Name: Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production
Uploaded: 2024-05-03T14:20:00
Duration: 1 min 52 s
Description: Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production at JoVE.com

TZ designede eksperimenterne. TZ, VD, SB og JP udførte eksperimenterne. TZ og VD genererede data og analyserede dataene. TZ og YX skrev manuskriptet. TZ og GG reviderede manuskriptet. Dette arbejde blev støttet af UPMC Children's Hospital of Pittsburgh.

Detaljerne om reagenser, plasmider og udstyr, der blev brugt i undersøgelsen, er angivet i materialetabellen. Sammensætningen af de anvendte buffere er angivet i supplerende fil 1.
1. Forberedelse af plasmid
<ol><li>Transformere plasmider (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-Cap) i E. coli. BEMÆRK VENLIGST: Enhver E.coli-stamme kan bruges til plasmidamplifikation. For nogle plasmider kan specielle kompetente celler såsom NEB stable forbedre plasmidudbyttet. De tre plasmider, der bruges i denne protokol, er pAAV-GOI: pAAV-CMV-GFP, pHelper: pAdDeltaF6 og pAAV-Cap: pAAV-RC6.</li>
	<li>Dyrk bakterier i LB-medier indeholdende de passende selektive antibiotika i optimal volumen ved 37 °C i 16-18 timer. BEMÆRK: Ved brug af NEB-stabile celler dyrkes ved 30 °C i 18-20 timer.</li>
	<li>Høst plasmid-DNA ved centrifugering af E. coli. Dyrkningsmedium ved 4000 x g, 4 °C, i 15 min.</li>
	<li>Hæld forsigtigt supernatantvæsken fra centrifugeflasken i en affaldsbeholder og rens plasmid-DNA'et fra pelleten med et storstilet endotoksinfrit plasmidoprensningssæt. BEMÆRK VENLIGST: Sørg for at hælde det langsomt og undgå stænk.</li>
	<li>Mål DNA-koncentrationen og renheden ved hjælp af et spektrofotometer. BEMÆRK VENLIGST: Kontroller DNA-renheden ved at kontrollere OD260/OD280-forholdet . Forholdet for rent DNA er omkring 1,8. DNA-koncentrationen bør være over 1 μg/μl for det senere co-transfektionstrin. Lav bakterielle glycerollagre ved at tilsætte 500 μL af natten til 500 μL 50% glycerol i en kryovial, og opbevar ved -80 °C.</li>
</ol>2. Forberedelse HEK293T celler
<ol><li>Frø HEK293T celler med DMEM-medier med højt glukoseindhold indeholdende 10 % FBS i en 10-lags cellefabrik (CF10) og lad cellerne vokse i inkubatoren natten over. BEMÆRK: Passager af 293T-cellerne skal være mindre end 10 for at have den optimale betingelse for robust AAV-produktion. Hvis det er muligt, må du ikke tilføje antibiotika til dyrkningsmediet på dette tidspunkt. CF10 har ca. 42 gange vækstoverfladearealet af en 150 mm cellekulturskål. Frø den samme celletæthed i en 150 mm cellekulturskål for at gøre det muligt at kontrollere cellevæksten under et mikroskop. Forbered 1075 ml cellesuspension, tilsæt 25 ml cellesuspension til en 150 mm skål, og tilsæt resten i CF10.</li>
	<li>Kontroller cellesammenløbet den næste dag før transfektionen. BEMÆRK VENLIGST: Celler skal nå 80%-90% sammenløb på transfektionstidspunktet ved at observere under et mikroskop.</li>
</ol>3. Tredobbelt transfektion af AAV-plasmider
<ol><li>Beregn mængden af hvert plasmid, der er nødvendigt (pAAV-GOI, pHelper, pAAV-serotype) for at have et 1,2: 1: 1 molart forhold med 2,5-5 mg totalt DNA pr. CF10. BEMÆRK: De tre plasmiders molare forhold kan være variabelt for den optimale transfektionseffektivitet. Det er bedre at teste det i en lille skala, før du går over til denne CF10-indstilling. pAAV-CMV-GFP, pAdDeltaF6 og pAAV-RC6 bruges til at lave AAV6-CMV-GFP-virussen som et eksempel. PEI-beregnerformlen er angivet i tabel 1.</li>
	<li>Afpipettere 350 ml OptiMEM i en steril 500 ml flaske.</li>
	<li>Tilsæt alle tre plasmid-DNA i flasken, der indeholder Opti-MEM. Bland godt.</li>
	<li>Tilsæt 15 ml 1 mg/ml polyethylenimin (PEI) opløsning (1:3 μg DNA til μg PEI-forhold). Ryst OptiMEM/DNA/PEI-blandingen kraftigt op og ned i 30 s. BEMÆRK: Det er okay at lave bobler.</li>
	<li>Inkuber blandingen ved stuetemperatur i 10-15 min. BEMÆRK VENLIGST: Længere inkubation kan reducere transfektionseffektiviteten.</li>
	<li>Tilsæt OptiMEM/DNA/PEI-opløsningen til 1 L flasken indeholdende 700 ml DMEM lav glucose med 10 mM HEPES og 2% FBS. Bland godt. BEMÆRK: I denne undersøgelse viste den lave glukose i DMEM bedre AAV-vektorproduktion efter co-transfektion. Tilsætningen af HEPES hjælper med at holde cellerne i en bedre tilstand. Bland ved at dreje flasken langsomt. Undgå at skabe for mange bobler.</li>
