Name: Yazar Spotlight: Akış Dinamiklerini In Vitro Modellere Entegre Ederek Trombolitik Testi Geliştirme
Uploaded: 2024-04-19T13:40:00
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü tarafından R01HL167877 Numaralı Ödül altında desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.

Aşağıda belirtilen tüm yöntemler kurumsal inceleme kurulu (IRB) protokollerine ve kurumsal insan araştırmaları etik kuruluna uygundur. Tüm sağlıklı gönüllüler kan bağışından önce yazılı ve bilgilendirilmiş onam verdiler. Protokolde atıfta bulunulan tüm materyallerin Malzeme Tablosunda bulunabileceğini unutmayın. Bu protokol boyunca insan WB ve plazma tartışılırken, araştırma hayvanı kanı ve faktör tükenmiş kan ürünlerinin kullanımı satın alınabilir ve ikame edi...

Ex Vivo Pıhtı Lizisi İzleme için Chandler Döngüsü ve RT-FluFF'nin Birleştirilmesi

<ol>
	<li>Ali, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aspect+of+thrombolytic+therapy:+a+review.">Aspect of thrombolytic therapy: a review.</a> Scientific World Journal. 2014, 586510 (2014).</li><li>Bhogal, P., Andersson, T., Maus, V., Mpotsaris, A., Yeo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+thrombectomy-A+brief+review+of+a+revolutionary+new+treatment+for+thromboembolic+stroke.">Mechanical thrombectomy-A brief review of a revolutionary new treatment for thromboembolic stroke.</a> Clin Neuroradiol. 28 (3), 313-326 (2018).</li><li>Fluri, F., Schuhmann, M. K., Kleinschnitz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+ischemic+stroke+and+their+application+in+clinical+research.">Animal models of ischemic stroke and their application in clinical research.</a> Drug Des Devel Ther. 9, 3445-3454 (2015).</li><li>Kaiser, E. E., West, F. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+animal+ischemic+stroke+models:+replicating+human+stroke+pathophysiology.">Large animal ischemic stroke models: replicating human stroke pathophysiology.</a> Neural Regen Res. 15 (8), 1377-1387 (2020).</li><li>Elnager, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+whole+blood+clot+lysis+for+fibrinolytic+activity+study+using+d-dimer+and+confocal+microscopy.">In vitro whole blood clot lysis for fibrinolytic activity study using d-dimer and confocal microscopy.</a> Adv Hematol. 2014, 814684 (2014).</li><li>Prasad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+in+vitro+model+to+study+clot+lysis+activity+of+thrombolytic+drugs.">Development of an in vitro model to study clot lysis activity of thrombolytic drugs.</a> Thromb J. 4, 14 (2006).</li><li>Robbie, L. A., Young, S. P., Bennett, B., Booth, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombi+formed+in+a+Chandler+loop+mimic+human+arterial+thrombi+in+structure+and+RAI-1+content+and+distribution.">Thrombi formed in a Chandler loop mimic human arterial thrombi in structure and RAI-1 content and distribution.</a> Thromb Haemost. 77 (3), 510-515 (1997).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+thrombi+formed+under+flow+reveal+the+role+of+factor+XIII-mediated+cross-linking+in+resistance+to+fibrinolysis.">Model thrombi formed under flow reveal the role of factor XIII-mediated cross-linking in resistance to fibrinolysis.</a> J Thromb Haemost. 8 (9), 2017-2024 (2010).</li><li>Blinc, A., Kennedy, S. D., Bryant, R. G., Marder, V. J., Francis, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+through+clots+determines+the+rate+and+pattern+of+fibrinolysis.">Flow through clots determines the rate and pattern of fibrinolysis.</a> Thromb Haemost. 71 (2), 230-235 (1994).</li><li>Mutch, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+the+Chandler+loop+to+examine+the+interaction+potential+of+NXY-059+on+the+thrombolytic+properties+of+rtPA+on+human+thrombi+in+vitro.">The use of the Chandler loop to examine the interaction potential of NXY-059 on the thrombolytic properties of rtPA on human thrombi in vitro.</a> Br J Pharmacol. 153 (1), 124-131 (2008).</li><li>Herbig, B. A., Yu, X., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+microfluidic+devices+to+study+thrombosis+in+pathological+blood+flows.">Using microfluidic devices to study thrombosis in pathological blood flows.</a> Biomicrofluidics. 12 (4), 042201 (2018).</li><li>Jigar Panchal, H., Kent, N. J., Knox, A. J. S., Harris, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidics+in+haemostasis:+A+review.">Microfluidics in haemostasis: A review.</a> Molecules. 25 (4), 833 (2020).</li><li>Zeng, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescently+conjugated+annular+fibrin+clot+for+multiplexed+real-time+digestion+analysis.">Fluorescently conjugated annular fibrin clot for multiplexed real-time digestion analysis.</a> J Mater Chem B. 9 (45), 9295-9307 (2021).</li><li>Zeng, Z., Christodoulides, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+tracking+of+fibrinolysis+under+constant+wall+shear+and+various+pulsatile+flows+in+an+in-vitro+thrombolysis+model.">Real-time tracking of fibrinolysis under constant wall shear and various pulsatile flows in an in-vitro thrombolysis model.</a> Bioeng Transl Med. 8 (3), e10511 (2023).</li><li>Christodoulides, A., Zeng, Z., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+thromboelastographic+characterization+of+reconstituted+whole+blood+utilizing+cryopreserved+platelets.">In-vitro thromboelastographic characterization of reconstituted whole blood utilizing cryopreserved platelets.</a> Blood Coagul Fibrinolysis. 32 (8), 556-563 (2021).</li><li>Zeng, Z., Nallan Chakravarthula, T., Christodoulides, A., Hall, A., Alves, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chandler+loop+shear+and+tubing+size+on+thrombus+architecture.">Effect of Chandler loop shear and tubing size on thrombus architecture.</a> J Mater Sci Mater Med. 34 (5), 24 (2023).</li><li>Touma, H., Sahin, I., Gaamangwe, T., Gorbet, M. B., Peterson, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+investigation+of+fluid+flow+in+a+chandler+loop.">Numerical investigation of fluid flow in a chandler loop.</a> J Biomech Eng. 136 (7), (2014).</li><li>Wojdyla, M., Raj, S., Petrov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Absorption+spectroscopy+of+single+red+blood+cells+in+the+presence+of+mechanical+deformations+induced+by+optical+traps.">Absorption spectroscopy of single red blood cells in the presence of mechanical deformations induced by optical traps.</a> J Biomed Opt. 17 (9), (2012).</li><li>Wu, J. H., Diamond, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+fluorescence+quench+and+dequench+assay+of+fibrinogen+polymerization,+fibrinogenolysis,+or+fibrinolysis.">A fluorescence quench and dequench assay of fibrinogen polymerization, fibrinogenolysis, or fibrinolysis.</a> Anal Biochem. 224 (1), 83-91 (1995).</li></ol>

