Name: Forfatter Spotlight: Forbedret murin AAA-modell som bruker elastase for å etterligne menneskelige aneurismer
Uploaded: 2024-07-26T13:30:00
Duration: 1 min 21 s
Description: The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

Denne undersøkelsen ble støttet av National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI) ved National Institutes of Health (NIH) under 1R01HL149404-01A1 (BL), og Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 HL 007936 til University of Wisconsin-Madison Cardiovascular Research Center (JB). Figurer ble opprettet eller redigert med Biorender.com. Statistisk analyse ble utført ved hjelp av GraphPad Prism 10-programvaren.

Dyreprotokoller er godkjent av University of Wisconsin-Madison Institutional Animal Care and Use Committee (M005792).
1. Vedlikehold av dyr
<ol><li>Oppdrett mus på standard vedlikeholdsmat. Bruk voksne mus eller unge voksne mus (8-12 uker gamle). MERK: Bruk av voksne sikrer at dyrene har nådd full modenhet og begrenser sjansen for at endringer i aortadiameter kan være relatert til dyrevekst. For denne studien brukte vi mannlige og kvinnelige C57BL/6J-mus i alderen 22-24 uker på operasjonstidspunktet. Lu og kolleger observerte ikke signifikante forskjeller i aneuristisk respons mellom yngre og eldre mus8. I tillegg, mens det meste av aneurismemodellering utføres på hannmus, induserer denne modellen vellykket AAA hos både hann- og hunnmus9.</li>
	<li>Bestem studiens varighet og tilordne dyr til behandlings- eller falske (kontroll) grupper. Administrer 0,2 % BAPN drikkevann til mus i behandlingsgruppen og utsett dem for kirurgi med lokal påføring av aktiv elastase til den infrarenale aorta. Administrer ubehandlet vann for å kontrollere dyr og utsett dem for kirurgi med påføring av denaturert elastase på den infrarenale aorta.</li>
</ol>2. Oppstart av B-aminopropionitril (BAPN)-tilsatt drikkevann
<ol><li>To dager før operasjonen, start behandlingsmus på 0,2 % BAPN drikkevann. Tilbered BAPN-vann i større mengder og oppbevar det i mørket ved 4 °C i opptil 28 dager. Pass på at BAPN-vannet når romtemperatur før du gir det til musene. MERK: Vi anbefaler at BAPN-vann skiftes ut i merder hver 7.</li>
</ol>3. Forberedelse av operasjonsdag
<ol><li>Skjær operasjonshansker i strimler på 5 mm x 10 mm, som senere skal brukes til å isolere aorta før behandling med elastase. Forbered en kirurgisk gardin ved å kutte en ~ 1,5 cm x 3 cm stor oval i midten av en kirurgisk gardin. Brett ut 2 tommer x 2 i gasbind og skjær i to for å lage strimler av gasbind omtrent 2,5 cm x 10 cm som senere skal brukes til tilbaketrekking av mageinnholdet. Autoklav alle kirurgiske instrumenter (se materialtabellen) og sett opp et sterilt kirurgisk felt som vist i eksemplet i figur 1.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig01.jpg"> Figur 1: Eksempel på sterilt kirurgisk oppsett som forberedelse til elastase/BAPN murin modell av AAA. Forkortelser: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominal aortaaneurisme. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig01large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol start="2"><li>Forbered et postoperativt restitusjonsbur ved å plassere et rent bur under en varmelampe og plasser saltvann i nærheten av lampen for å varme opp til kroppstemperatur (37 °C). Sørg for at varmelampen er trygt plassert slik at oppsamlingsburet og saltvannet er varme, men ikke er over 37 °C. Slå på vannpumpen for å begynne å sirkulere varmt vann gjennom varmeputen.</li>
</ol>4. Dyreforberedelse for kirurgi
<ol><li>Plasser musene i et induksjonskammer og bedøve dem med 5 % isofluran ved 200 ml/min ved hjelp av en elektronisk fordamper med lav strøm. Mens du er bedøvet, vei hver mus og gi 0,6 mg/kg buprenorfin ER og 20 mg/kg karprofen subkutant for analgesi. Bruk elektriske hårtrimmere til å klippe pelsen på magen, fra nedre del av magen til underordnet xyphoid-prosessen. Bruk gasbind eller en laboratorieserviett for å børste bort overflødig hår. Sett musene tilbake i buret og vent minst 20 minutter til smertestillende midler trer i kraft før du fortsetter med operasjonen.</li>
	<li>Etter minst 20 minutter siden analgesi ble administrert, plasser musen i et anestesiinduksjonskammer og lever igjen 5 % isofluran ved 200 ml/min ved hjelp av en elektronisk fordamper med lav strømning til musen er bedøvet.</li>
	<li>Fjern den bedøvede musen fra induksjonskammeret og legg den liggende på det kirurgiske feltet. Påfør øyegel og fest nesekjeglen med kirurgisk tape. Reduser den leverte inhalert isofluran til en vedlikeholdsrate på 1-2 % ved 50 ml/min. Fest musens for- og bakpoter med kirurgisk tape.</li>
	<li>Undersøk musens nedre del av magen for blæren. Påfør forsiktig eksternt trykk på blæren mellom tommelen, pekefingeren og langfingeren for å indusere vannlating; I mellomtiden bruker du et stykke gasbind til å transportere bort urinen. NOTAT: Vær forsiktig så du ikke forurenser det kirurgiske feltet.</li>
