Name: Autore in primo piano: Modello AAA murino potenziato che utilizza l'elastasi per imitare gli aneurismi umani
Uploaded: 2024-07-26T13:30:00
Duration: 1 min 21 s
Description: The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

Questa indagine è stata supportata dal National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) del National Institutes of Health (NIH) con il numero 1R01HL149404-01A1 (BL) e dal Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936 all'Università del Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (JB). Le figure sono state create o modificate con Biorender.com. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 10.

Valutazione dello sviluppo dell'aneurisma aortico nei topi dopo il trattamento con elastasi

<ol>
	<li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms.">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li><li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms.">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li><li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms.">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li><li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+aneurysms+and+dissections+series.">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li><li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. 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W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm.">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li><li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition.">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).</li><li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015)</li><li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening.">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li><li>Daugherty, A., Cassis, L. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase.">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li><li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase.">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608 (2022).</li></ol>

Gli autori di questo manoscritto non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Comprendere la complessa fisiopatologia dell'AAA è fondamentale per migliorare la gestione della malattia da aneurisma aortico. Mentre le nuove strategie vengono sviluppate attivamente per migliorare i risultati chirurgici, gli AAA rimangono prevalenti nella nostra società che invecchia e la rottura dell'aneurisma rimane una delle principali cause di morte negli Stati Uniti10. Pertanto, le esigenze insoddisfatte nelle strategie di rilevamento, prevenzione e trattamento dell'AAA giustificano ulteriori ricerche fondamentali sull'aneurisma11.
I modelli animali che ricapitolano in modo accurato ed efficiente le caratteristiche e i comportamenti degli AAA umani sono essenziali per gli studi meccanicistici della fisiopatologia dell'aneurisma e per l'identificazione di potenziali bersagli terapeutici. Mentre gli attuali modelli animali possono imitare gli aspetti principali dei cambiamenti aneurismatici che si verificano nelle malattie umane, nessun singolo modello rappresenta pienamente la vera complessità degli AAA umani. Attualmente, i topi sono la specie più ampiamente accettata per la modellazione animale AAA. I ricercatori dovrebbero considerare i vari punti di forza e di debolezza di ciascun modello murino per il loro particolare studio sull'aneurisma, come quelli sapientemente descritti nelle revisioni di Daugherty et al. e Busch et al.12,13.
L'uso dell'elastasi per indurre l'AAA nei roditori è stato descritto per la prima volta da Anidjar et al. nel 199014. La perfusione dell'aorta con l'elastasi pancreatica suina utilizzando una pompa a siringa crea una dilatazione iniziale all'incirca tra il 50% e il 70% e i segmenti dilatati dimostrano favorevolmente caratteristiche patologiche simili agli AAA umani, come la degenerazione mediale e l'infiammazione avventiziale. Il modello di perfusione classico, tuttavia, è probabilmente il modello di aneurisma tecnicamente più impegnativo e gli aneurismi che si formano tipicamente entro la seconda settimana iniziano a risolversi gradualmente in seguito. Bhamidipati et al. nel 2012 hanno poi dimostrato che l'applicazione avventiziale di elastasi potrebbe anche indurre con successo aneurismi simili che sono più riproducibili nella taglia15. Un modello molto meno impegnativo, il modello topico dell'elastasi è stato ampiamente adottato nella ricerca sull'aneurisma. Ulteriori metodologie e vantaggi del modello topico dell'elastasi sono discussi nell'articolo sui metodi di Xue e colleghi16.
