Name: Autore in primo piano: La terapia fotodinamica come nuovo approccio per indurre piccole colonie nella Candida resistente ai farmaci per la ricerca antifungina
Uploaded: 2024-03-29T14:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Photodynamic Therapy as a Novel Approach to Induce Petite Colonies in Drug-Resistant Candida for Antifungal Research at JoVE.com

Questo lavoro ha ricevuto finanziamenti dal Ministero della Scienza e della Tecnologia, Taiwan [MOST 110-2314-B-006-086-MY3], National Cheng Kung University [K111-B094], [K111-B095], National Cheng Kung University Hospital, Taiwan [NCKUH-11204031], [NCKUMCS2022057].

1. Coltura di C. glabrata
NOTA: Per gli esperimenti viene utilizzato un C. glabrata multiresistente (C2-1000907) resistente alla maggior parte degli agenti antifungini, incluso il fluconazolo. Potrebbe essere necessario adattare le condizioni sperimentali al ceppo specifico, poiché possono esistere variazioni tra ceppi diversi. Tutti gli esperimenti hanno utilizzato Candida in fase logaritmica coltivata a 25 °C (che imita l'infezione naturale) per coerenza. L...

Analisi della formazione di colonie minuscole e della resistenza ai farmaci nella Candida glabrata

<ol>
	<li>Soriano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis:+current+clinical+challenges+and+unmet+needs+in+adult+populations.">Invasive candidiasis: current clinical challenges and unmet needs in adult populations.</a> J Antimicrob Chemother. 78 (7), 1569-1585 (2023).</li><li>Pappas, P. G., Lionakis, M. S., Arendrup, M. C., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+candidiasis.">Invasive candidiasis.</a> Nat Rev Dis Primers. 4, 18026 (2018).</li><li>Meyahnwi, D., Siraw, B. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+respiration-deficient+mutants+from+the+pathogenic+yeast+Candida+albicans.">Isolation and characterization of respiration-deficient mutants from the pathogenic yeast Candida albicans.</a> Antonie Van Leeuwenhoek. 61 (3), 207-219 (1992).</li><li>Defontaine, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vitro+resistance+to+azoles+associated+with+mitochondrial+DNA+deficiency+in+Candida+glabrata.">In-vitro resistance to azoles associated with mitochondrial DNA deficiency in Candida glabrata.</a> J Med Microbiol. 48 (7), 663-670 (1999).</li><li>Brun, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+respiration+and+susceptibility+to+azole+antifungals+in+Candida+glabrata.">Relationships between respiration and susceptibility to azole antifungals in Candida glabrata.</a> Antimicrob Agents Chemother. 47 (3), 847-853 (2003).</li><li>Bouchara, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+selection+of+an+azole-resistant+petite+mutant+of+Candida+glabrata.">In-vivo selection of an azole-resistant petite mutant of Candida glabrata.</a> J Med Microbiol. 49 (11), 977-984 (2000).</li><li>Badrane, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotypic+diversity+and+unrecognized+antifungal+resistance+among+populations+of+Candida+glabrata+from+positive+blood+cultures.">Genotypic diversity and unrecognized antifungal resistance among populations of Candida glabrata from positive blood cultures.</a> Nat Commun. 14 (1), 5918 (2023).</li><li>Shantal, C. -. J. N., Juan, C. -. C., Lizbeth, B. -. U. S., Carlos, H. -. G. J., Estela, G. -. P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+glabrata+is+a+successful+pathogen:+An+artist+manipulating+the+immune+response.">Candida glabrata is a successful pathogen: An artist manipulating the immune response.</a> Microbiol Res. 260, 127038 (2022).</li><li>Gamarra, S., Mancilla, E., Dudiuk, C., Garcia-Effron, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Candida+dubliniensis+and+Candida+albicans+differentiation+by+colony+morphotype+in+Sabouraud-triphenyltetrazolium+agar.">Candida dubliniensis and Candida albicans differentiation by colony morphotype in Sabouraud-triphenyltetrazolium agar.</a> Rev Iberoam Micol. 32 (2), 126-128 (2015).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rose+bengal-mediated+photodynamic+therapy+to+inhibit+Candida+albicans.">Rose bengal-mediated photodynamic therapy to inhibit Candida albicans.</a> J Vis Exp. (181), e63558 (2022).</li><li>Cardoso, D. R., Franco, D. W., Olsen, K., Andersen, M. L., Skibsted, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactivity+of+bovine+whey+proteins,+peptides,+and+amino+acids+toward+triplet+riboflavin+as+studied+by+laser+flash+photolysis.">Reactivity of bovine whey proteins, peptides, and amino acids toward triplet riboflavin as studied by laser flash photolysis.</a> J Agric Food Chem. 52 (21), 6602-6606 (2004).</li><li>Hall, R. M., Trembath, M. K., Linnane, A. W., Wheelis, L., Criddle, R. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bactericidal+effects+of+toluidine+blue-mediated+photodynamic+action+on+Vibrio+vulnificus.">Bactericidal effects of toluidine blue-mediated photodynamic action on Vibrio vulnificus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49 (3), 895-902 (2005).</li><li>Wong, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indocyanine+green-mediated+photodynamic+therapy+reduces+methicillin-resistant+Staphylococcus+aureus+drug+resistance.">Indocyanine green-mediated photodynamic therapy reduces methicillin-resistant Staphylococcus aureus drug resistance.</a> J Clin Med. 8 (3), 411 (2019).</li><li>Warrier, A., Mazumder, N., Prabhu, S., Satyamoorthy, K., Murali, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photodynamic+therapy+to+control+microbial+biofilms.">Photodynamic therapy to control microbial biofilms.</a> Photodiagnosis Photodyn Ther. 33, 102090 (2021).</li><li>Hung, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+photodynamic+therapy+against+fungal+keratitis.">Recent advances in photodynamic therapy against fungal keratitis.</a> Pharmaceutics. 13 (12), 2011 (2021).</li></ol>