	<li>Begynn å desinfisere magen ved å påføre en jodbasert eller klorheksidinbasert skrubb og 70 % alkohol med bomullspinner. Start i midten av magen og arbeid utover i en sirkulær bevegelse 3x. La området tørke kort mellom påføringene.</li>
	<li>Se etter mangel på tåklemmerespons for å sikre at anestesien er tilstrekkelig. Sørg for at nesekjeglen og lemmene er sikret. Plasser et kirurgisk draperi over musen, med åpningen rett over den kirurgisk preppede magen. NOTAT: Ikke dra draperingen over musen for å unngå potensiell forurensning.</li>
</ol>5. Kirurgisk induksjon av AAA
<ol><li>Gå inn i bukhulen:<ol><li>Vask hendene og bruk rene nitrilhansker eller sterile operasjonshansker. Før du kontakter operasjonsfeltet, spray alltid hansker med 70 % EtOH og gni hanskede hender sammen til de er tørre.</li>
		<li>Bruk stump tang til å telte huden i midtlinjen magen. Bruk kirurgisk saks til å lage et lite hakk i huden, og forleng deretter snittet i lengderetningen, omtrent 2-3 cm langt.</li>
		<li>Bruk tang for å løfte rectusmusklene for å identifisere den gjennomskinnelige linea alba. Bruk saks for å komme inn i bukhulen gjennom linea alba, og strekk deretter langs linea alba proksimalt og distalt.</li>
	</ol></li>
	<li>Eksponere abdominal aorta:<ol><li>Fukt en stripe gasbind og to bomullspinner med oppvarmet saltvann. Lag en magerull ved å rulle den ene enden av gasbindet tett halvveis, og etterlate en sjenerøs hale.</li>
		<li>Bruk en hudopptrekker for å trekke inn høyre bukvegg.</li>
		<li>Bruk fuktede bomullspinner, utfør en høyre-medial visceral rotasjon ved å forsiktig feie tynntarmen og tykktarmen til venstre øvre kvadrant og visualisere aorta og inferior vena cava (IVC). Bruk en magerull for å trekke tarmen ut av syne – stikk den rullede enden av gasbindet under tarmen, og før deretter haleenden rundt og ut av kroppen for å svøpe tarmen forsiktig. Påfør forsiktig spenning på halen av gasbindet for å holde tarmen ute av synsfeltet. Juster bukrullen og hudretraktoren for å få en optimal view av retroperitoneale organer, som vist i figur 2A. MERK: Magerullen bidrar til å holde tarmen fuktig og beskytte den mot utilsiktet skade av kirurgiske instrumenter. Pass på at gasbindet forblir fuktig under prosedyren for å forhindre at tarmen tørker ut. Vær forsiktig så du ikke trekker tarmen kraftig tilbake, da dette kan forårsake knekk i den øvre mesenterialarterien og tarmvaskulaturen, noe som potensielt kan forårsake iskemisk skade. Dessuten, når du først feier tynntarmen, må du være forsiktig med et tynt gjennomskinnelig feste mellom tykktarmen og den underordnede leveren (hepatokolisk leddbånd), som hvis det ikke er forsiktig, lett kan rive av leverkapselen og forårsake blødning. Hvis det er spenning på dette leddbåndet under tilbaketrekking, del det skarpt med saks.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig02.jpg"> Figur 2: Representasjon av abdominal tilbaketrekking og det optimale kirurgiske synet for eksponering av musens infrarenale aorta. (A) Plassering av en gasbind abdominal rull hjelper til med å trekke tilbake de intraabdominale organene, mens en motsatt retraktor hjelper til med å gi visualisering av retroperitoneum. En steril kirurgisk gardin (gjennomsiktig for å vise dyreorientering) plasseres over det bedøvede dyret for å opprettholde steriliteten. (B) Den retroperitoneale fascien (grønn boks) ligger over aorta anteriort. (C) Eksempel på infrarenal aorta etter disseksjon av retroperitoneal fascia. Isolering av aorta fra IVC kan oppnås ved å starte ved et potensielt mellomrom mellom aorta og IVC som ligger like distalt for venstre nyrevene når den krysser anteriort (gul sirkel). Forkortelse: IVC = inferior vena cava. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig02large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol start="3"><li>Circumferensiell disseksjon og isolering av infrarenal aorta:<ol><li>Bekreft at IVC og infrarenal aorta er i full visning. Begynn å eksponere aorta ved først å gå inn og dele den retroperitoneale (RP) fascien (figur 2B). Identifiser de gonadale (testikkel- eller eggstokkarteriene) som går parallelt langs den fremre infrarenale aorta (figur 2B og figur 3). Bruk tang for å dele fascien stumt mellom gonadearteriene og fortsett i lengderetningen for å eksponere aorta anteriort (figur 2C). MERK: RP-fascien er et tynt, gjennomskinnelig lag av bindevev som inneholder lymfatikk og splanchnic plexus. Det er nødvendig å dissekere gjennom RP-fascien for å avsløre aorta. Disseker imidlertid ikke gjennom bindevevet til aorta adventitia. En rift i adventitia (hvitt bindevev) vil eksponere mediet (virker knallrødt), og aorta vil sannsynligvis sprekke på dette stedet når elastase er påført.</li>
