Name: В центре внимания автора: Совершенствование тромболитических испытаний за счет интеграции динамики потока в моделях in vitro
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови Национальных институтов здравоохранения в рамках премии No R01HL167877. Ответственность за содержание лежит исключительно на авторах и не обязательно отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения.

Все методы, упомянутые ниже, соответствуют протоколам институционального наблюдательного совета (IRB) и институционального комитета по этике исследований человека. Все здоровые добровольцы предоставили письменное и информированное согласие до сдачи крови. Следует отметить, что все ма...

Комбинация петли Чандлера и RT-FluFF для мониторинга лизиса сгустков ex vivo

<ol>
	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

Образование сгустков и маркировка Было продемонстрировано, что петля Чандлера является простым и эффективным средством воспроизводимого образования тромбов, имитирующих тромбы 16 in vivo. Точная настройка таких параметров, как размер трубки, скорость вращени...

Заболевания, в основном обусловленные тромбоэмболической этиологией, представляют собой основной источник заболеваемости и смертности в современном обществе. Проявления тромбоэмболического патогенеза включают, но не ограничиваются ими, инфаркт миокарда, ишемические инсульты, тромбозы глубоких вен и легочную эмболию1. Огромное количество текущих исследований, охватывающих несколько дисциплин, вращается вокруг разработки безопасных и эффективных методов борьбы с патогенным тромбозом. Вариации артериальных и венозных проявлений тромбоза и различные анатомические локализации привели к разработке различных подходов к лечению. Тем не менее, острое лечение, как правило, основано на использовании фармакологического тромболизиса с помощью активаторов плазминогена с потенциалом механической тромбэктомии при определенных клинических обстоятельствах2.
Разработка новых стратегий фармакологического лечения в основном опирается как на животные модели in vivo, так и на модели экстракорпорального разложения для доклинических испытаний 3,4. Модели in-vivo, естественно, выигрывают от своей способности фиксировать сложное взаимодействие различных физиологических параметров на эффективность лечения, включая клиренс фармацевтических агентов, а также клеточные взаимодействия с лекарствами. Тем не менее, эта же сложность часто делает такие модели довольно дорогостоящими и создает дополнительные проблемы при попытке изолировать лежащую в основе фармакодинамику/кинетику у животных, которые значительно отличаются от физиологии человека. Разработка моделей in vitro помогла в этом, облегчив условия дистиллированного тестирования, в которых можно проводить разработку лекарств и скрининг, но часто им не хватает точности, необходимой для повторения изучаемого состояния заболевания.
Обычно встречающиеся протоколы in vitro для тестирования новых тромболитиков основаны на использовании тромбов, сформированных и лизированных в статических условиях, при этом остаточная масса тромба служит первичной конечной точкой 5,6. К сожалению, такие методы не учитывают механические аспекты лизиса тромба, такие как турбулентный поток и перепады давления через тромбы, которые могут значительно изменить фармакодинамику испытуемых препаратов. Кроме того, сгустки, образующиеся в статических условиях, содержат микроархитектуру, отличную от физиологических сгустков. Было показано, что присутствие сдвига во время образования тромба воспроизводимо влияет на результирующие характеристики тромба, такие как активация тромбоцитов и сшивание фибрина. Сгустки, образующиеся при сдвиговом потоке, демонстрируют сложную неоднородность от кончика до хвоста, которая отсутствует в статически сформированных сгустках 7,8. Такие отклонения от физиологической архитектуры тромба могут повлиять на важную характеристику разработки лекарственного средства, которая включает проникновение препарата в тромб и последующую эффективность лизиса9.
Для устранения некоторых из этих ограничений, связанных с использованием статических моделей свертывания/лизиса сгустков, наблюдается возрождение петли Чандлера как для образования сгустков, так и для лизиса сгустков в присутствии сдвига. Несмотря на то, что такие системы позволяют лучше представить динамику потока и генерировать сгустки с более физиологически релевантной архитектурой по сравнению с относительно статическими анализами, их упрощенные условия потока все же представляют собой отклонение от физиологических условий. Наконец, микрофлюидные подходы также были использованы из-за их простоты визуализации и равномерных схем течения; Тем не менее, они остаются значительным удалением от физиологических состояний, ожидаемых в крупных сосудах, в первую очередь пораженных при наиболее клинически значимых тромбоэмболических заболеваниях11,12.
Учитывая вышеизложенное, мы разработали высокоточную модель тромболизиса in vitro для доклинического скрининга тромболитических препаратов. Модель направлена на устранение некоторых из описанных выше ловушек в области скрининга новой тромболитической терапии и была проверена на воспроизводимость и чувствительность при различных концентрациях активатора тканевого плазминогена (tPA). Описанная здесь система обеспечивает физиологические сдвиговые потоки с использованием перистальтического насоса, демпфера давления, нагреваемого резервуара, двух датчиков давления, встроенного флуориметра и флуоресцентно помеченного аналога сгустка Чандлера, формируемого при сдвиге, для облегчения отслеживания фибринолиза13 в режиме реального времени. В совокупности вся система называется Флуориметрический анализ проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF Assay)14 , и в этой рукописи будут обсуждаться тонкости успешной постановки и проведения анализов в этой высокоточной модели тромболизиса in vitro .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