Questo studio rivela la PDT come il primo metodo riportato per indurre la formazione di piccole colonie nella Candida, superando gli effetti stabiliti del bromuro di etidio e del fluconazolo. Questa nuova osservazione richiede ulteriori esplorazioni per svelare le sue implicazioni sia per l'eradicazione fungina diminuendo la virulenza che per l'emergere di meccanismi di resistenza.
La PDT mediata da RB inibisce efficacemente la crescita di C. glabrata, suggerendo un potenziale approcc...

Le infezioni fungine, in particolare quelle causate dalla Candida albicans e dalla Candida glabrata, sempre più resistente ai farmaci, rappresentano una seria minaccia globale1. Queste infezioni possono essere mortali, specialmente per i pazienti ospedalizzati e quelli con un sistema immunitario indebolito. L'aumento della resistenza antifungina minaccia il controllo della candidosi invasiva, una grave infezione fungina con elevata mortalità, in particolare da Candida albicans2. I ceppi resistenti ostacolano un trattamento efficace, aumentando potenzialmente sia la complessità che i tassi di mortalità. Nella contea di Alameda, California, USA, C. glabrata è diventata la specie invasiva più diffusa3. Questo cambiamento nella prevalenza e nella distribuzione delle specie di Candida può essere influenzato dalle pratiche sanitarie locali, dai dati demografici dei pazienti, dall'utilizzo di agenti antifungini e dalla prevalenza dei fattori di rischio per le infezioni da Candida.
Piccoli mutanti nella Candida, privi di mitocondri funzionali, rivelano come questo organello influenzi la risposta ai farmaci, la virulenza e la resistenza allo stress 4,5. C. glabrata forma facilmente queste colonie, acquisendo sensibilità ai polieni mentre la perde a favore degli azoli6. La sensibilità azolica e la funzione respiratoria sono strettamente collegate, con una diminuzione della respirazione che porta alla resistenza attraverso la perdita di DNA mitocondriale7. Piccole colonie di C. glabrata con resistenza all'azolo sono state isolate da campioni di feci umane da un ricevente di trapianto di midollo osseo sottoposto a trattamento con fluconazolo8 e da flaconi di emocoltura di pazienti con infezioni del flusso sanguigno9. Le loro potenziali implicazioni nella resistenza ai farmaci, nella virulenza e nella risposta allo stress evidenziano il loro significato clinico. Inoltre, le loro proprietà distinte li rendono strumenti preziosi per indagare su questioni fondamentali nella biologia mitocondriale5. Man mano che la ricerca sui mutanti petite continua, è probabile che le loro applicazioni nella ricerca clinica e di base si espandano.
Questo studio ha scoperto che la terapia fotodinamica (PDT) può indurre piccole colonie in C. glabrata, ampliando la gamma di metodi oltre le tecniche tradizionali di esposizione di C. glabrata al bromuro di etidio o al fluconazolo.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.22 &#956;m filter</td>
			<td>Merck, Taipei, Taiwan</td>
			<td>Millex, SLGVR33RS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microfuge tube</td>
			<td>Neptune, San Diego, USA</td>
			<td>#3745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20% Triphenyltetrazolium chloride (TTC)</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>T8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL polypropylene round bottom tube</td>
			<td>Corning, AZ, USA</td>
			<td>352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round-bottom tube with cell strainer cap</td>
			<td>Corning, AZ, USA</td>
			<td>Falcon, #352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well plate</td>
			<td>Alpha plus, Taoyuan Hsien, Taiwan</td>
			<td>#16196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agar</td>
			<td>BRS, Tainan, Taiwan</td>
			<td>AG012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blank disk</td>
			<td>Advantec, Tokyo, Japan</td>
			<td>49005040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf, UK</td>
			<td>5415R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethidium bromide solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich, MO, USA</td>
			<td>E1510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluconazole, 2 mg/mL</td>
			<td>Pfizer, NY, USA</td>
			<td>BC18790248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GraphPad Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td>Version 7.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Green light emitting diode (LED) strip</td>
			<td>Nanyi electronics Co.,Ltd, Tainan, Taiwan</td>
			<td>5050</td>
			<td>Excitation wave: 500~550 nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Temperature. shake Incubators</td>
			<td>Yihder, Taipei, Taiwan</td>
			<td>LM-570D (R)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouth care cotton swabs</td>
			<td>Good Verita Enterprise, Taipei, Taiwan</td>
			<td>161357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Muller Hinton II agar</td>
			<td>BD biosciences, California, USA</td>
			<td>211438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multimode microplate reader</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>SpectraMax i3x</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OD600 spectrophotometer</td>
			<td>Biochrom, London, UK</td>
			<td>Ultrospec 10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rose Bengal</td>
			<td>Sigma-Aldrich, USA</td>
			<td>330000</td>
			<td>stock concentration 40 mg/mL = 4%, prepare in PBS, stored at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterilized glass tube</td>
			<td>Sunmei, Tainan, Taiwan</td>
			<td>AK45048-16100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yeast Extract Peptone Dextrose Medium</td>
			<td>HIMEDIA, India</td>
			<td>M1363</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of petite colonies in candida glabrate via rose bengal-mediated photodynamic therapy