	<li>Tag CF10 ud af inkubatoren og sug mediet ud i en affaldsbeholder. BEMÆRK: Læg CF10 ned på overfladen inde i emhætten, og løft gradvist den ene side opad, støvsug langsomt mediet ud uden at løsne cellerne.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt den transfektantblanding til CF10. Sørg for, at alle ti lag er dækket af medier. BEMÆRK VENLIGST: Tilsæt 25 ml transfektantblanding i 150 mm skålen. Overvåg cellerne dagligt indtil høsten. Tilsæt den resterende transfektantblanding i CF10 ved at hælde langsomt. Drej CF10 meget forsigtigt og sørg for lige volumen for hvert lag.</li>
	<li>Sæt CF10 tilbage i inkubatoren i 72-96 timer. BEMÆRK: Kontroller 150 mm skærmskålen for at beslutte, hvornår AAV-vektorerne skal høstes. Når cellerne meget let løsner sig med en fuld belastning af AAV, er det tid til at høste.</li>
</ol>4. Høst AAV-vektorer
<ol><li>Høst virussen 3-4 dage efter transfektion ved at ryste CF10 kraftigt. Hæld mediet i de 250 ml koniske rør og drej virussen ned ved 4000 x g i 20 minutter ved 4 °C. BEMÆRK VENLIGST: For AAV6-serotypen, der bruges i denne protokol, vil 80 % AAV forblive for det meste bundet til cellulært materiale i pelleten. Og de 20 % AAV blev hemmeligholdt i medierne. Disse proportioner kan variere for andre AAV-serotyper.</li>
	<li>Filtrer klaret supernatant med 0,45 μm filterenhed og gem den til nedbør.</li>
	<li>Skyl CF10 med 500 ml DPBS 1x buffer og centrifuger ved 4000 x g i 20 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Kassér supernatanten ved hjælp af et vakuumsystem og en aspirerende pipette. Tilsæt 20 ml AAV-lysbuffer pr. CF10 ved -80 °C indtil rensning. BEMÆRK VENLIGST: Overfør AAV-lysat til et 50 ml konisk rør til senere AAV-ekstraktion.</li>
	<li>Tag den filtrerede supernatant ud, tilsæt 40 % PEG-2,5 M NaCl-opløsning for en endelig koncentration på 8 % PEG, og inkuber i et kølerum på en orbital rotator i mindst 3 timer eller natten over. BEMÆRK VENLIGST: For 100 ml supernatant tilsættes 25 ml 40% PEG-2.5 M NaCl-opløsning.</li>
	<li>Virussen udfældes ved centrifugering ved 4000 x g i 30 minutter ved 4 °C. BEMÆRK VENLIGST: Overfør blandingen til 250 ml koniske rør til centrifugering.</li>
	<li>Aspirer for at fjerne supernatant, og tilsæt 5-10 ml AAV HEPES-resuspensionsbuffer for at suspendere pillerne. Overfør til et 50 ml konisk rør for at fortsætte oprensningen nedstrøms, eller opbevar det ved -80 °C.</li>
</ol>5. AAV-ekstraktion
<ol><li>Optø viruspelleten i et 37 °C vandbad i 10-15 minutter med en shaker. BEMÆRK VENLIGST: Hvirvl AAV-lysatet for at smelte helt.</li>
	<li>Frys i -80 °C 100% ethanolbad i 20-30 min. BEMÆRK VENLIGST: Alternativt kan frysecyklussen udføres med et koldt 100 % ethanolbæger omgivet af tøris.</li>
	<li>Udfør frysning/optøning 3-4 gange, og hvirvel imellem, hvis det er nødvendigt. BEMÆRK VENLIGST: Denne cyklus kan sættes på pause ved frysetrinnet. Opbevar AAV-lysatet ved -80 °C indtil nedstrømsarbejdet.</li>
	<li>Optø AAV-lysat (fra trin 5.3) og resuspenderet AAV (fra trin 4.7)" i et 37 °C vandbad i 10-15 minutter med en ryster og hvirvel. BEMÆRK VENLIGST: Sørg for at smelte helt og bland det.</li>
	<li>Tilsæt benzonasenuklease (250 enheder/μL) til AAV-lysat og resuspenderet AAV til en endelig koncentration på 50 enheder/ml. Hvirvel løsningen.</li>
	<li>Inkuber i et 37 °C vandbad med omrystning i 30 min. BEMÆRK VENLIGST: Tag 10 % natriumdeoxycholatalikvoter ud i et vandbad for at give tid til at opløses, varme op og blandes grundigt.</li>
	<li>Der tilsættes 10 % natriumdeoxycholat, så der opnås en slutkoncentration på 0,5 %, og der inkuberes ved 37 °C med en rysteapparat på i 30 minutter. BEMÆRK VENLIGST: Natriumdeoxycholat blev brugt til at forbedre AAV-frigivelsen fra cellerne.</li>
	<li>Fordel den rå AAV-opløsning i 2 ml centrifugerør og centrifuger ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Overfør supernatanten til et 50 ml konisk rør. BEMÆRK: Brug en 1 ml pipette til at overføre supernatanten. Kassér pillerne.</li>