Il modello elastasi/BAPN dell'AAA murino è stato sviluppato da Lu e colleghi nel 20178. L'introduzione di acqua potabile BAPN allo 0,2% ha migliorato molte delle critiche al classico modello topico dell'elastasi, producendo ora aneurismi che si espandono continuamente fino al punto di rottura dell'AAA. Nel loro studio del 2017, hanno dimostrato che i topi nel gruppo trattato con elastasi/BAPN avevano tassi di formazione di AAA significativamente più elevati rispetto al gruppo elastasi (93% vs 65%, P < 0,01), che erano anche AAA in stadio più avanzato. Per un periodo di studio di 100 giorni, gli AAA nel gruppo elastasi/BAPN hanno continuato a dilatarsi fino a raggiungere il >800% del diametro basale e hanno formato trombi intraluminali (53,8%) e il 46,2% si è rotto spontaneamente prima della fine dell'esperimento. Questo modello ha permesso ai ricercatori di studiare i fattori che possono influire sulla progressione e sulla stabilità dell'aneurisma nel tempo.
Berman et al. hanno ulteriormente esplorato il modello elastasi/BAPN variando la concentrazione di elastasi topica, la durata dello studio, i tempi di somministrazione di BAPN e l'impatto del sesso animale9. Il trattamento con 5 μL di elastasi concentrata più elevata (5 mg/mL o 10 mg/mL) ha prodotto aneurismi più grandi di 2,5 mg/mL in 56 giorni. La prevalenza della formazione di trombi intraluminali dipendeva anche dalla concentrazione di elastasi, che si è verificata nel 28,6% dei topi trattati con 5 mg/mL e nel 62,5% dei topi trattati con 10 mg/mL. Hanno anche dimostrato che il modello elastasi/BAPN potrebbe indurre aneurismi nei topi femmina. Sebbene siano stati studiati solo pochi topi femmina (n = 5), hanno scoperto che gli aneurismi nelle femmine erano più inclini alla rottura (2 su 5 topi) ed erano significativamente più grandi degli AAA maschi a 56 giorni.
In questo articolo, miriamo a fornire un metodo per affrontare uno dei maggiori limiti della modellazione chirurgica, che è la variazione nella procedura chirurgica. Senza un chiaro consenso sul grado di dissezione e sull'area dell'aorta trattata con elastasi, i risultati di questo modello potrebbero variare notevolmente tra animali, ricercatori e istituzioni. Abbiamo osservato numerose variazioni anatomiche tra i topi, tra cui il numero e le dimensioni delle arterie e delle vene lombari e la posizione dell'IMA, il decollo della vena gonadica sinistra, tra gli altri, che possono essere limitanti quando si tenta di trattare solo una porzione o un segmento specifico dell'aorta infrarenale. Qui, dimostriamo che sezionare circonferenzialmente l'intera lunghezza dell'aorta infrarenale dall'arteria renale sinistra prossimalmente alla biforcazione aortica distalmente aiuta a fornire gradi riproducibili di esposizione aortica nonostante le differenze anatomiche, aumentando al contempo il successo dell'induzione dell'aneurisma e fornendo confini chiari per l'operatore. Inoltre, le dimensioni e la posizione più anteriore dell'IVC tendono a coprire la maggior parte dell'aorta, il che può influenzare la quantità di aorta trattata se non isolata dall'IVC. Sebbene sia necessario rimuovere la fascia retroperitoneale per esporre l'aorta, è importante non sezionare completamente il tessuto connettivo dell'avventizia dall'aorta ed esporre uno qualsiasi degli strati multimediali, poiché ciò provoca tipicamente la rottura durante il periodo di incubazione dell'elastasi di 5 minuti. Questo potrebbe servire come un ulteriore controllo interno al grado di dissezione con questo modello, ma può essere una curva di apprendimento frustrante quando si adotta questo modello. Gli operatori impareranno inoltre le aree a rischio più elevato (Figura 4) che possono essere facilmente ferite durante l'intervento chirurgico e portare a un'emorragia incontrollabile.