		<li>Deretter begynner du å isolere abdominal aorta fra IVC. Begynn denne disseksjonen ved et lite gap mellom IVC og aorta, som ligger rett under den nedre kanten av venstre nyrevene når den krysser aorta (figur 2C). Bruk tuppene av tang til å spre bindevevsfibrene forsiktig fra hverandre mellom aorta og IVC og fortsett å jobbe omkrets rundt aorta på dette nivået. MERK: IVC er veldig tynnvegget og fester seg tett til aorta med et fint lag med fibrøst bindevev. Vær forsiktig så du unngår å håndtere IVC eller rengjøre IVC så mye som mulig. Å dissekere høyre side av aorta fra IVC først (før du dissekerer venstre side av aorta fra den omkringliggende muskulaturen) vil hjelpe aorta til å "falle bort" fra IVC.</li>
		<li>Fortsett å dissekere planet mellom aorta og IVC, og arbeid kaudalt mot aorta-bifurkasjonen. Stopp ytterligere distal disseksjon når du når aortabifurkasjonen. MERK: Ta ekstra forholdsregler når du dissekerer rundt inferior mesenteric arterie (IMA), som vanligvis er lokalisert nær midtseksjonen av den infrarenale aorta og beveger seg sideveis over IVC.</li>
		<li>Når høyre kant av aorta er skilt fra IVC, gå tilbake proksimalt til nivået av venstre nyrevene. Disseker RP-fascien fra den laterale venstre kanten av aorta, og arbeid rundt omkretsen til aorta er fullstendig isolert. Se figur 3 for relevant anatomi av retroperitoneal disseksjon. NOTAT: Vær forsiktig med å dissekere bak aorta, da det er stor variasjon i plassering og antall korsryggårer og arterier. Se figur 4 for referanse til områder med høy risiko for blødning ved denne disseksjonen.</li>
		<li>Inspiser nøye at aorta er perifert isolert fra IVC og den omkringliggende muskulaturen så mye som mulig, med forsiktig disseksjon rundt aortasegmentene bundet av IMA og lumbale arterier.</li>
		<li>Plasser en stripe med hanske langs høyre og venstre kant av aorta, som vist i figur 5A. Forsøk å dekke så mye av IVC som mulig.</li>
		<li>Bruk håndholdte kalipere til å måle den bredeste aortadiameteren og registrer tre målinger. Spray tuppene på kaliperne med 70 % EtOH før og etter målinger. Unngå direkte kontakt med aorta med tykkelsesspissene for å forhindre forurensning. NOTAT: Bilder som bruker et kalibrert kamerakompatibelt mikroskop kan også brukes.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig03.jpg"> Figur 3: Anatomi av blodtilførselen til nedre del av magen, bekkenet og retroperitoneum hos mus. Forkortelser: R = høyre; L = venstre. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig03large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig04v2.jpg"> Figur 4: Steder med høy risiko for skade og blødning under retroperitoneal disseksjon og circumferensiell isolasjon av infrarenal aorta. Forkortelser: L = venstre; IMA = arteria mesenterica inferior. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig04large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig05.jpg"> Figur 5: Intraoperative responser på påføring av elastase eller simulert under elastase/BAPN murine AAA-modellen. (A) Segmenter av hansken plasseres langs lengden av aorta før påføring av elastase for å beskytte IVC og tarm mot eksponering for elastase samtidig som aorta holdes dynket i elastase (B) Påføring av denaturert elastase forårsaker ikke utvidelse av aorta (blå boks). Den maksimale aortadiameteren målte 0,627 mm ved baseline, deretter 0,607 mm etter 5 minutter med topisk denaturert elastase. (C) Påføring av elastase forårsaker aortadilatasjon etter 5 minutters behandling. I dette eksemplet utvidet aorta (grønn) seg til 0,953 mm fra 0,607 mm, en 57 % økning i diameter. Forkortelser: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominal aortaaneurisme. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig05large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<ol start="4"><li>Elastase applikasjon:<ol><li>Bruk en bomullspinne til å tørke ekstra blod eller væske fra aorta.</li>
		<li>Deretter legger du et 10 mm x 2 mm stykke tørt gasbind på toppen av aorta. Bruk en pipette til å dispensere 5 μL elastase (eller kontrollere denaturert elastase) for å mette gasbindet og aorta. Brett bitene av hansken forsiktig rundt aortaen. NOTAT: For å tilberede denaturert elastase for bruk i falsk eller kontrollgrupper, kok elastase ved 100 °C i 30 minutter.</li>
		<li>La elastase virke på aorta i 5 minutter. I løpet av denne inkubasjonsperioden, om nødvendig, frigjør noe av spenningen som er plassert av bukrullen og hudopptrekkeren. MERK: På grunn av batcheffekten med elastase, oppfordrer vi etterforskere til å bruke samme flaske elastase for alle eksperimenter i en gitt studie. Med hver nye flaske elastase anbefaler vi å utføre en dose-respons for å sikre at det ikke er et overveldende antall tidlige rupturer (før 4 uker). Varigheten av elastasepåføringen kan også justeres mellom 4 og 6 minutter avhengig av responsen på elastase.</li>
		<li>Etter 5 minutter, tilbakestill tarmtilbaketrekking og brett ut delene av hansken. Skyll bukhulen med 1 ml varmt 0,9 % sterilt normalt saltvann, mens du forsiktig fjerner gasbindet og hanskebitene av aorta. Absorber saltvannet i magen med 10 cm x 10 cm gasbind. Gjenta vanning av magen i totalt 3 x 3 ml.</li>