	<li>Tilsæt en lige stor mængde chloroform og ekstraher AAV ved hvirvling i 1-2 min. BEMÆRK VENLIGST: Opløsningen skal blive uigennemsigtig, hvid, mælkeagtig.</li>
	<li>Overfør den mælkeagtige opløsning til 2 ml centrifugerør og fordel jævnt. Centrifuger ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °C.</li>
	<li>Pipetterer forsigtigt det øverste lyserøde lag ud og overfør det i et nyt 50 ml konisk rør. BEMÆRK VENLIGST: Forstyrr ikke chloroform/proteinlagene.</li>
	<li>Mål det endelige volumen ved hjælp af en pipette. I henhold til det rå AAV-PEG-sulfatvolumendiagram (tabel 2) blandes passende mængder af 50 % (NH4)2SO4 og 40 % PEG-opløsning. Hvirvel i 2 min.</li>
	<li>Overfør blandingen til 2 ml centrifugerør for at fordele jævnt. Centrifuger ved 14.000 x g i 10 minutter ved 4 °C</li>
	<li>Opsaml det nederste lag ved hjælp af en 22 G kanyle og en 3 ml sprøjte. Saml AAV i et 50 ml konisk rør og opbevar det ved 4 °C til senere iodixanolgradienter ultracentrifugering.</li>
</ol>6. AAV-oprensning ved iodixanol gradient ultracentrifugering
<ol><li>Forbered iodixanolgradienterne frisk, før du fylder AAV'en i henhold til antallet af anvendte ultracentrifugeringsrør (tabel 3). BEMÆRK: Phenolrød blev brugt til at observere lagene.</li>
	<li>Overlejr hver opløsning i et rund polypropylen ultracentrifuge hurtigforseglingsrør langsomt ved hjælp af en 10 ml sprøjte fastgjort med en 16 G punkteret lang nål. Undgå bobler.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt op til 17 ml AAV-opløsning oven på gradienten med en 22 G sprøjte. Brug AAV-dialysebuffer til at fylde røret op. BEMÆRK VENLIGST: Tilsæt AAV-opløsningen ved at lægge dråber mod væggen i ultracentrifugerøret. Forstyr ikke gradientlagene.</li>
	<li>Forsegl ultracentrifugerørene med en elektrisk forsegler. BEMÆRK VENLIGST: Afbalancer rørene, før du sender dem til ultracentrifuge med ±0.2 g forskel.</li>
	<li>Centrifuger ved 350.000 x g i 2 timer i en Ti70-rotor ved 4 °C.</li>
	<li>Fjern forsigtigt rørene fra rotoren og placer dem i ultracentrifugerørstativet. BEMÆRK VENLIGST: Sørg for, at gradienterne ikke forstyrres.</li>
	<li>Saml AAV-fraktioner ved at følge nedenstående trin:<ol><li>Stabiliser røret på en stativholder.</li>
		<li>Punkter ultracentrifugerørene lidt under 40%-60%-grænsefladen med en 19 G nål fastgjort til en 10 ml sprøjte. BEMÆRK: Nålens åbning skal være opad, vendt mod 40% gradienten.</li>
		<li>Stik et hul i toppen af røret med en 16 G nål.</li>
		<li>Opsaml op til 5 ml pr. rør. Undgå at opsamle proteinforureningen ved 25%-40% grænsefladen.</li>
		<li>Gentag for hvert ultracentrifugerør. BEMÆRK VENLIGST: Overfør AAV-fraktionerne til et 50 ml konisk rør.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Anden runde iodixanol gradienter ultracentrifugering
BEMÆRK: Dette trin er valgfrit. Dette trin er at reducere det tomme AAV-forhold for et fuldt AAV-kapsid af højere kvalitet.
<ol><li>AAV >1:1 fortyndes med AAV-dialysebuffer. BEMÆRK: AAV indsamlet fra den første runde af ultracentrifugering var ved 40% iodixanollag. Det skal fortyndes med mindst 50% for at kunne fyldes oven på 30% iodixanollaget.</li>
	<li>Overlejr hver opløsning (tabel 4) i et ultracentrifugeringsrør ved hjælp af en 16 G spids kanyle og fastgør langsomt en 10 ml sprøjte. Undgå bobler.</li>
	<li>Tilsæt forsigtigt 20 ml fortyndet AAV-opløsning oven på gradienten med en 22 G sprøjte. Brug AAV-dialysebuffer til at fylde røret op.</li>
	<li>Gentag trin 6.4 til 6.7.</li>
</ol>8. AAV-dialyse og koncentration
<ol><li>Overfør AAV-virussen til dialysekassetten ved hjælp af en ny 18 G kanyle og 10 ml sprøjte. Injicer langsomt virussen i kassetten, og fjern luft fra den.</li>
	<li>Tilsæt en rørestang til bægerglasset, der indeholder AAV-dialysebuffer, og læg den på en røreplade.</li>
	<li>Sæt dialysekassetten i dialysebufferen med en flydebøje. Rør ved 4 °C. Skift 2-3 gange AAV-dialysebufferen. BEMÆRK VENLIGST: Brug nok buffer til at lade kassetten flyde og udføre bufferudvekslingen. Dæk bægerglasset med aluminiumsfolie.</li>
	<li>Brug en 10 ml sprøjte fastgjort med en 18 G nål til at opsamle virussen fra kassetten i en centrifugalfilterenhed.</li>
	<li>Centrifuger ved 4.000 x g i 15-30 minutter ved 4 °C. BEMÆRK VENLIGST: Skyl AAV med AAV-dialysebuffer 2-3 gange. Koncentrer AAV'en, indtil ~200 μL resterende er oven på filteret.</li>