Sebbene sia importante che le fasi procedurali di questo modello siano coerenti, la durata dello studio e la tempistica dell'ecografia a intervalli possono variare a seconda dell'obiettivo della ricerca. La dilatazione aortica inizia immediatamente con l'applicazione di elastasi, ma gli studi che utilizzano questo modello seguono comunemente i topi per 28 giorni dopo l'interventochirurgico 7, come in questo esperimento di esempio. L'estensione della durata dello studio deve essere presa in considerazione quando si studiano AAA avanzati, crescita a lungo termine, formazione di trombi intraluminali o rottura.
Ulteriori misure perioperatorie, come il mantenimento della temperatura corporea e dello stato di idratazione dell'animale, possono aiutare a migliorare la sopravvivenza degli animali di questa procedura invasiva. L'uso di un termoforo durante l'intervento chirurgico e il posizionamento in una gabbia di recupero calda può aiutare a evitare l'ipotermia. La soluzione salina deve essere riscaldata prima di essere utilizzata per irrigare la cavità addominale. Un bolo di liquido sottocutaneo subito dopo l'intervento chirurgico può spiegare perdite di liquidi insensibili durante l'operazione e aiutare l'animale a mantenere un'adeguata idratazione durante l'immediata fase di recupero. Con un'attenta manipolazione dei tessuti e un approccio metodico coerente, il modello elastasi/BAPN può essere eseguito da un operatore esperto tra i 30 e i 45 minuti per topo e produrre in modo affidabile AAA con complicanze perioperatorie molto basse.
I nostri risultati dimostrano che la combinazione di BAPN in aggiunta alla dissezione circonferenziale dell'aorta infrarenale prima dell'applicazione dell'elastasi produce AAA grandi e in continua espansione, con diametri maggiori e incidenza di rottura in periodi più brevi. In questo esperimento, gli AAA sono stati indotti con successo in tutti i topi maschi (6 su 6) e femmine (6 su 6) trattati con elastasi attiva. L'esposizione all'elastasi per 5 minuti ha provocato un aumento immediato del diametro aortico di circa il 30-40%, il che è utile per confermare il successo e la coerenza dell'applicazione dell'elastasi tra i gruppi di trattamento. Analogamente a Berman et al., abbiamo dimostrato che questo modello può indurre AAA nei topi femmine, che hanno anche una risposta di rottura maggiore rispetto ai maschi. La metà dei topi femmina (3 su 6) si è rotta entro 28 giorni, rispetto a 0 su 6 dei maschi, tuttavia, i topi femmine pesano meno dei maschi. I topi maschi hanno dimostrato un aumento del diametro dell'AAA del 257% rispetto al -4% dei controlli maschi, mentre le femmine sopravvissute hanno mostrato un aumento del diametro del 417%, rispetto al -16% dei controlli femmine. I diametri aortici non erano significativamente diversi tra i topi maschi e femmine sopravvissuti trattati a 28 giorni a causa del maggior numero di rotture nel gruppo femminile. Ipotizziamo che i topi fittizi mostrino diametri aortici più piccoli entro la fine dello studio, poiché l'aorta tende a dilatarsi leggermente durante la dissezione iniziale e quindi forma tessuto cicatriziale entro 28 giorni.
Il modello elastasi/BAPN presenta alcune limitazioni. La dissezione circonferenziale dell'aorta richiede competenze chirurgiche fini, ma aiuta a migliorare la replicabilità e il grado di induzione dell'aneurisma. Simile al modello topico dell'elastasi, c'è anche un effetto batch nell'attività dell'enzima elastasi, che, come accennato in precedenza, è quindi importante per utilizzare lo stesso flacone di elastasi per tutti gli animali in un determinato esperimento. Sebbene l'incidenza del trombo intraluminale AAA e della rottura aumenti con il tempo e la gravità dell'aneurisma, questi non sono garantiti né completamente prevedibili in questo modello.
In sintesi, il modello elastasi/BAPN produce grandi AAA infrarenali reali sia nei topi maschi che nelle femmine, che si espandono progressivamente nel tempo, formano trombi intraluminali e sono in grado di rompersi. Questi punti di forza di questo modello murino aiutano a ricapitolare meglio alcuni dei comportamenti e delle caratteristiche degli aneurismi nell'uomo. Sebbene tecnicamente difficile, un'attenta e completa dissezione dell'aorta può aumentare la risposta aneurismatica. Attualmente, il metodo elastasi/BAPN è un modello avanzato per lo studio degli aneurismi dell'aorta addominale infrarenale.