Pıhtı oluşumu ve etiketleme Chandler döngüsünün, in-vivo trombüsleritaklit eden pıhtıları tekrarlanabilir şekilde oluşturmak için kolay ve etkili bir yol sağladığı gösterilmiştir 16. Boru boyutu, dönme hızları, tambur çapı ve pıhtılaşma süresi gibi ince ayar parametreleri, hem arteriyel hem de venöz kaynakları taklit eden bir dizi trombusta takdir edilen mimari özellikleri yakalayabilen farklı kesme koşulları altında hızlı pıhtı ...

Temelde tromboembolik etiyolojilerden kaynaklanan hastalıklar günümüz toplumunda önemli bir morbidite ve mortalite kaynağı oluşturmaktadır. Tromboembolik patogenezin belirtileri arasında, bunlarla sınırlı olmamak üzere, miyokard enfarktüsü, iskemik inmeler, derin ven trombozları ve pulmoner emboli1 bulunur. Birden fazla disiplini kapsayan muazzam miktarda devam eden araştırma, patojenik trombozla başa çıkmak için güvenli ve etkili yöntemlerin geliştirilmesi etrafında dönmektedir. Trombozun arteriyel ve venöz bulgularındaki farklılıklar ve değişen anatomik lokalizasyonlar farklı tedavi yaklaşımlarının geliştirilmesine neden olmuştur. Bununla birlikte, akut tedavi genellikle belirli klinik koşullar altında mekanik trombektomi potansiyeli olan plazminojen aktivatörleri yoluyla farmakolojik tromboliz kullanımına dayanır2.
Yeni farmakolojik tedavi stratejilerinin geliştirilmesi temel olarak hem in-vivo hayvan modellerine hem de klinik öncesi testler için in-vitro sindirim modellerine dayanmaktadır 3,4. İn vivo modeller, farmasötik ajanların temizlenmesinin yanı sıra ilaçlarla hücresel etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli fizyolojik parametrelerin tedavi etkinliği üzerindeki karmaşık etkileşimini yakalama yeteneklerinden doğal olarak yararlanır. Bununla birlikte, bu aynı karmaşıklık genellikle bu tür modelleri oldukça maliyetli hale getirir ve hayvanlarda insan fizyolojisinden önemli ölçüde farklı olan altta yatan farmako-dinamikleri / kinetiği izole etmeye çalışırken ek sorunlar ortaya çıkarır. İn vitro modellerin geliştirilmesi, ilaç geliştirme ve taramanın gerçekleştirilebildiği, ancak genellikle incelenen hastalık durumunu özetlemek için gerekli aslına uygun olmayan damıtılmış bir test ortamının kolaylaştırılmasına yardımcı olmuştur.
Yeni trombolitiklerin test edilmesi için yaygın olarak bulunan in vitro protokoller, statik koşullar altında oluşan ve parçalanan pıhtıların kullanımına dayanır, bu sayede artık pıhtı kütlesi birincil son nokta olarak hizmet eder 5,6. Ne yazık ki, bu tür teknikler, test ilaçlarının farmakodinamiğini önemli ölçüde değiştirebilen türbülanslı akış ve trans-trombüs basınç düşüşleri gibi pıhtı lizizinin mekanik yönlerini hesaba katmamaktadır. Ek olarak, statik koşullar altında oluşan pıhtılar, fizyolojik pıhtılardan farklı mikro mimari içerir. Pıhtı oluşumu sırasında kaymanın varlığının, trombosit aktivasyonu ve fibrin çapraz bağlanması gibi ortaya çıkan pıhtı özelliklerini etkilediği tekrarlanabilir bir şekilde gösterilmiştir. Kesme akışı altında üretilen pıhtılar, statik olarak oluşturulmuş pıhtılarda bulunmayan uçtan kuyruğa karmaşık heterojenlik sergiler 7,8. Fizyolojik pıhtı mimarisinden bu tür sapmalar, bir trombüs içinde ilaç penetrasyonunu ve müteakip lizis etkinliğini içeren önemli ilaç geliştirme karakterizasyonunu etkileyebilir9.
Statik pıhtılaşma/pıhtı parçalama modellerinin kullanımıyla ilişkili bu sınırlamalardan bazılarını ele almak için, kesme varlığında hem pıhtı oluşumu hem de pıhtı lizisi için Chandler döngüsünün benimsenmesi bir canlanma gördü10. Bu tür sistemler, akış dinamiklerinin daha iyi bir temsiline izin vermesine ve nispeten statik tahlillere kıyasla fizyolojik olarak daha ilgili mimariye sahip pıhtılar oluşturmasına rağmen, basitleştirilmiş akış koşulları hala fizyolojik koşullardan bir sapmayı temsil eder. Son olarak, görüntüleme kolaylığı ve tekdüze akış modelleri nedeniyle mikroakışkan yaklaşımlar da gerçekleştirilmiştir; Bununla birlikte, klinik olarak anlamlı tromboembolik bozuklukların çoğunda birincil olarak etkilenen daha büyük damarlarda beklenen fizyolojik koşullardan önemli bir uzaklaştırma olmaya devam etmektedirler11,12.
Yukarıdaki tartışmayı göz önünde bulundurarak, klinik öncesi trombolitik ilaç taraması için yüksek kaliteli, in vitro tromboliz modeli geliştirdik. Model, yeni trombolitik tedavi taraması alanında yukarıda ayrıntıları verilen mevcut tuzaklardan bazılarını ele almayı amaçlamaktadır ve değişen doku plazminojen aktivatörü (tPA) konsantrasyonlarında tekrarlanabilirlik ve duyarlılık açısından doğrulanmıştır. Burada açıklanan sistem, fibrinoliz13'ün gerçek zamanlı takibini kolaylaştırmak için bir peristaltik pompa, bir basınç sönümleyici, ısıtılmış bir rezervuar, iki basınç sensörü, bir hat içi florometre ve floresan etiketli bir Chandler döngü kesme biçimli pıhtı analogu kullanan fizyolojik kesme akışları sunar. Birlikte ele alındığında, genel sistem Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testi (RT-FluFF Testi)14 olarak adlandırılır ve bu el yazması, bu yüksek kaliteli in vitro tromboliz modelinde tahlillerin başarılı bir şekilde kurulması ve yürütülmesinin inceliklerini tartışacaktır.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>30 G&#160;Disposable Hypodermic Needles</td>