	<li>Opsaml den koncentrerede AAV fra filterenheden. Skyl filteret med yderligere 300 μL AAV-dialysebuffer og overfør det til den koncentrerede AAV.</li>
	<li>Filtrer virussen gennem et 0,22 μm sprøjtefilter ved hjælp af en 1 ml tuberkulin luer slip-sprøjte. For at sikre mindst muligt volumentab skal du bruge 10 ml sprøjten til at skubbe luft gennem filteret 2-3 gange.</li>
	<li>Opbevar det oprensede AAV-virus ved 4 °C tidsmæssigt til titrering. BEMÆRK: Titrer virussen, alikvoten og opbevar ved -80 °C inden for 1 uge.</li>
</ol>9. AAV-virustitrering
BEMÆRK: TaqMan kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) blev brugt til at titrere oprenset AAV.
<ol><li>Behandl AAV-vektorer med DNase I og inkuber ved 37 °C i 30 minutter, og inkuber derefter ved 95 °C i 10 minutter. BEMÆRK VENLIGST: Som et eksempel på 10 μL reaktion anvendes 2 μL AAV-virusprøve, 1 μL DNase, 1 μL DNasebuffer og 6 μL H2O. Det kan udføres i en termocykler med PCR-rør.</li>
	<li>Forbered primersættene, der er rettet mod AAV-indsatsområdet. BEMÆRK: Mål kunne være promotoren, transgenet og reporteren i AAV-konstruktionen. Grunderne er anført i tabel 5.</li>
	<li>Forbered DNA-plasmidstandarder (10, 1, 0,1, 0,01, 0,001 og 0,0001 pg/μL) og en negativ kontrol (H2O).</li>
	<li>Forbered qPCR-masterblandingen, inklusive primere, i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Læg standarderne og prøverne i tre eksemplarer på en PCR-plade. Tilsæt qPCR-blandingen i standarderne og prøverne. Forsegl pladen og udfør qPCR-reaktionen i henhold til producentens anvisninger. BEMÆRK VENLIGST: Reaktionsbetingelserne afhænger af materialerne/reagenserne og instrumentet. Hurtige og konventionelle PCR-cyklusser er anvendelige.</li>
	<li>Beregn AAV-virustiter. BEMÆRK VENLIGST: Prøvekoncentrationen i denne protokol er 1/10 fortynding fra de originale prøver.</li>
	<li>Alikvoter AAV-virussen i 1,5 ml rør og opbevar ved 4 °C i op til en måned og opbevar ved -80 °C på lang sigt. BEMÆRK VENLIGST: Undgå fryse-/optøningscyklusser til opbevaring. Når det bruges til in vivo-eksperimenter , må du ikke bruge optøning over to gange alikvoter.</li>
</ol>10. Kvalitetskontrol af AAV
BEMÆRK VENLIGST: AAV-vira blev karakteriseret for renhed ved SDS-PAGE sølvfarvning ved hjælp af en SDS-PAGE-gel og farvet ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt farvningssæt.
<ol><li>Denaturer 3 x 109 vg AAV-virusprøve med Laemmli buffer. BEMÆRK: Brug en AOV-referencevirus som kontrol. AAV6-CMV-GFP-reference-fuldkapsid anvendes.</li>
	<li>Læg den denaturerede AAV på en 4%-20% gradient SDS-PAGE gel og kør ved 180 V i 50 min.</li>
	<li>Fjern gelen fra elektroforesepladen. Plet gelen med et sølvfarvesæt i henhold til producentens anvisninger.</li>
	<li>Tjek AAV-kapsidproteinerne VP1, VP2 og VP3. BEMÆRK: Ren AAV-virus indeholder kun VP1-, VP2- og VP3-capsidprotein. Hvis de ikke er rene, vil andre proteinbånd være synlige på gelen. BEMÆRK: Transmissionselektronmikroskopi (TEM) af negativ-farvede rekombinante AAV-virioner blev udført for at vurdere morfologisk integritet og fuld/tomt forhold.</li>
	<li>Tag et EM-gitter op med en pincet og sæt dig ned på bænken med den blanke side af gitteret opad.</li>
	<li>Pipettere 5 μL AAV-prøve på gitteret og lad den tørre ved fordampning. BEMÆRK VENLIGST: Fortynd AAV'en, hvis det er nødvendigt. 1012 vg/ml er en gennemsnitlig titer. Det kan tage 30-60 minutter at tørre gitteret.</li>
	<li>Vask gitteret ved pipettering, dråbe for dråbe, med ca. 200 μL H2O på gitteret.</li>
	<li>Fjern det overskydende vand ved langsomt at placere et kromatografipapir lodret ved siden af gitteret.</li>
	<li>Pipetter 5 μL 2% uranylacetatopløsning på gitteret. Udruge i 5 min og væg af som nævnt ovenfor. Lad risten tørre.</li>
	<li>Visualiser AAV-partiklerne under et transmissionselektronmikroskop (ved 50.000 gange forstørrelse). Virale kapsider med et viralt genom vil fremstå som homogene hvide sekskanter, mens tomme kapsider vil fremstå som sekskanter med en hvid kant, men et mørkt centrum.</li>
	<li>Tæl tilfældigt mindst 100 partikler for at bestemme den omtrentlige procentdel af fuld vs. tomme AAV-partikler.</li>
</ol>