Un aneurisma è definito come una dilatazione patologica di un vaso sanguigno superiore al 50% del diametro del vaso sano1. Nonostante gli aneurismi dell'aorta addominale (AAA) siano una condizione comunemente riscontrata nella popolazione anziana, con un'incidenza di circa il >5% dei maschi > i 65 anni di età, non esistono strategie terapeutiche dirette per il trattamento dell'AAA1. L'attuale trattamento dell'AAA è limitato alla riduzione dei fattori di rischio e alla riparazione chirurgica con chirurgia a cielo aperto o endovascolare in base al diametro aortico o al tasso di crescita2. Il pericolo maggiore di AAA è la rottura di un aneurisma, che è fatale se non trattata, e la riparazione in questo contesto emergente può comportare rischi di mortalità fino al 90%1.
La fisiopatologia dell'AAA è complicata, multifattoriale e non completamente compresa3. Le caratteristiche dell'AAA umano includono la vera dilatazione aneurismatica della parete aortica con un'infiltrazione di cellule infiammatorie, la presenza di trombi intraluminali e la dilatazione progressiva che porta alla rottura finale 3,4. Inoltre, gli AAA sono associati all'età avanzata, hanno una predominanza sessuale maschio/femmina di 9:1 e si verificano più comunemente nell'aorta infrarenale5. Modellare tutte le caratteristiche e i comportamenti degli AAA umani negli animali rimane una sfida continua6.
L'attuale modellazione dell'AAA è condotta principalmente nei topi e gli aneurismi sono comunemente indotti utilizzando uno dei tre metodi: mediante infusione di angiotensina II (AngII) tramite una pompa osmotica impiantata per via sottocutanea e mediante applicazione diretta di cloruro di calcio (CaCl2) o elastasi all'aorta7. In quest'ultimo metodo, l'elastasi pancreatica suina (PPE) viene applicata a un segmento dell'aorta infrarenale e provoca la degradazione enzimatica delle fibre di elastina all'interno della lamella elastica della tunica media. Questo danno strutturale provoca l'indebolimento della parete aortica e la dilatazione aneurismatica verso l'esterno. L'uso della sola elastasi topica, tuttavia, produce aneurismi infrarenali relativamente piccoli, che non riescono ad allargarsi o rompersi progressivamente nel tempo. Più recentemente, Lu et al. hanno migliorato questo modello somministrando inoltre β-aminopropionitrile (BAPN), un inibitore irreversibile della lisil ossidasi, ai loro topi trattati con elastasi8. Impedendo la reticolazione delle fibre di elastina e collagene, l'integrazione di BAPN provoca la progressiva dilatazione delle aorte danneggiate dall'elastasi fino al punto di rottura. Il modello elastasi/BAPN ha inoltre un tasso di incidenza più elevato di AAA rispetto al modello di elastasi topica e gli aneurismi prodotti sono anche più grandi e contengono trombo intraluminale8.
Nel modello elastasi/BAPN, il grado di dissezione chirurgica e l'esposizione dell'aorta all'elastasi possono influire sul successo e sulla replicabilità di questo modello. In questo manoscritto, descriviamo che la co-somministrazione di acqua potabile BAPN e l'applicazione topica di elastasi all'aorta dopo l'isolamento circonferenziale dell'intero segmento aortico infrarenale migliora la replicabilità, tiene conto delle differenze anatomiche tra gli animali e si traduce in un maggiore tasso di induzione di AAA, dimensioni dell'aneurisma e incidenza di rotture. In questo articolo, descriveremo un approccio standardizzato per indurre in modo affidabile aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi utilizzando una combinazione di acqua integrata con elastasi topica e BAPN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 L induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0530XXS</td>
			<td>anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-03</td>
			<td>normal saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309569</td>
			<td>syringe, 22 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A0796</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3134-25G</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Delux gauze sponges, 2&#34; x 2&#34; 4-Ply</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON26224</td>
			<td>gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balding clipper</td>
			<td>Whal Clipper Corporation</td>
			<td>8110</td>
			<td>hair clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Avrio</td>
			<td>NCD 67618-154-16</td>
			<td>betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine ER-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>BERLAB0.5</td>
			<td>buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-131-11</td>
			<td>carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>Castroviejo needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton tipped wood applicators, 6&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>No. 4302</td>
			<td>cotton tipped wood applicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESMARRES 5.5&#39; rectractor&#160;</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6672</td>
			<td>skin rectractor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper, 0-150 mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td>digital caliper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase from porcine pancrease Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1250-10MG</td>
			<td>elastase &#62;4.0 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>ethanol diluted to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>14716</td>
			<td>eye lube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 dry sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>dry bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy mat</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>V016</td>
			<td>heat therapy mat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy pump</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>HTP-1500</td>
			<td>heat therapy pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NCD 59399-106-01</td>
			<td>isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-10 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LTS 0.5-10 uL</td>
			<td>pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile anesthesia mask, small</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td>anesthesia nose cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro dissector scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td>micro dissector scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light</td>
			<td>Nikon Instruments, Inc</td>
			<td>83359 NII-LED</td>
			<td>external dissection light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-661-V</td>
			<td>5-0 nylon suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5</td>
			<td>Ansell</td>
			<td>20685975</td>
			<td>non-latex surgical gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>203-1000</td>
			<td>wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Compass CR2200</td>
			<td>scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnofFlo Accessory Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>10-8000-71</td>
			<td>tubing for electronic vaporizer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoFlo electronic vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SF2992</td>
			<td>low-flow electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoPath Flow Diverter</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SP1016</td>
			<td>flow diverter for electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS/45 sharp forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-4941</td>
			<td>sharp forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6010SC</td>
			<td>surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vessel forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>VES 0.35</td>
			<td>vessel forceps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced abdominal aortic aneurysm modeling in mice by combination of topical elastase and oral &#223;-aminopropionitrile