			<td>Exel International&#160;</td>
			<td>26439</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 mm HSS Lathe Bar Stock Tool 150 mm Long</td>
			<td>uxcell</td>
			<td>B07SXGSQ82</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Clear Flat Bottom UV-Transparent Microplate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3635</td>
			<td>Other Consumables, Non-treated acrylic copolymer, non-sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air-Tite Luer-lock Unsterile 60 mL Syringes</td>
			<td>Air-Tite</td>
			<td>MLB3</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus , dampeners</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arium Mini Plus Ultrapure Water System</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>NA</td>
			<td>DI water source</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Chloride</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>C5670</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable BP Transducers</td>
			<td>AD Instruments</td>
			<td>MLT0670</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans HemoMed Pod</td>
			<td>Drager</td>
			<td>5588822</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drager Siemans Patient Monitor</td>
			<td>Drager</td>
			<td>SC 7000</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drum (cylinder, diameter 120 mm, width 85 mm)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Chandler loop,</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Face Shield</td>
			<td>Moxe</td>
			<td>SHIELDS10</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>F13191</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fitting, Polycarbonate, Four-Way Stopcock, Male Luer Lock, Non-Sterile</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>30600-04</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein (FITC)</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>119245000</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>General-Purpose Water Bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>2839</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hotplate 4 &#215; 4</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>1152016H</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Source Plasma Fresh-Frozen</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-SPL</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human Whole Blood&#160;</td>
			<td>Zen-Bio</td>
			<td>SER-WB-SDS&#160;</td>
			<td>Other Consumables, CPDA-1 anticoagulant</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Easy-Load II Pump Head for High-Performance Precision Tubing, PPS Housing, SS Rotor</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>77200-62</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump Head</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L/S Variable-Speed Digital Drive Pump with Remote I/O, 6 to 600 rpm; 90 to 260 VAC</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>7528-10</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus, Pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motor Speed Controller</td>
			<td>CoCocina</td>
			<td>ZK-MG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nalgene Tubing T-Type Connectors</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>6151-0312</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pump tubing&#160;</td>
			<td>Masterflex</td>
			<td>06424-15&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>P3813</td>
			<td>Other Consumables, Powder, pH 7.4, for preparing 1 L solutions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SpectraMax M5 multi-detection microplate reader system (or other fluorescence detection)</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>M5</td>
			<td>RT-FluFF Apparatus</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Switching Power Supply</td>
			<td>SoulBay</td>
			<td>UC03U</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Scientific National Target All-Plastic Disposable Syringes 10 mL</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S751010</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue plasminogen activator, human</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>T0831</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 1/4&#39;&#39;, OD 3/8&#39;&#39;</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AGL00017</td>
			<td>Other Consumables, cut into 1.5cm sections use to connect tubing to T-type connectors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing ID 5/32&#34;, OD 7/32&#34;</td>
			<td>Tygon</td>
			<td>ND-100-65, ADF 00009&#160;</td>
			<td>Other Consumables</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>V3 365 nm Mini - Black Light UV Flashlight</td>
			<td>uvBeast</td>
			<td>uvB-V3-365-MINI</td>
			<td>Chandler loop, used to check completed clots</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZGA37RG ZYTD520 DC Motor, 12 V, 100 rpm</td>
			<td>Pangyoo</td>
			<td>ZGA37RG</td>
			<td>Chandler loop,&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tracking fibrinolysis of chandler loop-formed whole blood clots under shear flow in an in-vitro thrombolysis model