Тромбоэмболия и связанные с ней осложнения являются основной причиной заболеваемости и смертности во всем мире, и были разработаны различные анализы для проверки эффективности тромболитических препаратов как in vitro , так и in vivo. Существует растущий спрос на более физиологически релевантные модели тромбов in vitro для разработки лекарств из-за сложности и стоимости, связанных с животными моделями, в дополнение к их частой непереносимости на физиологию человека. Поток, давление и скорость сдвига являются важными характеристиками системы кровообращения, при этом сгустки, которые образуются под действием потока, имеют другую морфологию и характеристики пищеварения, чем статически образующиеся сгустки. Эти факторы часто не представлены в обычных анализах переваривания сгустков in vitro , что может иметь фармакологические последствия, влияющие на показатели успеха трансляции препарата.
Орометрическийанализ Real-T ime Flu Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) был разработан в качестве высокоточной платформы для тестирования тромболизиса, в которой используются флуоресцентно помеченные сгустки, образующиеся под действием поперечного потока, которые затем расщепляются с использованием циркулирующей плазмы в присутствии или без фибринолитических фармацевтических агентов. Изменение скорости потока как на этапе образования тромба, так и на этапах его расщепления позволяет системе имитировать артериальные, легочные и венозные состояния в самых разнообразных экспериментальных установках. Измерения могут проводиться непрерывно с помощью встроенного флуориметра или путем измерения дискретных временных точек, а также обычного измерения массы конечного сгустка. Анализ RT-FluFF представляет собой гибкую систему, которая позволяет отслеживать расщепление сгустков в режиме реального времени в условиях потока, которые более точно отражают физиологические условия in vivo, сохраняя при этом контроль и воспроизводимость системы тестирования in vitro.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

В центре внимания автора: Совершенствование тромболитических испытаний за счет интеграции динамики потока в моделях in vitro

Отслеживание фибринолиза цельных кровяных сгустков, образованных петлей Чандлера, под действием сдвигового потока в модели тромболизиса in vitro

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

Образование тромба петли Чандлера При формировании тромбов мы, как правило, стремились к квадрупликатам, чтобы гарантировать, что при наличии каких-либо выбросов сгустков (на основе общей морфологии и массы) у нас все еще есть возможность проводить тройной анализ тромболизи?...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

Анализы тромболизиса in vitro часто изо всех сил пытались воспроизвести условия in vivo, будь то в модельном тромбе, который переваривается, или в среде, в которой происходит тромболизис. В данной работе мы исследуем, как сочетание петли Чандлера и флуориметрического анализа проточного фибринолиза в реальном времени (RT-FluFF) используется для высокоточного мониторинга лизиса сгустков ex-vivo.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Тромбоз связан с многочисленными заболеваниями, и современные методы лечения могут привести к сильному кровотечению. Кровоток в системе существенно влияет на структуру тромба. Включение потока в модели in vitro может повысить их физиологическую значимость, улучшая отбор лучших кандидатов для тестирования in vivo.В анализах для изучения фибринолитиков преимущественно используются статические сгустки или микрофлюидные системы для оценки таких свойств, как время лизиса, структура сгустка или вязкоупругость. Статические анализы лизиса тромба обычно основываются на спектрофотометрических измерениях или определении массы тромба в качестве конечных точек для оценки эффективности фибринолиза. В современных тромболитических испытаниях используются статически сформированные сгустки, которые структурно отличаются от тех, которые образуются в условиях потока.Микрофлюидные системы учитывают динамику потока, но их меньшие масштабы создают уникальную гемодинамику и структуры сгустков. Разработанный в настоящее время анализ RT-FluFF упрощает мониторинг фибринолиза в режиме реального времени в условиях физиологического течения. Это означает, что теперь у нас есть платформа, которая позволяет контролировать несколько параметров, чтобы имитировать условия, приближенные к моделям исследования in vivo, для лучшей трансляции при скрининге новых тромболитиков.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.