		<li>Bruk håndholdte kalipere til å måle den bredeste aortadiameteren etter elastasepåføring på nytt og registrer 3x. Se figur 5B,C for eksempler på aortadilatasjon til behandling med simulert og aktiv elastase. MERK: Gjennomsnittet av de tre pre- og postelastasemålingene kan brukes til å beregne den prosentvise endringen i aortadiameter med behandling. Vanligvis er det en bemerkelsesverdig utvidelse ~30-50% umiddelbart etter elastasebehandling, noe som kan bidra til å sikre at elastasen er funksjonell og aorta ble tilstrekkelig behandlet. Diameteren på aorta bør ikke endres ved påføring av denaturert elastase eller kan måle litt mindre (sannsynligvis fra spasmer).</li>
	</ol></li>
	<li>Lukking av bukhulen:<ol><li>Fjern magerullen forsiktig fra under tarmen og ut av kroppen. Påfør om nødvendig ekstra saltvann på tarmen for å forhindre at den fester seg til magerullen under fjerning. Kontroller at tarmen ser rosa ut og tilstrekkelig perfusert. MERK: Det er ikke nødvendig å prøve å flytte tarmen tilbake til sin opprinnelige plassering; Forsøk på det kan risikere vridning av tarmen eller indre brokk.</li>
		<li>Tilnærm abdominal fascia på nytt ved å bruke en løpende 5-0 ikke-absorberbar monofilamentsutur. Lukk huden med 3-4 hudstifter.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Postoperativ dyrepleie
<ol><li>Plasser musen i gjenopprettingsburet med en varmelampe. Sørg for at temperaturen på buret er varm, ikke varm.</li>
	<li>Administrer en 0,5-1 ml subkutan væskebolus med 0,9 % normalt saltvann.</li>
	<li>La musen komme seg av seg selv i det oppvarmede buret i ~20 minutter til den er aktiv i henhold til institusjonell protokoll, og gå deretter tilbake til et husbur.</li>
	<li>I henhold til institusjonell protokoll, administrer karprofen 20 mg/kg 24 timer etter operasjonen på postoperativ dag 1, og fortsett daglig i 3 dager.</li>
</ol>7. Aortamåling og vevshøsting
<ol><li>Etter eutanasi med isofluran og cervikal dislokasjon, åpne bukhulen igjen. Forleng snittet gjennom brystbenet for å få tilgang til brystkassen. Fjern høyre atria og perfuser venstre ventrikkel med 10 ml kald 1% DPBS-løsning over 2 minutter. Skjær lungene, leveren og milten. MERK: Vær forsiktig så du ikke skader tarmen; Søl av enterisk innhold kan påvirke vevsanalysen.</li>
	<li>Eksponer abdominal aorta og mål den maksimale infrarenale aortadiameteren, som beskrevet ovenfor. Fortsett å dissekere hele aorta og hjertet. Når hjertet og aorta er isolert, kutt alle arterielle grener og vanlige iliaca arterier og etterlater korte segmenter intakte på aorta. Plasser hjertet og aorta på en kontrastbakgrunn ved siden av en linjal og et bilde.</li>
</ol>8. Dataanalyse og rapportering
<ol><li>For å hjelpe til med å ta hensyn til menneskelige feil, mål aortadiametre minst 3 ganger hver når du bruker håndholdte skyvelære, og rapporter deretter diameteren som gjennomsnittsverdien.</li>
	<li>Definer AAA som en 50 % økning i den sunne aortadiameteren. Sørg for å inkludere både brutto aortadiametre og prosentvis endring i diameter i studieresultatene.</li>
</ol>

Vurdering av utvikling av aortaaneurisme hos mus etter elastasebehandling

<ol>
	<li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms.">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li><li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms.">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li><li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms.">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li><li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+aneurysms+and+dissections+series.">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li><li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Therapy+in+Vascular+and+Endovascular+Surgery+E-Book.">Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2014).</li><li>Morgan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+novel+mechanisms+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+unbiased+proteomics+and+systems+biology.">Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).</li><li>Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm.">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li><li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition.">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).</li><li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015)</li><li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening.">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li><li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms.">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li><li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery.">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).</li><li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats.">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li><li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase.">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li><li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase.">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608 (2022).</li></ol>

Forfatterne av dette manuskriptet har ingen interessekonflikter å erklære.