Tromboembolizm ve ilişkili komplikasyonlar dünya çapında morbidite ve mortalitenin önde gelen bir nedenidir ve trombolitik ilaç etkinliğini hem in vitro hem de in vivo olarak test etmek için çeşitli testler geliştirilmiştir. Hayvan modelleriyle ilişkili karmaşıklık ve maliyetin yanı sıra genellikle insan fizyolojisine çevrilebilirlik eksikliği nedeniyle, ilaç geliştirme için fizyolojik olarak daha ilgili in vitro pıhtı modellerine yönelik artan bir talep vardır. Akış, basınç ve kayma hızı dolaşım sisteminin önemli özellikleridir ve akış altında oluşan pıhtılar, statik olarak oluşan pıhtılardan farklı morfoloji ve sindirim özellikleri gösterir. Bu faktörler genellikle geleneksel in vitro pıhtı sindirim testlerinde temsil edilmez ve bu da ilaç translasyonel başarı oranlarını etkileyen farmakolojik etkilere sahip olabilir.
Real-T ime Griporometrik Fdüşük Fibrinoliz (RT-FluFF) testi, kesme akışı altında oluşan floresan etiketli pıhtıları kullanan ve daha sonra fibrinolitik farmasötik ajanların varlığında veya yokluğunda dolaşımdaki plazma kullanılarak sindirilen yüksek kaliteli bir tromboliz test platformu olarak geliştirilmiştir. Hem pıhtı oluşumunun hem de pıhtı sindirim adımlarının akış hızlarını değiştirmek, sistemin çok çeşitli deney düzeneklerinde arteriyel, pulmoner ve venöz koşulları taklit etmesine olanak tanır. Ölçümler, bir in-line florometre kullanılarak veya ayrı zaman noktaları alınarak ve ayrıca geleneksel bir son nokta pıhtı kütlesi ölçümü kullanılarak sürekli olarak alınabilir. RT-FluFF testi, bir in vitro test sisteminin kontrolünü ve tekrarlanabilirliğini korurken, in vivo fizyolojik koşulları daha doğru bir şekilde temsil eden akış koşulları altında pıhtı sindiriminin gerçek zamanlı olarak izlenmesine izin veren esnek bir sistemdir.