Efficient Adeno-Associated Virus Vector Production Using a Cell Factory Platform

<ol>
	<li>Arjomandnejad, M., Dasgupta, I., Flotte, T. R., Keeler, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunogenicity+of+recombinant+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+gene+transfer.">Immunogenicity of recombinant adeno-associated virus (AAV) vectors for gene transfer.</a> BioDrugs. 37 (3), 311-329 (2023).</li><li>Liu, Y., Siriwon, N., A Rohrs, J., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+targeted+adeno-associated+virus+(AAV)+vectors+for+human+gene+therapy.">Generation of targeted adeno-associated virus (AAV) vectors for human gene therapy.</a> Curr Pharm Des. 21 (22), 3248-3256 (2015).</li><li>Bilal, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+large-scale+Adeno-Associated+Virus+(AAV)+production.">Optimization of large-scale Adeno-Associated Virus (AAV) production.</a> Curr Protoc. 3 (5), e757 (2023).</li><li>Rashnonejad, A., Chermahini, G. A., Li, S., Ozkinay, F., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+production+of+adeno-associated+viral+vector+serotype-9+carrying+the+human+survival+motor+neuron+gene.">Large-scale production of adeno-associated viral vector serotype-9 carrying the human survival motor neuron gene.</a> Mol Biotechnol. 58, 30-36 (2016).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (2), 379-414 (2019).</li><li>Challis, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Publisher+Correction:+Systemic+AAV+vectors+for+widespread+and+targeted+gene+delivery+in+rodents.">Publisher Correction: Systemic AAV vectors for widespread and targeted gene delivery in rodents.</a> Nat Protoc. 14 (8), 2597-2597 (2019).</li><li>Mueller, C., Ratner, D., Zhong, L., Esteves-Sena, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+and+discovery+of+novel+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Production and discovery of novel recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Curr Protoc Microbiol. 26 (1), 14 (2012).</li><li>Guo, P., Wiersch, J., Xiao, X., Gittes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simplified+purification+of+AAV+and+delivery+to+the+pancreas+by+intraductal+administration.">Simplified purification of AAV and delivery to the pancreas by intraductal administration.</a> Methods Mol Biol. 1950, 373-387 (2019).</li><li>Berns, K. I., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+of+adeno-associated+virus+vectors+for+gene+therapy+for+human+liver+diseases.">Next generation of adeno-associated virus vectors for gene therapy for human liver diseases.</a> Gastroenterol Clin North Am. 48 (2), 319-330 (2019).</li><li>Khasa, H., Kilby, G., Chen, X., Wang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+band+centrifugation+for+the+separation+and+quantification+of+empty+and+full+AAV+particles.">Analytical band centrifugation for the separation and quantification of empty and full AAV particles.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 21, 585-591 (2021).</li><li>Chen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+observation+of+the+recombinant+adeno-associated+virus+2+using+transmission+electron+microscopy+and+atomic+force+microscopy.">Comparative observation of the recombinant adeno-associated virus 2 using transmission electron microscopy and atomic force microscopy.</a> Microsc Microanal. 13 (5), 384-389 (2007).</li><li>Burnham, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+ultracentrifugation+as+an+approach+to+characterize+recombinant+adeno-associated+viral+vectors.">Analytical ultracentrifugation as an approach to characterize recombinant adeno-associated viral vectors.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (6), 228-242 (2015).</li><li>Kato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ-formable,+dynamic+crosslinked+poly+(ethylene+glycol)+carrier+for+localized+adeno-associated+virus+infection+and+reduced+off-target+effects.">In situ-formable, dynamic crosslinked poly (ethylene glycol) carrier for localized adeno-associated virus infection and reduced off-target effects.</a> Commun Biol. 6 (1), 508 (2023).</li><li>Sena-Esteves, M., Gao, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enrichment+of+fully+packaged+virions+in+column-purified+recombinant+adeno-associated+virus+(rAAV)+preparations+by+iodixanol+gradient+centrifugation+followed+by+anion-exchange+column+chromatography.">Enrichment of fully packaged virions in column-purified recombinant adeno-associated virus (rAAV) preparations by iodixanol gradient centrifugation followed by anion-exchange column chromatography.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2020 (2), 095638 (2020).</li><li>Matsumoto, M., Wangelin, J. R., Murphy, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+avian+encephalomyelitis+virus+by+ultracentrifugation+in+a+nonlinear+cesium+chloride+gradient.">Purification of avian encephalomyelitis virus by ultracentrifugation in a nonlinear cesium chloride gradient.</a> Avian Dis. 22 (3), 496-502 (1978).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført i fravær af kommercielle eller finansielle forbindelser, der kunne fortolkes som en potentiel interessekonflikt.

Her introduceres en teknisk avanceret protokol til storskala produktion af AAV-vektorer med høj titer og høj kvalitet ved hjælp af en cellefabriksplatform (CF10), hvilket repræsenterer en betydelig forbedring i forhold til konventionelle cellekulturskålsmetoder. Brugen af cellefabrikker forenkler processen med at dyrke store mængder celler, hvilket letter produktionen af AAV-vira mere effektivt1. Ved at optimere dyrkningsbetingelserne, især med DMEM med lav glukose suppleret med 10 mM HEPES og 2% FBS, blev en signifikant forbedret viral produktion bekræftet, hvilket indikerer det cellulære miljøs afgørende rolle i virusudbyttet.
Den reviderede oprensningsprotokol, som kombinerer AAV fra både cellepellets og dyrkningsmedier, adresserer det almindelige problem med lave virusudbytter og urenheder, der ses i mange eksisterende protokoller. Trinene med chloroformekstraktion og vandig tofaset partitionering fjerner effektivt de fleste proteinforurenende stoffer, hvor AAV forbliver opløseligt i ammoniumsulfatfasen. Forbedringen i både udbyttet og renheden af AAV-vektorer ved hjælp af PEG/vandig tofasepartitionering kombineret med iodixanolgradient ultracentrifugering, i modsætning til traditionelle gradient ultracentrifugeringsmetoder, kan tilskrives forbedret initial separation med PEG/vandig tofasepartitionering, raffineret renhed med iodixanol gradient ultracentrifugering og reduktion i forurenende co-rensning12. For det første forbedrer introduktionen af PEG/vandig tofaset partitionering før ultracentrifugering betydeligt den indledende adskillelse af AAV-partikler fra cellulært affald og andre forurenende stoffer. PEG, en polymer med høj molekylvægt, når den blandes med en vandig opløsning, skaber to forskellige faser13. AAV-vektorer har en tilbøjelighed til at opdele sig fortrinsvis i en af disse faser (almindeligvis den PEG-rige fase), mens mange forurenende stoffer og urenheder er opdelt i de andre13. Denne selektive partitionering koncentrerer effektivt AAV-partiklerne og fjerner en betydelig del af urenhederne selv før ultracentrifugering, hvilket øger udbyttet og reducerer forureningsbelastningen, der kommer ind i ultracentrifugeringstrin13. For det andet forfiner iodixanol gradient ultracentrifugering renheden af AAV-vektorer yderligere. Iodixanol, et ikke-ionisk, iso-osmolart gradientmedium, giver mulighed for en mere skånsom og kontrolleret adskillelse sammenlignet med traditionelle CsCl-gradienter14. I denne gradient migrerer AAV-partikler til en position i gradienten, der svarer til deres flydende tæthed14. Det er vigtigt, at denne proces er effektiv til at adskille fulde AAV-kapsider (indeholdende den genetiske nyttelast) fra tomme kapsider (uden genetisk materiale), hvilket er en afgørende determinant for vektorkvaliteten. Iodixanols iso-osmolare natur bevarer også integriteten af AAV-kapsiderne bedre end hyperosmolare midler som CsCl, hvilket potentielt kan føre til højere udbytter af intakte, funktionelle vektorer14. Endelig kan traditionelle ultracentrifugeringsmetoder, især dem, der bruger CsCl-gradienter, nogle gange samrense forurenende stoffer, der har lignende opdriftstætheder som AAV-vektorer15. Ved at bruge PEG-partitionering som et indledende trin reduceres belastningen af sådanne forurenende stoffer kraftigt før ultracentrifugering13. Denne reduktion i forureningsbelastningen betyder, at iodixanolgradienten kan arbejde mere effektivt og selektivt ved rensning af AAV-vektorer, hvilket fører til højere renhed15.
Renheden og kvaliteten af AAV-vektorerne vurderes nøje gennem sølvfarvning og TEM11. Observationen af tre hovedbånd svarende til AAV-capsidproteinerne VP1, VP2 og VP3 med en renhed på over 90 % indikerer disse AAV-vektorers egnethed til in vivo-brug . TEM-analysen til bestemmelse af forholdet mellem fuldt og tomt kapsid er særligt afgørende, da en høj andel af tomme kapsider kan føre til reduceret genleveringseffektivitet og potentielle immunresponser11. Selv om denne kvalitetskontrol er vigtig, øger den proceduremæssige kompleksitet og kan kræve yderligere teknisk ekspertise.
Afslutningsvis tilbyder protokollen betydelige tekniske fremskridt i produktionen af AAV-vektorer, især med hensyn til skalerbarhed og renhed. Kompleksiteten forbundet med rensningsprocessen og behovet for specialiseret udstyr og ekspertise kan dog stadig være en mindre begrænsning for dets anvendelse i visse forskningsmiljøer. Yderligere forfinelse og forenkling af disse teknikker kan gøre denne tilgang mere tilgængelig og bredt anvendelig inden for genterapiforskning.