Å forstå den komplekse patofysiologien til AAA er avgjørende for å forbedre behandlingen av aortaaneurismesykdom. Mens nyere strategier utvikles aktivt for å forbedre kirurgiske resultater, er AAA fortsatt utbredt i vårt aldrende samfunn, og aneurismeruptur er fortsatt en ledende dødsårsak i USA10. Derfor garanterer de udekkede behovene i AAA-deteksjon, forebygging og behandlingsstrategier ytterligere grunnleggende aneurismeforskning11.
Dyremodeller som nøyaktig og effektivt rekapitulerer funksjonene og atferden til menneskelige AAA-er er avgjørende for mekanistiske studier av aneurismepatofysiologi og identifisering av potensielle terapeutiske mål. Mens nåværende dyremodeller kan etterligne de viktigste aspektene ved aneurismeendringene som oppstår i menneskelig sykdom, representerer ingen enkelt modell fullt ut den sanne kompleksiteten til menneskelige AAA-er. For tiden er mus den mest aksepterte arten for AAA-modellering av dyr. Forskere bør vurdere de ulike styrkene og svakhetene til hver musemodell for deres spesielle aneurismestudie, slik som de som er ekspertbeskrevet i anmeldelser av Daugherty et al. og Busch et al.12,13.
Bruken av elastase for å indusere AAA hos gnagere ble først beskrevet av Anidjar et al. i 199014. Perfusjon av aorta med bukspyttkjertelelastase hos svin ved hjelp av en sprøytepumpe skaper en innledende utvidelse omtrent mellom 50 % og 70 %, og de utvidede segmentene viser gunstig lignende patologiske trekk ved humane AAA-er, som medial degenerasjon og utilsiktet betennelse. Den klassiske perfusjonsmodellen er imidlertid uten tvil den mest teknisk utfordrende aneurismemodellen, og aneurismene som vanligvis dannes i den andre uken begynner gradvis å forsvinne deretter. Bhamidipati et al. i 2012 demonstrerte deretter at utilsiktet påføring av elastase også med hell kunne indusere lignende aneurismer som er mer reproduserbare i størrelse15. En langt mindre utfordrende modell, den aktuelle elastasemodellen ble mye tatt i bruk i aneurismeforskning. Ytterligere metodikk og fordeler med den aktuelle elastasemodellen er diskutert i metodeartikkelen til Xue og kolleger16.
Elastase/BAPN-modellen av murin AAA ble utviklet av Lu og kolleger i 20178. Innføring av 0,2 % BAPN drikkevann forbedret mange av kritikkene av den klassiske aktuelle elastasemodellen, og produserer nå aneurismer som kontinuerlig utvider seg til punktet med AAA-brudd. I sin studie fra 2017 viste de at mus i den elastase/BAPN-behandlede gruppen hadde signifikant høyere AAA-dannelsesrater sammenlignet med elastasegruppen (93 % mot 65 %, P < 0,01), som også var mer avanserte AAA-er. I løpet av en 100-dagers studieperiode fortsatte AAA-er i elastase/BAPN-gruppen å utvide seg til >800 % baseline-diameter og dannet intraluminal trombe (53,8 %), og 46,2 % sprakk spontant før slutten av eksperimentet. Denne modellen har gjort det mulig for forskere å undersøke faktorer som kan påvirke aneurismeprogresjon og stabilitet over tid.