Diseases fundamentally stemming from thrombo-embolic etiologies present a major source of morbidity and mortality in present-day society. Manifestations of thrombo-embolic pathogenesis include, but are not limited to, myocardial infarctions, ischemic strokes, deep venous thromboses, and pulmonary emboli1. A tremendous amount of ongoing research, spanning multiple disciplines, revolves around the development of safe and effective methods for dealing with pathogenic thrombosis. Variations in arterial and venous manifestations of thrombosis and varying anatomic locations have resulted in the development of different treatment approaches. However, acute treatment generally relies on the use of pharmacologic thrombolysis via plasminogen activators with the potential for mechanical thrombectomy under certain clinical circumstances2.
The development of novel pharmacologic treatment strategies fundamentally relies on both in-vivo animal models and in-vitro digestion models for preclinical testing3,4. In-vivo models naturally benefit from their ability to capture the complex interaction of various physiologic parameters on treatment efficacy that include clearance of pharmaceutical agents as well as cellular interactions with drugs. However, this same complexity often makes such models quite costly and introduces additional issues when attempting to isolate underlying pharmaco-dynamics/kinetics in animals that significantly differ from human physiology. The development of in-vitro models has helped by facilitating a distilled testing setting in which drug development and screening can be performed but often lacks the fidelity necessary to recapitulate the disease state being studied. 
Commonly found in-vitro protocols for testing novel thrombolytics rely on the utilization of clots formed and lysed under static conditions whereby the residual clot mass serves as the primary endpoint5,6. Unfortunately, such techniques fail to account for the mechanical aspects of clot lysis such as turbulent flow and trans-thrombus pressure drops that can significantly alter the pharmacodynamics of test drugs. Additionally, clots formed under static conditions contain microarchitecture that differs from physiologic clots. The presence of shear during clot formation has reproducibly been shown to impact the resulting clot characteristics such as platelet activation and fibrin-crosslinking. Clots being produced under shear flow exhibit complex heterogeneity from tip-to-tail that is absent in statically formed clots7,8. Such departures from physiologic clot architecture may impact important drug development characterization that includes drug penetration within a thrombus and subsequent lysis efficiency9. 
To address some of these limitations associated with the use of static clotting/clot-lysis models, the adoption of the Chandler loop for both clot formation and clot lysis in the presence of shear has seen a resurgence10. Although such systems allow for a better representation of flow dynamics and generate clots with more physiologically relevant architecture compared to relatively static assays, their simplified flow conditions still represent a deviation from physiologic conditions. Lastly, microfluidic approaches have also been undertaken due to their ease of imaging and uniform flow patterns; however, they remain a significant removal from the physiologic conditions expected within the larger vessels primarily affected in most clinically relevant thrombo-embolic disorders11,12. 
With the above discussion in mind, we developed a high-fidelity, in-vitro thrombolysis model for preclinical thrombolytic drug screening. The model aims at addressing some of the current pitfalls detailed above in the realm of novel thrombolytic therapy screening and was validated for reproducibility and sensitivity at varying concentrations of tissue plasminogen activator (tPA). The system described herein offers physiological shear flows utilizing a peristaltic pump, a pressure dampener, a heated reservoir, two pressure sensors, an in-line fluorometer, and a fluorescently labeled Chandler loop shear-formed clot analog to facilitate real-time tracking of fibrinolysis13. Taken together, the overall system is called the Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF Assay)14 and this manuscript will discuss the intricacies of successfully setting up and running assays in this high-fidelity in-vitro thrombolysis model.