Il modello murino topico di elastasi dell'aneurisma dell'aorta addominale (AAA) è potenziato se combinato con acqua potabile integrata con ß-aminopropionitrile (BAPN) per produrre in modo affidabile veri aneurismi infrarenali con comportamenti che imitano gli AAA umani. L'applicazione topica di elastasi all'avventizia dell'aorta infrarenale provoca un danno strutturale agli strati elastici della parete aortica e avvia la dilatazione aneurismatica. La co-somministrazione di BAPN, un inibitore della lisil ossidasi, promuove la degenerazione prolungata della parete riducendo la reticolazione di collagene ed elastina. Questa combinazione si traduce in grandi AAA che si espandono progressivamente, formano trombi intraluminali e sono in grado di rompersi. Il perfezionamento delle tecniche chirurgiche, come l'isolamento circonferenziale dell'intero segmento aortico infrarenale, può aiutare a standardizzare la procedura per un'applicazione coerente e completa dell'elastasi pancreatica suina nonostante i diversi operatori e le variazioni anatomiche tra i topi. Pertanto, il modello elastasi/BAPN è un approccio raffinato per indurre chirurgicamente l'AAA nei topi, che può ricapitolare meglio gli aneurismi umani e fornire ulteriori opportunità per studiare la crescita dell'aneurisma e il rischio di rottura.