Berman et al. utforsket videre elastase/BAPN-modellen ved å variere konsentrasjonen av aktuell elastase, studievarighet, tidspunkt for BAPN-administrering og virkningen av dyrekjønn9. Behandling med 5 μL høyere konsentrert elastase (5 mg/ml eller 10 mg/ml) ga større aneurismer enn 2,5 mg/ml over 56 dager. Forekomsten av intraluminal trombedannelse var også avhengig av elastasekonsentrasjonen, som forekom hos 28,6 % av de 5 mg/ml-behandlede musene, og 62,5 % av de 10 mg/ml-behandlede musene. De demonstrerte også at elastase/BAPN-modellen kunne indusere aneurismer hos hunnmus. Selv om bare noen få hunnmus ble studert (n=5), fant de at aneurismene hos hunner var mer utsatt for ruptur (2 av 5 mus) og var betydelig større enn mannlige AAA-er etter 56 dager.
I denne artikkelen tar vi sikte på å gi en metode for å adressere en av de største begrensningene ved kirurgisk modellering, som er variasjonen i den kirurgiske prosedyren. Uten en klar konsensus om graden av disseksjon og området av aorta behandlet med elastase, kan resultatene av denne modellen variere dramatisk mellom dyr, etterforskere og institusjoner. Vi har observert mange anatomiske variasjoner mellom mus, inkludert antall og størrelse på lumbale arterier og vener, og plasseringen av IMA, takeoff av venstre gonadevene, blant andre, som kan være begrensende når man forsøker å behandle bare en del eller et spesifikt segment av den infrarenale aorta. Her demonstrerer vi at perifer dissekering av hele lengden av den infrarenale aorta fra venstre nyrearterie proksimalt til aortabifurkasjonen distalt bidrar til å gi reproduserbare grader av aortaeksponering til tross for anatomiske forskjeller, samtidig som det øker suksessen med aneurismeinduksjon og gir klare grenser for operatøren. I tillegg har størrelsen og den mer fremre posisjonen til IVC en tendens til å dekke et flertall av aorta, noe som kan påvirke mengden aorta som behandles hvis den ikke isoleres fra IVC. Selv om det er nødvendig å fjerne retroperitoneal fascia for å eksponere aorta, er det viktig å ikke dissekere bindevevet til adventitia helt fra aorta og eksponere noen av medielagene, da dette vanligvis resulterer i brudd i løpet av 5 minutters elastaseinkubasjonsperiode. Dette kan tjene som en ekstra intern kontroll til graden av disseksjon med denne modellen, men kan være en frustrerende læringskurve når du tar i bruk denne modellen. Operatører vil i tillegg lære områder med høyere risiko (figur 4) som lett kan bli skadet under operasjonen og føre til ukontrollerbar blødning.
Selv om det er viktig at prosedyretrinnene til denne modellen er konsistente, kan varigheten av studien og tidspunktet for intervallultralyd variere avhengig av målet med forskningen. Aortautvidelse begynner umiddelbart med elastasepåføring, men studier som bruker denne modellen følger vanligvis mus i 28 dager etter operasjonen7, som i dette eksempeleksperimentet. Forlengelse av studievarigheten bør vurderes når man studerer avanserte AAA-er, langsiktig vekst, intraluminal trombedannelse eller ruptur.
Ytterligere perioperative tiltak, som å opprettholde dyrs kroppstemperatur og hydreringsstatus, kan bidra til å forbedre dyrets overlevelse av denne invasive prosedyren. Bruk av varmepute under operasjon og plassering i et varmt restitusjonsbur kan bidra til å unngå hypotermi. Saltvann bør varmes opp før det brukes til å skylle bukhulen. En subkutan væskebolus direkte etter operasjonen kan forklare ufølsomme væsketap under operasjonen, og hjelpe dyret med å opprettholde tilstrekkelig hydrering under den umiddelbare restitusjonsfasen. Med forsiktig vevshåndtering og en konsekvent metodisk tilnærming kan elastase/BAPN-modellen utføres av en erfaren operatør mellom 30 minutter og 45 minutter per mus og pålitelig produsere AAA med svært lave perioperative komplikasjoner.