Yazar Spotlight: Akış Dinamiklerini In Vitro Modellere Entegre Ederek Trombolitik Testi Geliştirme

Bir İn Vitro Tromboliz Modelinde Kesme Akışı Altında Chandler Döngü Şeklinde Tam Kan Pıhtılarının Fibrinolizinin İzlenmesi

Thrombosis is associated with numerous medical conditions and current treatments risk severe bleeding. Circulatory system flow significantly impacts blood clot structure. Incorporating flow into in-vitro models may improve their physiological relevance, enhancing the selection of better candidates for in-vivo testing.The assays for the study of fibrinolytics predominantly utilize static clot or microfluidic systems to assess properties such as lysis time, clot structure, or viscoelasticity. Static clot lysis assays typically rely on spectrophotometric measurements or clot mass determination as endpoints to evaluate fibrinolysis efficiency. Current thrombolytic testing uses statically-formed clots, which differ structurally from those formed under flow conditions.Microfluidic systems consider flow dynamics, but their smaller scales create unique hemodynamics and clot structures. The currently developed RT-FluFF assay provides ease in monitoring fibrinolysis in real time under physiological flow conditions. This means we now have a platform that allows control over multiple parameters to mimic conditions closer to in-vivo study models for better translation when screening new thrombolytics.

Chandler döngü pıhtı oluşumu Pıhtı oluştururken, herhangi bir pıhtı aykırı değeri (brüt morfoloji ve kütleye dayalı) varsa, yine de üçlü tromboliz testleri yapma yeteneğimiz olduğundan emin olmak için genellikle dörtlüleri hedefledik. Optimum yükleme koşulları varsayarsak, pıhtıların tümü uzunluk (~ 3.3 cm), ağırlık (~ 100 mg) ve Şekil 3'te gösterildiği gibi görünüm açısından oldukça eşit olmalıdır. FITC-Fg'yi kullanırken, ...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Thrombolytic Testing by Integrating Flow Dynamics in In-Vitro Models at JoVE.com

İn vitro tromboliz deneyleri, ister model trombüsün sindirildiği ortamda ister trombolizin meydana geldiği ortamda olsun, in vivo koşulları tekrarlamak için sıklıkla mücadele etmiştir. Burada, Chandler döngüsü ve Gerçek Zamanlı Florometrik Akan Fibrinoliz Testinin (RT-FluFF) birleştirilmesinin yüksek kaliteli, ex-vivo, pıhtı lizisi izleme için nasıl kullanıldığını keşfediyoruz.