Di fronte a un tasso di mortalità del 40% nei pazienti con candidemia, la Candida resistente ai farmaci e i loro piccoli mutanti rimangono una delle principali sfide terapeutiche. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) prende di mira più strutture fungine, a differenza degli antibiotici/antimicotici, contrastando potenzialmente la resistenza. I metodi tradizionali per indurre piccole colonie si basano sul bromuro di etidio o sul fluconazolo, che possono influenzare la suscettibilità ai farmaci e le risposte allo stress. Questo studio ha studiato l'applicazione della luce verde (picco 520 nm) e del fotosensibilizzatore del bengala rosa (RB) per combattere un isolato di Candida glabrata resistente ai farmaci. I risultati hanno rivelato che il trattamento con aPDT ha inibito significativamente la crescita cellulare (riduzione del ≥99,9%) e ha indotto efficacemente la formazione di colonie piccole, come evidenziato dalle dimensioni ridotte e dalla perdita della colorazione dell'indicatore redox mitocondriale. Questo studio fornisce la prova iniziale che l'aPDT può indurre colonie piccole in un ceppo di C. glabrata multiresistente in vitro, offrendo un approccio potenzialmente trasformativo per combattere le infezioni fungine resistenti.

Fungal infections, particularly those caused by Candida albicans and increasingly drug-resistant Candida glabrata, pose a serious global threat1. These infections can be deadly, especially for hospitalized patients and those with weakened immune systems. Rising antifungal resistance threatens the control of invasive candidiasis, a severe fungal infection with high mortality, especially from Candida albicans2. Resistant strains hinder effective treatment, potentially increasing both complexity and death rates. In Alameda County, California, USA, C. glabrata has become the most prevalent invasive species3. This shift in the prevalence and distribution of Candida species may be influenced by local healthcare practices, patient demographics, the utilization of antifungal agents, and the prevalence of risk factors for Candida infections.
Petite mutants in Candida, lacking functional mitochondria, reveal how this organelle affects drug response, virulence, and stress resistance4,5. C. glabrata readily forms these colonies, gaining sensitivity to polyenes while losing it to azoles6. Azole sensitivity and respiratory function are intricately linked, with diminished respiration leading to resistance via mitochondrial DNA loss7. Petite colonies of C. glabrata with azole resistance have been isolated from human stool samples from a bone marrow transplant recipient undergoing fluconazole treatment8 and from blood culture bottles of patients with bloodstream infections9. Their potential implications in drug resistance, virulence, and stress response highlight their clinical significance. Additionally, their distinct properties make them valuable tools for investigating fundamental questions in mitochondrial biology5. As research into petite mutants continues, their applications in both clinical and basic research are likely to expand.
This study discovered that photodynamic therapy (PDT) can induce petite colonies in C. glabrata, expanding the range of methods beyond the traditional techniques of exposing C. glabrata to ethidium bromide or fluconazole.