An aneurysm is defined as a pathologic dilation of a blood vessel greater than 50% of the healthy vessel diameter1. Despite abdominal aortic aneurysms (AAA) being a commonly encountered condition in the aging population, with an incidence of roughly &#62;5% of males &#62; 65 years of age, there are no directed therapeutic strategies for treating AAA1. Current management of AAA is limited to risk factor reduction and surgical repair with either open or endovascular surgery based on aortic diameter or growth rate2. The greatest danger of AAA is aneurysm rupture, which is fatal if untreated, and repair in this emergent setting can carry mortality risks upwards of 90%1.
The pathophysiology of AAA is complicated, multifactorial, and not fully understood3. Features of human AAA include true aneurysmal dilation of the aortic wall with an infiltration of inflammatory cells, the presence of intraluminal thrombus, and progressive dilation that leads to eventual rupture3,4. Additionally, AAAs are associated with advanced age, have a 9:1 male:female sex predominance, and most commonly occur in the infrarenal aorta5. Modeling all features and behaviors of human AAAs in animals remains an ongoing challenge6.
Current AAA modeling is primarily conducted in mice, and aneurysms are commonly induced using one of three methods-by angiotensin II (AngII) infusion via a subcutaneously implanted osmotic pump, and by direct application of calcium chloride (CaCl2) or elastase to the aorta7. In the latter method, porcine pancreatic elastase (PPE) is applied to a segment of the infrarenal aorta and causes enzymatic degradation of elastin fibers within the elastic lamella of the tunica media. This structural damage results in the weakening of the aortic wall and outward aneurysmal dilation. The use of topical elastase alone, however, produces relatively small infrarenal aneurysms, which fail to progressively enlarge or rupture over time. More recently, Lu et al. improved upon this model by additionally administering &#946;-aminopropionitrile (BAPN), an irreversible inhibitor of lysyl oxidase, to their elastase-treated mice8. By preventing the crosslinking of elastin and collagen fibers, BAPN supplementation causes elastase-damaged aortas to progressively dilate to the point of rupture. The elastase/BAPN model additionally has a higher incidence rate of AAA than the topical elastase model, and the aneurysms produced are also larger and contain intraluminal thrombus8.
In the elastase/BAPN model, the degree of surgical dissection and exposure of the aorta to elastase can impact the success and replicability of this model. In this manuscript, we describe that co-administration of BAPN drinking water and topical elastase application to the aorta following circumferential isolation of the entire infrarenal aortic segment improves replicability, accounts for anatomical differences between animals, and results in a greater AAA induction rate, aneurysm sizes and rupture incidence. In this article, we will describe a standardized approach to reliably inducing advanced abdominal aortic aneurysms in mice using a combination of topical elastase- and BAPN-supplemented water.