Adeno-associerede virus (AAV) vektorer er blevet et uundværligt værktøj i genterapiforskning, der tilbyder en unik kombination af effektivitet og sikkerhed for genlevering1. Traditionelle metoder til generering af AAV'er i laboratoriemiljøer har været afgørende for at fremme vores forståelse og anvendelse af genterapi2. Disse metoder, selvom de er grundlæggende, udviser dog visse begrænsninger og udfordringer, især med hensyn til udbytte, tidseffektivitet og kvaliteten af de producerede vektorer, især forholdet mellem fulde og tomme partikler3.
Den konventionelle procedure for AAV-produktion involverer primært transfektion af HEK293-celler4. Denne proces, der typisk udføres i cellekulturskåle, kræver, at cellerne transfekteres med et plasmid, der indeholder genet af interesse sammen med hjælperplasmid og AAV-kapsidplasmid 5,6. Efter transfektion producerer cellerne AAV-partikler, som derefter høstes og renses 5,6. Oprensningsprocessen involverer ofte ultracentrifugering, et kritisk trin for at opnå AAV-vektorer med høj renhed7. Ultracentrifugering, især ved hjælp af cæsiumchlorid (CsCl) eller iodixanolgradient, er en standardmetode til at adskille AAV-partikler fra cellulært affald og andre urenheder8. Dette trin er afgørende for at opnå den ønskede renhed og koncentration af AAV-vektorer, hvilket direkte påvirker deres effektivitet i genlevering8. På trods af sin udbredte anvendelse har traditionel ultracentrifugering sine ulemper. For eksempel kan udbyttet af AAV-vektorer fra denne metode være variabelt og ofte lavt, hvilket giver betydelige udfordringer, når der er behov for store mængder højtitervektorer, især til in vivo-undersøgelser eller store dyremodeller9.
Et andet kritisk aspekt af AAV-vektorkvalitet er forholdet mellem fulde og tomme partikler10. AAV-præparater indeholder ofte en blanding af disse partikler; Det er dog kun de fulde partikler, der indeholder det terapeutiske genetiske materiale. Tilstedeværelsen af en høj andel af tomme partikler kan reducere effektiviteten af genleveringbetydeligt 10. Vurdering og optimering af forholdet mellem fulde og tomme partikler er således en nøgleparameter i evalueringen af AAV-vektorers effektivitet. Traditionelle metoder, selvom de er i stand til at producere AAV-vektorer, kæmper ofte for at kontrollere dette forhold konsekvent, hvilket fører til variationer i vektorstyrke10.
Her præsenteres en unik metode, som strømliner processen med at generere AAV-vektorer med højt udbytte og høj renhed ved hjælp af en cellefabriksplatform fri for at bruge arbejdskrævende HEK293T cellekulturer i celleskåle, der integrerer polyethylenglycol/vandig tofaset partitionering med iodixanol gradient ultracentrifugering. AAV-vektorens renhed bekræftes via SDS-PAGE og sølvfarvning, og forholdet mellem fulde og tomme partikler bestemmes ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM), der opfylder kvalitetsstandarderne for in vivo-undersøgelser 11.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>293T/17 cells</td>
			<td>ATTC</td>
			<td>CRL-11268</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(NH4)2SO4&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.01217.1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 M EDTA</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>324506-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 mL Henke-Ject syringe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-817-211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% pluronic F68 solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>24-040-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td>
			<td>Biorad</td>
			<td>1610732</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1M HEPES</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% Uranyl Acetate Solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>22400-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% Precast Protein Gels</td>
			<td>biorad</td>
			<td>4561094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40% PEG solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1458-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AAV6 reference full capsids</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>RS-AAV6-FL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase Cell Detachment Solution</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A6964-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Benzonase</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E1014-25KU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioLite Cell Culture Treated Dishes 150 mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-556-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugal Filter Unit</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning&#160;PES Syringe Filters</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>09-754-29</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dialysis Cassettes, 10 K MWCO</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PI66810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 1 L 0.45 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable PES Filter Units 500 mL 0.2 &#181;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB12566504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM high glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10-569-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM low glucose</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>10567022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0303S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS 1x</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-190-250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovin Serum (FBS)</td>
			<td>Biowest</td>
			<td>S1620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formvar/Carbon 300 Mesh, Cu</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>FCF300-Cu-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP9732-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCL2&#183;6H2O</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M9272-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEB stable competent cells</td>
			<td>NEB</td>
			<td>C3040H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nest Biofactory 10 chamber</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>771302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td>
			<td>Macherey-Nagel</td>
			<td>740424</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>31-985-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OptiPrep Density Gradient Medium</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D1556-250ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-CMV-GFP</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>105530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-DJ</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-420-DJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAAV-RC6</td>
			<td>Cell BioLab</td>
			<td>VPK-426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pAdDeltaF6</td>
			<td>Addgene</td>
			<td>112867</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEG 8000</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PEI Max</td>
			<td>Polysciences, Inc</td>
			<td>49553-93-7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen-Strep</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-140-163</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>1.07242.0100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Silver Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>24612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuickSeal tube</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9144589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>1162245000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium deoxycholate&#160;</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>D6750-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Taqman Fast Advanced Master Mix</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>4444557</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher&#160;</td>
			<td>32209</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a streamlined and standardized procedure for generating high-titer, high-quality adeno-associated virus vectors utilizing a cell factory platform

