analyser, representerer deres forenklede strømningsforhold fortsatt et avvik fra fysiologiske forhold. Til slutt har mikrofluidiske tilnærminger også blitt gjennomført på grunn av deres enkle avbildning og ensartede strømningsmønstre; Imidlertid er de fortsatt en betydelig avstand fra de fysiologiske tilstandene som forventes i de større karene som primært er berørt ved de fleste klinisk relevante tromboemboliske lidelser11,12.
Med diskusjonen ovenfor i tankene utviklet vi en high-fidelity, in vitro trombolysemodell for preklinisk trombolytisk legemiddelscreening. Modellen tar sikte på å adressere noen av de nåværende fallgruvene beskrevet ovenfor innen screening av ny trombolytisk terapi og ble validert for reproduserbarhet og følsomhet ved varierende konsentrasjoner av vevsplasminogenaktivator (tPA). Systemet beskrevet her tilbyr fysiologiske skjærstrømmer ved hjelp av en peristaltisk pumpe, en trykkdemper, et oppvarmet reservoar, to trykksensorer, et in-line fluorometer og en fluorescerende merket Chandler sløyfeformet koagulasjonsanalog for å lette sanntidssporing av fibrinolyse13. Til sammen kalles det overordnede systemet Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14, og dette manuskriptet vil diskutere vanskelighetene med å sette opp og kjøre analyser i denne high-fidelity in vitro-trombolysemodellen.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

Tromboembolisme og relaterte komplikasjoner er en ledende årsak til sykelighet og dødelighet over hele verden, og ulike analyser er utviklet for å teste trombolytisk legemiddeleffektivitet både in vitro og in vivo. Det er økende etterspørsel etter mer fysiologisk relevante in vitro-koagulasjonsmodeller for legemiddelutvikling på grunn av kompleksiteten og kostnadene forbundet med dyremodeller i tillegg til deres ofte manglende oversettbarhet til menneskelig fysiologi. Strømning, trykk og skjærhastighet er viktige egenskaper ved sirkulasjonssystemet, med blodpropper som dannes under strømning som viser annen morfologi og fordøyelsesegenskaper enn statisk dannede blodpropper. Disse faktorene er ofte ikke representert i konvensjonelle in vitro-blodproppfordøyelsesanalyser , noe som kan ha farmakologiske implikasjoner som påvirker suksessraten for legemiddeltranslasjon.
Real-T ime Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF)-analysen ble utviklet som en high-fidelity trombolysetestplattform som bruker fluorescerende merkede blodpropper dannet under skjærstrøm, som deretter fordøyes ved bruk av sirkulerende plasma i nærvær eller fravær av fibrinolytiske farmasøytiske midler. Ved å modifisere strømningshastighetene for både blodproppdannelse og blodproppfordøyelsestrinn kan systemet imitere arterielle, lunge- og venøse forhold på tvers av svært forskjellige eksperimentelle oppsett. Målinger kan utføres kontinuerlig ved hjelp av et in-line fluorometer eller ved å ta diskrete tidspunkter, samt en konvensjonell måling av koagulasjonsmasse ved endepunkt. RT-FluFF-analysen er et fleksibelt system som muliggjør sanntidssporing av blodproppfordøyelse under strømningsforhold som mer nøyaktig representerer in vivo fysiologiske forhold, samtidig som kontrollen og reproduserbarheten til et in vitro-testsystem beholdes.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

Forfatter i søkelyset: Fremme trombolytisk testing ved å integrere strømningsdynamikk i in vitro-modeller

Sporing av fibrinolyse av Chandler Loop-dannede fullblodspropper under skjærstrøm i en in vitro trombolysemodell

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

Dannelse av chandler sløyfe koagulasjon Ved dannelse av blodpropper siktet vi generelt mot firedoblinater for å sikre at hvis det eksisterte noen koagulasjonsavvik (basert på grov morfologi og masse), hadde vi fortsatt muligheten til å kjøre tredobbelte trombolyseanalyser. Forutsatt optimale belastningsforhold, bør alle blodpropper være ganske jevne i lengde (~3.3 cm), vekt (~100 mg) og utseende som vist i figur 3. Ved bruk av FITC-Fg hadde vi også som mål å und...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

In vitro-trombolyseanalyser har ofte slitt med å replikere in vivo-tilstander , enten det er i modelltromben som fordøyes eller i miljøet der trombolyse oppstår. Her utforsker vi hvordan kobling av Chandler-sløyfen og Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) brukes til high-fidelity, ex-vivo, koagullyseovervåking.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Trombose er assosiert med en rekke medisinske tilstander, og nåværende behandlinger risikerer alvorlig blødning. Sirkulasjonssystemets strømning påvirker blodproppstrukturen betydelig. Å inkorporere flow i in vitro-modeller kan forbedre deres fysiologiske relevans, og forbedre utvalget av bedre kandidater for in vivo-testing.Analysene for studiet av fibrinolytika bruker hovedsakelig statiske koagulasjons- eller mikrofluidiske systemer for å vurdere egenskaper som lysistid, koagulasjonsstruktur eller viskoelastisitet. Statiske koagullyseanalyser er vanligvis avhengige av spektrofotometriske målinger eller bestemmelse av koagulasjonsmasse som endepunkter for å evaluere fibrinolyseeffektiviteten. Nåværende trombolytisk testing bruker statisk dannede blodpropper, som skiller seg strukturelt fra de som dannes under strømningsforhold.Mikrofluidiske systemer vurderer strømningsdynamikk, men deres mindre skalaer skaper unik hemodynamikk og koagulasjonsstrukturer. Den for tiden utviklede RT-FluFF-analysen gjør det enkelt å overvåke fibrinolyse i sanntid under fysiologiske strømningsforhold. Dette betyr at vi nå har en plattform som tillater kontroll over flere parametere for å etterligne forhold nærmere in vivo-studiemodeller for bedre translasjon ved screening av nye trombolytika.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.