Autore in primo piano: Modello AAA murino potenziato che utilizza l'elastasi per imitare gli aneurismi umani

Modellazione avanzata dell'aneurisma dell'aorta addominale nei topi mediante combinazione di elastasi topica e ß-aminopropionitrile orale

Our research aims to understand the pathophysiology of abdominal aortic aneurysm. In particular, we like to know in the molecular term how aneurysm ruptures. We believe by modeling aortic aneurysm in mice, males and females, will help us to develop a new treatment for this highly lethal disease that urgently needs pharmacological treatment.The pathophysiology of abdominal aortic aneurysm is multifactorial and complex, which makes animal modeling difficult. The elastase/BAPN model, however, reliably produces aneurysms in mice, which model many of the features and characteristics of the human disease. Combining BAPN drinking water with topical elastase surgery can produce large true infrarenal aneurysms, which form intraluminal thrombus, progressively dilate, and eventually rupture.This allows researchers the opportunity to study features like rupture risk and aneurysm growth.

In questo studio sono stati utilizzati topi C57BL/6J maschi e femmine di età compresa tra 22 e 24 settimane. Le aorte infrarenali sono state trattate con 5 μL di enzima elastasi (6,9 mg di proteine/mL, 6 unità/mg di proteine) o elastasi denaturata per 5 minuti. I topi maschi trattati con elastasi hanno dimostrato un aumento del 43,4% del diametro aortico dopo 5 minuti di esposizione all'elastasi rispetto ai diametri aortici basali non trattati, mentre le aorte femminili trattate sono aumentate del 33,6% (P = 0,0342). I diametri aortici delle simore non hanno mostrato variazioni relativamente nulle nell'arco di 5 minuti di esposizione all'elastasi denaturata (maschi 0,5%; femmine -2,8%). Non ci sono stati decessi correlati chirurgicamente tra i 12 topi trattati e i 6 topi fittizi. I dati per lo studio di 28 giorni sono dimostrati nella Tabella 1. Delle femmine di topo trattate, 3 su 6 sono morte per rottura dell'AAA; uno il giorno 20 postoperatorio e due il giorno 25 (Figura 6). Non ci sono state rotture AAA tra i maschi trattati. Gli AAA (definiti come un aumento >50% del diametro dell'aorta basale o la morte per rottura dell'AAA) sono stati indotti con successo in tutti i topi trattati (12 su 12). A 28 giorni, il diametro medio AAA dei maschi trattati era di 2,86 ± 0,31 mm, con una variazione percentuale media di 257 ± 54%, mentre i diametri AAA delle femmine sopravvissute di topi trattati erano 3,60 ± 1,87 mm, con una variazione percentuale media di 417 ± 286% (Figura 7). I topi fittizi non hanno mostrato relativamente alcun cambiamento nei diametri aortici.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg"> Figura 6: Sopravvivenza di topi B6 maschi e femmine durante un modello di AAA con elastasi/BAPN di 28 giorni. (A) La rottura dell'AAA si è verificata in 3 dei 6 topi femmina trattati (un topo a 20 giorni, poi due topi a 25 giorni) mentre non ci sono state rotture tra i 6 topi maschi trattati a 28 giorni. (B) Immagini rappresentative all'autopsia di una femmina di topo morta per rottura di AAA. La rottura dell'AAA è dimostrata da un grande ematoma retroperitoneale (a sinistra) e dalla presenza di un AAA infrarenale con un difetto di parete (a destra). Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg"> Figura 7: Diametri aortici massimi di elastasi/BAPN e topi B6 maschi e femmine fittizi a 28 giorni. (A) I topi trattati mostrano diametri infrarenali significativamente più grandi a 28 giorni rispetto agli sham. (B) La combinazione di elastasi e BAPN produce con successo grandi AAA infrarenali sia nei topi B6 maschi che in quelli femmine. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td>86 maschio Sham</td>
			<td>86 femmina Sham</td>
			<td>86 Elastasi maschile/8APN</td>
			<td>86 Elastasi femmina/8APN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Numero di topi</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Età (settimane)</td>
			<td>22,3 ± 0,0</td>
			<td>22,7 ± 0,7</td>
			<td>23,1 ± 0,2</td>
			<td>23,2 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Peso (g; all'intervento chirurgico)</td>
			<td>36,3 ± 2,5</td>
			<td>23,7 ± 1,2</td>
			<td>32,8 ± 1,7*</td>
			<td>23,7 ± 0,8</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diametro aortico pre-trattamento (mm)</td>
			<td>0,89 ± 0,02</td>
			<td>0,75 ± 0,04</td>
			<td>0,81 ± 0,07</td>
			<td>0,73 ± 0,09</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diametro aortico post-trattamento (mm)</td>
			<td>0,90 ± 0,03</td>
			<td>0,73 ± 0,01</td>
			<td>1,15 ± 0,03**</td>
			<td>0,98 ± 0,12**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Variazione percentuale dopo 5 minuti di trattamento (%)</td>
			<td>0,5 ± 4,4</td>
			<td>-2,8 ± 5,3</td>
			<td>43,4 ± 10,2***</td>
			<td>33,6 ± 4,5***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incidenza AAA (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AAA si rompe di 28 giorni</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Sopravvivenza a 28 giorni</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diametro aortico massimo a 28 giorni (mm)</td>
			<td>0,85 ± 0,01</td>
			<td>0,64 ± 0,01</td>
			<td>2,86 ± 0,31*</td>
			<td>3,60 ± 1,87**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Variazione percentuale del diametro aortico a 28 giorni (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr></tbody></table>Tabella 1: Risultati di un modello murino a 28 giorni di elastasi/BAPN di AAA. I dati sono medi ± SD. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 rispetto a sham dello stesso sesso tramite il test di Fischer ANOVA a una via. Abbreviazioni: BAPN = ß-amminopropionitrile; AAA = aneurisma dell'aorta addominale.

Questo protocollo descrive un approccio chirurgico metodico per modellare gli aneurismi dell'aorta addominale avanzata nei topi mediante una combinazione di applicazione diretta di elastasi all'aorta infrarenale e somministrazione di ß-aminopropionitrile attraverso l'acqua potabile.

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking water to reliably produce true infrarenal aneurysms with behaviors that mimic human AAAs. Topically applying elastase to the adventitia of the infrarenal aorta causes structural damage to the elastic layers of the aortic wall and initiates aneurysmal dilation. Co-administering BAPN, a lysyl oxidase inhibitor, promotes sustained wall degeneration by reducing collagen and elastin crosslinking. This combination results in large AAAs that progressively expand, form intraluminal thrombus, and are capable of rupture. Refining surgical techniques, such as circumferentially isolating the entire infrarenal aortic segment, can help standardize the procedure for a consistent and thorough application of porcine pancreatic elastase despite different operators and anatomic variations between mice. Therefore, the elastase/BAPN model is a refined approach to surgically inducing AAA in mice, which may better recapitulate human aneurysms and provide additional opportunities to study aneurysm growth and rupture risk.

This protocol describes a methodical surgical approach to modeling advanced abdominal aortic aneurysms in mice by a combination of directly applying elastase to the infrarenal aorta and administering &#223;-aminopropionitrile through drinking water.