Autore in primo piano: La terapia fotodinamica come nuovo approccio per indurre piccole colonie nella Candida resistente ai farmaci per la ricerca antifungina

Induzione di piccole colonie in Candida glabrato tramite terapia fotodinamica mediata dal Rose Bengala

The research aims to use photodynamic therapy, also known as PDT, to fight against drug-resistant Candida infection. In this study, we are trying to answer how effectively PDT kills the fungi, and how the virulence of the fungi changes after the treatment. We found petite colonies from the after PDT.Present methods for inducing petite colonies rely on ethidium bromide or fluconazole, which may work through different pathways on drug resistance and the stress responses, compared to PDT. Recently, petite colonies of Candida have become a significant concern in the clinic because they may resist medication and increase mortality rates. Photodynamic therapy has become one of the antifungal treatments and our finding helps breach the gap between traditional methods used to study petite colonies.Our findings provide evidence that PDT can induce petite colonies in drug resistant Candida in-vitro, presenting a groundbreaking method to study petite colonies. We'll definitely delve deeper into this field. There are many questions to be answered.How and why do petite colonies form after PDT stress? Do different Candida species respond differently? I believe it's a never ending story to be explored.

I dati sono presentati come media con ± errore standard e sono stati ottenuti da tre esperimenti indipendenti, con almeno triplicati in ciascun gruppo. I dati sperimentali, inclusi i conteggi delle colonie, le misurazioni OD600 e i risultati della colorazione TTC, sono stati rappresentati graficamente e analizzati statisticamente utilizzando grafici e software statistici (vedi Tabella dei materiali). Per analizzare i dati è stata utilizzata l'ANOVA unidirezionale o il t-test e un va...

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Il significato delle piccole colonie nella resistenza ai farmaci di Candida spp. non è stato completamente esplorato. La terapia fotodinamica antimicrobica (aPDT) offre una strategia promettente contro le infezioni fungine resistenti ai farmaci. Questo studio dimostra che l'aPDT mediata dal bengala rosa disattiva efficacemente la Candida glabrata e induce piccole colonie, presentando una procedura unica.

Facing a 40% mortality rate in candidemia patients, drug-resistant Candida and their petite mutants remain a major treatment challenge. Antimicrobial ...

La ricerca mira a utilizzare la terapia fotodinamica, nota anche come PDT, per combattere l'infezione da Candida resistente ai farmaci. In questo studio, stiamo cercando di rispondere all'efficacia con cui la PDT uccide i funghi e a come cambia la virulenza dei funghi dopo il trattamento. Abbiamo trovato piccole colonie dal dopo PDT.I metodi attuali per indurre piccole colonie si basano sul bromuro di etidio o sul fluconazolo, che possono funzionare attraverso percorsi diversi sulla resistenza ai farmaci e sulle risposte allo stress, rispetto alla PDT. Recentemente, le piccole colonie di Candida sono diventate una preoccupazione significativa nella clinica perché possono resistere ai farmaci e aumentare i tassi di mortalità. La terapia fotodinamica è diventata uno dei trattamenti antifungini e la nostra scoperta aiuta a colmare il divario tra i metodi tradizionali utilizzati per studiare le colonie piccole.I nostri risultati forniscono la prova che la PDT può indurre colonie piccole nella Candida resistente ai farmaci in vitro, presentando un metodo innovativo per studiare le colonie piccole. Approfondiremo sicuramente questo campo. Ci sono molte domande a cui rispondere.Come e perché si formano le piccole colonie dopo lo stress della PDT? Le diverse specie di Candida rispondono in modo diverso? Credo che sia una storia infinita da esplorare.

induction-petite-colonies-candida-glabrate-via-rose-bengal-mediated

Research

JoVE Journal

Biology

Induction of Petite Colonies in Candida glabrate via Rose Bengal-Mediated Photodynamic Therapy

Facing a 40% mortality rate in candidemia patients, drug-resistant Candida and their petite mutants remain a major treatment challenge. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) targets multiple fungal structures, unlike antibiotics/antifungals, potentially thwarting resistance. Traditional methods for inducing petite colonies rely on ethidium bromide or fluconazole, which can influence drug susceptibility and stress responses. This study investigated the application of green light (peak 520 nm) and rose bengal (RB) photosensitizer to combat a drug-resistant Candida glabrata isolate. The findings revealed that aPDT treatment significantly inhibited cell growth (&#8805;99.9% reduction) and effectively induced petite colony formation, as evidenced by reduced size and loss of mitochondrial redox indicator staining. This study provides initial evidence that aPDT can induce petite colonies in a multidrug-resistant C. glabrata strain in vitro, offering a potentially transformative approach for combating resistant fungal infections.

The significance of petite colonies in Candida spp. drug resistance has not been fully explored. Antimicrobial photodynamic therapy (aPDT) offers a promising strategy against drug-resistant fungal infections. This study demonstrates that rose bengal-mediated aPDT effectively deactivates Candida glabrata and induces petite colonies, presenting a unique procedure.