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test ...

Tromboz çok sayıda tıbbi durumla ilişkilidir ve mevcut tedaviler ciddi kanama riski taşır. Dolaşım sistemi akışı kan pıhtı yapısını önemli ölçüde etkiler. Akışı in vitro modellere dahil etmek, fizyolojik alaka düzeylerini artırabilir ve in vivo testler için daha iyi adayların seçimini artırabilir.Fibrinolitiklerin incelenmesi için yapılan tahliller, lizis süresi, pıhtı yapısı veya viskoelastisite gibi özellikleri değerlendirmek için ağırlıklı olarak statik pıhtı veya mikroakışkan sistemleri kullanır. Statik pıhtı lizisi deneyleri, fibrinoliz verimliliğini değerlendirmek için tipik olarak spektrofotometrik ölçümlere veya pıhtı kütlesi tayinine dayanır. Mevcut trombolitik test, akış koşulları altında oluşanlardan yapısal olarak farklı olan statik olarak oluşturulmuş pıhtıları kullanır.Mikroakışkan sistemler akış dinamiklerini dikkate alır, ancak daha küçük ölçekleri benzersiz hemodinamik ve pıhtı yapıları oluşturur. Halihazırda geliştirilen RT-FluFF testi, fizyolojik akış koşulları altında fibrinolizin gerçek zamanlı olarak izlenmesinde kolaylık sağlar. Bu, artık yeni trombolitikleri tararken daha iyi çeviri için in-vivo çalışma modellerine daha yakın koşulları taklit etmek için birden fazla parametre üzerinde kontrole izin veren bir platforma sahip olduğumuz anlamına geliyor.

tracking-fibrinolysis-chandler-loop-formed-whole-blood-clots-under

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tracking Fibrinolysis of Chandler Loop-Formed Whole Blood Clots Under Shear Flow in An In-Vitro Thrombolysis Model

Thromboembolism and related complications are a leading cause of morbidity and mortality worldwide and various assays have been developed to test thrombolytic drug efficiency both in vitro and in vivo. There is increasing demand for more physiologically relevant in-vitro clot models for drug development due to the complexity and cost associated with animal models in addition to their often lack of translatability to human physiology. Flow, pressure, and shear rate are important characteristics of the circulatory system, with clots that are formed under flow displaying different morphology and digestion characteristics than statically formed clots. These factors are often unrepresented in conventional in-vitro clot digestion assays, which can have pharmacological implications that impact drug translational success rates.
The Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis (RT-FluFF) assay was developed as a high-fidelity thrombolysis testing platform that uses fluorescently tagged clots formed under shear flow, which are then digested using circulating plasma in the presence or absence of fibrinolytic pharmaceutical agents. Modifying the flow rates of both clot formation and clot digestion steps allows the system to imitate arterial, pulmonary, and venous conditions across highly diverse experimental setups. Measurements can be taken continuously using an in-line fluorometer or by taking discrete time points, as well as a conventional end point clot mass measurement. The RT-FluFF assay is a flexible system that allows for the real-time tracking of clot digestion under flow conditions that more accurately represent in-vivo physiological conditions while retaining the control and reproducibility of an in-vitro testing system.

In-vitro thrombolysis assays have often struggled to replicate in-vivo conditions whether in the model thrombus being digested or in the environment in which thrombolysis is occurring. Herein, we explore how coupling the Chandler loop and Real-Time Fluorometric Flowing Fibrinolysis Assay (RT-FluFF) is used for high-fidelity, ex-vivo, clot lysis monitoring.