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Biologia

Surgical Approach for Modeling Advanced Abdominal Aortic Aneurysms (AAA) in Mice

To begin, place the anesthetized mouse supine on the surgical field. Apply i-gel and secure the nose cone with surgical tape. Then secure the mouse's front and hind paws with surgical tape.Examine the mouse's lower abdomen for the bladder. To help create space within the abdomen during surgery, induce voiding by gently applying external pressure to the bladder between the thumb, index, and middle fingers. Use a piece of gauze to wick away the urine.Disinfect the abdomen with iodine or a chlorhexidine-based scrub, starting from the center and working outward in a circular motion. Then repeat three times with 70%alcohol. Perform a toe pinch to confirm the depth of the anesthesia.Then place a surgical drape over the mouse with the opening directly over the surgically prepped abdomen. Exchange gloves for sterile gloves. Use a scalpel to make a midline abdominal incision approximately 2-3 centimeters in length.Lift the rectus muscles with forceps to identify the translucent linea alba. Use scissors to enter the abdominal cavity through the linea alba. Then extend along the linea alba proximally and distally.Dampen a strip of gauze and two cotton tipped swabs with warm saline. Create an abdominal roll by tightly rolling one end of the gauze halfway, leaving a generous tail. Using a skin retractor, retract the right abdominal wall.With the help of dampened cotton tipped swabs, perform a right medial visceral rotation by gently sweeping the small and large intestines to the left upper quadrant to visualize the aorta and inferior vena cava. After retracting the bowel out of view, tuck the rolled end of the gauze underneath the bowel. Then bring the tail and around and out of the body to gently swaddle the bowel.Apply gentle tension to the tail of the gauze to hold the bowel out of the field of view. Adjust the abdominal roll and skin retractor to gain an optimal view of the retroperitoneal organs. After confirming that the inferior vena cava and infrarenal aorta are in full view, expose the aorta by entering and dividing the retroperitoneal fascia.Identify the gonadal arteries that run parallel along the anterior infrarenal aorta. Using forceps, bluntly divide the fascia between the gonadal arteries and continue longitudinally to expose the aorta anteriorly. Now, with tips of forceps, gently spread apart the connective tissue fibers between the aorta and inferior vena cava and continue working circumferentially around the aorta at this level.Continue bluntly dissecting the plane between the aorta and inferior vena cava, working caudally toward the aortic bifurcation. Once the right edge of the aorta is separated from the inferior vena cava, return proximally to the level of the left renal vein. Dissect the retroperitoneal fascia off the lateral left edge of the aorta, working circumferentially around until the aorta is fully isolated.After examining the isolated aorta, place a strip of gloves along the right and left edges of the aorta. Using sterile handheld calipers, measure the widest aortic diameter. Dab any extra blood or fluid from the aorta with a cotton tipped swab.Place a 10 x 2 millimeter piece of dry gauze on top of the aorta. Using a pipette, add 5 microliters of elastase to saturate the gauze and aorta. Gently fold the pieces of the glove around the aorta for 5 minutes.After 5 minutes, reset bowel retractions and unfold the pieces of the glove. Irrigate the abdominal cavity with 1 milliliter of warm 0.9%sterile saline while carefully removing the gauze and pieces of gloves from the aorta. Absorb the saline in the abdomen with gauze.Using handheld calipers, remeasure the widest aortic diameter post elastase application. Carefully remove the abdominal roll from underneath the bowel and out of the body. Observe to make sure the bowel appears pink and adequately perfused.Re-approximate the abdominal fascia using a running 5-0 non-absorbable monofilament suture. Close the skin with 3-4 skin staples. Elastase-treated male mice demonstrated a 43.4%increase in aortic diameter after 5 minutes of exposure compared to untreated baseline aortic diameters, while treated female aortas increased by 33.6%Sham mice exhibited relatively no change in aortic diameter.Of the female-treated mice, three of six died from AAA rupture, while no AAA ruptures were observed among treated males. At 28 days, the average AAA diameter of treated males was approximately 2.86 millimeters, with an average percent change of 257. While AAA diameters of surviving treated female mice were 3.6 millimeters, with an average percent change of 417.Sham mice exhibited relatively no change in aortic diameters.