Våre resultater viser at kombinasjonen av BAPN i tillegg til perifer disseksjon av den infrarenale aorta før påføring av elastase gir store, kontinuerlig ekspanderende AAA-er, med større diametre og bruddforekomst i kortere perioder. I dette eksperimentet ble AAA vellykket indusert hos alle hannmus (6 av 6) og hunnmus (6 av 6) behandlet med aktiv elastase. Elastaseeksponering i 5 minutter resulterte i en umiddelbar økning i aortadiameter med omtrent 30-40 %, noe som er nyttig for å bekrefte vellykket og konsistent elastasepåføring blant behandlingsgrupper. I likhet med Berman et al. har vi vist at denne modellen kan indusere AAA hos hunnmus, som også har en større bruddrespons enn hanner. Halvparten av hunnmusene (3 av 6) sprakk i løpet av 28 dager, sammenlignet med 0 av 6 av hannene, men hunnmus veier mindre enn hannene. Hannmus viste en økning i AAA-diameter med 257 % sammenlignet med -4 % av hannkontrollene, mens de overlevende hunnene viste en diameter på 417 %, sammenlignet med -16 % av hunnkontrollene. Aortadiametre var ikke signifikant forskjellig mellom de overlevende hann- og hunnmusene etter 28 dager på grunn av det høyere antallet rupturer i hunngruppen. Vi spekulerer i at de falske musene viser mindre aortadiametre ved slutten av studien, da aorta har en tendens til å utvide seg litt under den første disseksjonen og deretter danner arrvev etter 28 dager.
Elastase/BAPN-modellen har visse begrensninger. Perifer disseksjon av aorta krever fine kirurgiske ferdigheter, men bidrar likevel til å forbedre replikerbarheten og graden av aneurismeinduksjon. I likhet med den aktuelle elastasemodellen er det også en batcheffekt i elastaseenzymaktivitet, som som nevnt tidligere, derfor er viktig for å utnytte samme flaske elastase til alle dyr i et gitt forsøk. Mens forekomsten av AAA intraluminal trombe og ruptur øker med tiden og aneurismes alvorlighetsgrad, er disse ikke garantert eller fullt forutsigbare i denne modellen.
Oppsummert produserer elastase/BAPN-modellen store, sanne infrarenale AAA-er hos både hann- og hunnmus, som gradvis utvider seg over tid, danner intraluminal trombe og er i stand til å sprekke. Disse styrkene til denne musemodellen bidrar til å bedre rekapitulere noen av atferdene og egenskapene til aneurismer hos mennesker. Selv om det er teknisk vanskelig, kan forsiktig og grundig disseksjon av aorta øke aneurismeresponsen. For tiden er elastase/BAPN-metoden en avansert modell for å studere infrarenale abdominale aortaaneurismer.

En aneurisme er definert som en patologisk utvidelse av en blodåre større enn 50 % av den sunne kardiameteren1. Til tross for at abdominale aortaaneurismer (AAA) er en vanlig tilstand i den aldrende befolkningen, med en forekomst på omtrent >5 % av mennene > 65 år, er det ingen rettede terapeutiske strategier for behandling av AAA1. Nåværende behandling av AAA er begrenset til risikofaktorreduksjon og kirurgisk reparasjon med enten åpen eller endovaskulær kirurgi basert på aortadiameter eller veksthastighet2. Den største faren for AAA er aneurismeruptur, som er dødelig hvis den ikke behandles, og reparasjon i denne nye settingen kan medføre dødelighetsrisiko opp mot 90 %1.
Patofysiologien til AAA er komplisert, multifaktoriell og ikke fullt ut forstått3. Funksjoner ved human AAA inkluderer ekte aneurisme utvidelse av aortaveggen med infiltrasjon av inflammatoriske celler, tilstedeværelsen av intraluminal trombe og progressiv dilatasjon som fører til eventuell ruptur 3,4. I tillegg er AAA assosiert med høy alder, har en 9:1 mannlig:kvinnelig kjønnsdominans, og forekommer oftest i infrarenal aorta5. Modellering av alle funksjoner og atferd til menneskelige AAA-er hos dyr er fortsatt en pågående utfordring6.
Nåværende AAA-modellering utføres først og fremst på mus, og aneurismer induseres ofte ved bruk av en av tre metoder - ved angiotensin II (AngII) infusjon via en subkutant implantert osmotisk pumpe, og ved direkte påføring av kalsiumklorid (CaCl2) eller elastase til aorta7. I sistnevnte metode påføres svinebukspyttkjertelelastase (PPE) på et segment av den infrarenale aorta og forårsaker enzymatisk nedbrytning av elastinfibre i den elastiske lamellen i tunica media. Denne strukturelle skaden resulterer i svekkelse av aortaveggen og ytre aneurisme dilatasjon. Bruk av aktuell elastase alene gir imidlertid relativt små infrarenale aneurismer, som ikke klarer å gradvis forstørres eller sprekke over tid. Mer nylig, Lu et al. forbedret denne modellen ved i tillegg å administrere β-aminopropionitril (BAPN), en irreversibel hemmer av lysyloksidase, til deres elastasebehandlede mus8. Ved å forhindre tverrbinding av elastin- og kollagenfibre, fører BAPN-tilskudd til at elastaseskadede aortas gradvis utvides til bruddpunktet. Elastase/BAPN-modellen har i tillegg høyere forekomst av AAA enn den aktuelle elastasemodellen, og aneurismene som produseres er også større og inneholder intraluminal trombe8.