Præklinisk genterapiforskning, især i gnavere og store dyremodeller, nødvendiggør produktion af AAV-vektorer med højt udbytte og renhed. Traditionelle tilgange i forskningslaboratorier involverer ofte omfattende brug af cellekulturskåle til at dyrke HEK293T celler, en proces, der kan være både besværlig og problematisk. Her præsenteres en unik in-house metode, som forenkler denne proces med en specifik cellefabrik (eller cellestakke, CF10) platform. En integration af polyethylenglycol/vandig tofaset partitionering med iodixanol gradient ultracentrifugering forbedrer både udbyttet og renheden af de genererede AAV-vektorer. Renheden af AAV-vektorerne verificeres gennem SDS-PAGE og sølvfarvning, mens forholdet mellem fulde og tomme partikler bestemmes ved hjælp af transmissionselektronmikroskopi (TEM). Denne tilgang tilbyder en effektiv cellefabriksplatform til produktion af AAV-vektorer med høje udbytter, kombineret med en forbedret oprensningsmetode for at imødekomme kvalitetskravene til in vivo-undersøgelser .

Adeno-associated virus (AAV) vectors have become an indispensable tool in gene therapy research, offering a unique combination of efficacy and safety for gene delivery1. Traditional methods for generating AAVs in laboratory settings have been pivotal in advancing our understanding and application of gene therapy2. However, these methods, while foundational, exhibit certain limitations and challenges, especially in terms of yield, time efficiency, and the quality of the vectors produced, notably the ratio of full to empty particles3.
The conventional procedure for AAV production primarily involves the transfection of HEK293 cells4. This process, typically conducted in cell culture dishes, requires the cells to be transfected with a plasmid containing the gene of interest along with helper plasmid&#160;and AAV capsid plasmid5,6. Following transfection, the cells produce AAV particles, which are then harvested and purified5,6. The purification process often involves ultracentrifugation, a critical step in obtaining high-purity AAV vectors7. Ultracentrifugation, particularly using cesium chloride (CsCl) or iodixanol gradient, is a standard method for separating AAV particles from cellular debris and other impurities8. This step is crucial for achieving the desired purity and concentration of AAV vectors, which directly impacts their efficacy in gene delivery8. Despite its widespread use, traditional ultracentrifugation has its drawbacks. For example, the yield of AAV vectors from this method can be variable and often low, which poses significant challenges when large quantities of high-titer vectors are needed, particularly for in vivo studies or large animal models9.
Another critical aspect of AAV vector quality is the ratio of full to empty particles10. AAV preparations often contain a mixture of these particles; however, only the full particles contain the therapeutic genetic material. The presence of a high proportion of empty particles can significantly reduce the efficiency of gene delivery10. Assessing and optimizing the ratio of full to empty particles is thus a key parameter in evaluating the efficacy of AAV vectors. Traditional methods, while capable of producing AAV vectors, often struggle to control this ratio consistently, leading to variations in vector potency10.
Here, a unique method is presented, which streamlines the process of generating high-yield and high-purity AAV vectors using a cell factory platform free from using labor-intensive HEK293T cell cultures in cell dishes, integrating polyethylene glycol/aqueous two-phase partitioning with iodixanol gradient ultracentrifugation. The AAV vector purity is confirmed via SDS-PAGE and silver staining, and the full-to-empty particle ratio is determined using transmission electron microscopy (TEM), meeting the quality standards for in vivo studies11.

Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production

En strømlinet og standardiseret procedure til generering af adeno-associerede virusvektorer af høj titer af høj kvalitet ved hjælp af en cellefabriksplatform

I denne detaljerede trin-for-trin-protokol demonstreres en standardiseret platform til at fremstille AAV-virus af høj titer og høj kvalitet med CF10 i et storstilet forskningslaboratorium. Sammenlignet med konventionelle cellekulturskåle giver CF10 en bekvem måde at dyrke store mængder celler og producere AAV-virus (figur 1). Flere dyrkningsbetingelser blev testet for at afgøre, om celler i et optimalt miljø kan fremme viral produktion. En DMEM med lavt glukoseindhold suppleret med 10 mM HEPES og 2% FBS viste den bedste AAV-produktion.
Flere protokoller blev testet for at rense AAV'er. De fleste procedurer har lave virusudbytter og urenhed af AAV-kapsider. Her blev der udviklet en revideret oprensningsprotokol, der kombinerede AAV fra både cellepellets og dyrkningsmedier (figur 2). Vi har fundet ud af, at 80 % af AAV var i cellerne, og yderligere 20 % af AAV var i dyrkningsmedierne, som blev udskilt fra cellerne. Begge dele af AAV blev behandlet med DNase for at fjerne det frie DNA. Natriumdeoxycholat blev brugt til yderligere at frigive AAV fra cellerne. AAV'er blev derefter ekstraheret med chloroformekstraktion efterfulgt af en vandig tofaset partitionering. Disse trin gjorde det muligt at fjerne de fleste proteinforurenende stoffer. AAV forbliver opløseligt i ammoniumsulfatfasen.
De resterende forurenende stoffer blev fjernet med en diskontinuerlig iodixanolgradient ultracentrifugering (figur 3A). Gradienten var også nyttig til at fjerne de tomme AAV-kapsider, især med den anden runde af iodixanol gradient ultracentrifugering.
AAV-virussens renhed blev bestemt ved sølvfarvning. Når der blev opnået tre hovedbånd svarende til AAV-capsidprotein, VP1, VP2 og VP3, med en renhed på mere end 90 %, var AAV-virussen egnet til in vivo-brug (figur 3B). AAV fuldt kapsid til tomt capsid-forhold blev tilgået af TEM (figur 3C). Kun et fuldt kapsid med en transgenindsats ville tillade ekspression af transgen i det målrettede væv. En høj del af det tomme kapsid kan også inducere et immunrespons på AAV-kapsiden. Disse kvalitetskontroller er nødvendige for hvert AAV-virus, der produceres og renses før brug.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig01.jpg"> Figur 1: Skematisk illustration af AAV-produktionen ved hjælp af HEK293T celle-triple-transfectionsmetode. Klik <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig01large.jpg" target="_blank">her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig02.jpg"> Figur 2: Skematisk illustration af AAV-oprensningen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66741/66741fig03.jpg"> Figur 3: AAV-oprensning ved iodixanolgradient-ultracentrifugering og AAV-virusrenhedsverifikation. (A) Iodixanol-gradientlag og nålens position til høst. (B) Repræsentativ gel vurdering af capsidindhold og renhed. M: molekylær markør; R: reference AAV6 fuld kapsid; S1: internt fremstillet AAVDJ-kapsid med en runde ultracentrifugering; S2: internt fremstillet AAVDJ-kapsid med to runder ultracentrifugering; S3: internt fremstillet AAV6-kapsid. (C) Elektronmikroskopibillede af AAV. Virus indsamlet efter oprensning. Virale kapsider, der indeholder et viralt genom, fremstår som homogene hvide sekskanter, mens tomme kapsider fremstår som sekskanter med en hvid kant, men et mørkt centrum. Skalabjælke: 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/66741fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
Tabel 1: PEI-beregner til AAV-emballage. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%201%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 2: Rå AAV-PEG-sulfat volumendiagram. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%202%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 3: Fremstilling af iodixanolgradient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%203%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 4: Forberedelse af anden runde iodixanolgradient. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%204%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Tabel 5: AAV-titreringsprimere. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Table%205%20TZ%20edit.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne tabel.</a>
Supplerende fil 1: Sammensætningen af de buffere, der er anvendt til undersøgelsen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66741/Supplementary%20File%201.zip" target="_blank">Klik her for at downloade denne fil.</a>

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Advancing Gene Therapy Research with High-Titer Adeno-Associated Virus Vector Production at JoVE.com

Efterhånden som genterapiområdet fortsætter med at udvikle sig, er der et stigende behov for innovative metoder, der kan løse disse udfordringer. Her præsenteres en unik metode, som strømliner processen med at generere AAV-vektorer med højt udbytte og høj renhed ved hjælp af en cellefabriksplatform, der opfylder kvalitetsstandarderne for in vivo-undersøgelser .

Preclinical gene therapy research, particularly in rodent and large animal models, necessitates the production of AAV vectors with high yield and purity. ...

Dette projekt har til formål at levere en noelle-protokol til storskalaproduktion af adeno-associerede virusvektorer med høj titer og høj renhed ved hjælp af en cellefabriksplatform og optimerede kulturelle forhold. Den reviderede oprensningsproces kombinerer AEV fra begge cellefraktioner og ansættelsesmærket i to faser, efterfulgt af vores gradientartificering, der opnår overlegent udbytte og renhed. På trods af nylige fremskridt er der stadig nogle udfordringer i akademiske forskningslaboratorier.Disse omfatter optimering af skalerbare dyrkningsforhold, brug af andre celler, reduktion af procentdelen af tomme kapsider og afbalancering af det virale udbytte med renhed. Sammenlignet med andre teknikker tilbyder vores protokol skalerbarhed via cellefabrikker, øget udbytte med optimerede dyrkningsforhold og forbedret adeno-associeret virusvektorrenhed gennem en noelle-to-trins oprensningsproces. Denne skalerbare protokol med overlegen adeno-associeret viral renhed banede vejen for større prækliniske undersøgelser i de akademiske forskningslaboratorier.Potentielt førende til sikrere og mere effektiv genterapiudvikling på grund af forbedret vektorkvalitet.