I elastase/BAPN-modellen kan graden av kirurgisk disseksjon og eksponering av aorta for elastase påvirke suksessen og replikerbarheten til denne modellen. I dette manuskriptet beskriver vi at samtidig administrering av BAPN drikkevann og topisk elastasepåføring på aorta etter omkretsisolering av hele det infrarenale aortasegmentet forbedrer replikerbarheten, tar høyde for anatomiske forskjeller mellom dyr og resulterer i en større AAA-induksjonshastighet, aneurismestørrelser og bruddforekomst. I denne artikkelen vil vi beskrive en standardisert tilnærming for pålitelig indusering av avanserte abdominale aortaaneurismer hos mus ved bruk av en kombinasjon av aktuelt elastase- og BAPN-supplert vann.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 L induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0530XXS</td>
			<td>anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-03</td>
			<td>normal saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309569</td>
			<td>syringe, 22 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A0796</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3134-25G</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Delux gauze sponges, 2&#34; x 2&#34; 4-Ply</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON26224</td>
			<td>gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balding clipper</td>
			<td>Whal Clipper Corporation</td>
			<td>8110</td>
			<td>hair clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Avrio</td>
			<td>NCD 67618-154-16</td>
			<td>betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine ER-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>BERLAB0.5</td>
			<td>buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-131-11</td>
			<td>carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>Castroviejo needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton tipped wood applicators, 6&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>No. 4302</td>
			<td>cotton tipped wood applicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESMARRES 5.5&#39; rectractor&#160;</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6672</td>
			<td>skin rectractor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper, 0-150 mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td>digital caliper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase from porcine pancrease Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1250-10MG</td>
			<td>elastase &#62;4.0 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>ethanol diluted to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>14716</td>
			<td>eye lube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 dry sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>dry bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy mat</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>V016</td>
			<td>heat therapy mat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy pump</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>HTP-1500</td>
			<td>heat therapy pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NCD 59399-106-01</td>
			<td>isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-10 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LTS 0.5-10 uL</td>
			<td>pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile anesthesia mask, small</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td>anesthesia nose cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro dissector scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td>micro dissector scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light</td>
			<td>Nikon Instruments, Inc</td>
			<td>83359 NII-LED</td>
			<td>external dissection light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-661-V</td>
			<td>5-0 nylon suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5</td>
			<td>Ansell</td>
			<td>20685975</td>
			<td>non-latex surgical gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>203-1000</td>
			<td>wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Compass CR2200</td>
			<td>scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnofFlo Accessory Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>10-8000-71</td>
			<td>tubing for electronic vaporizer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoFlo electronic vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SF2992</td>
			<td>low-flow electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoPath Flow Diverter</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SP1016</td>
			<td>flow diverter for electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS/45 sharp forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-4941</td>
			<td>sharp forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6010SC</td>
			<td>surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vessel forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>VES 0.35</td>
			<td>vessel forceps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced abdominal aortic aneurysm modeling in mice by combination of topical elastase and oral &#223;-aminopropionitrile

Den aktuelle elastase-murinmodellen av abdominal aortaaneurisme (AAA) forbedres når den kombineres med ß-aminopropionitril (BAPN)-tilsatt drikkevann for pålitelig å produsere ekte infrarenale aneurismer med atferd som etterligner humane AAA. Lokal påføring av elastase på adventitia av infrarenal aorta forårsaker strukturell skade på de elastiske lagene i aortaveggen og initierer aneurisme dilatasjon. Samtidig administrering av BAPN, en lysyloksidasehemmer, fremmer vedvarende veggdegenerasjon ved å redusere kollagen- og elastintverrbinding. Denne kombinasjonen resulterer i store AAA-er som gradvis utvider seg, danner intraluminal trombe og er i stand til å sprekke. Raffinering av kirurgiske teknikker, som perifer isolering av hele det infrarenale aortasegmentet, kan bidra til å standardisere prosedyren for en konsistent og grundig påføring av bukspyttkjertelelastase hos svin til tross for forskjellige operatører og anatomiske variasjoner mellom mus. Derfor er elastase/BAPN-modellen en raffinert tilnærming til kirurgisk indusering av AAA hos mus, som bedre kan rekapitulere humane aneurismer og gi ytterligere muligheter til å studere aneurismevekst og bruddrisiko.

An aneurysm is defined as a pathologic dilation of a blood vessel greater than 50% of the healthy vessel diameter1. Despite abdominal aortic aneurysms (AAA) being a commonly encountered condition in the aging population, with an incidence of roughly &#62;5% of males &#62; 65 years of age, there are no directed therapeutic strategies for treating AAA1. Current management of AAA is limited to risk factor reduction and surgical repair with either open or endovascular surgery based on aortic diameter or growth rate2. The greatest danger of AAA is aneurysm rupture, which is fatal if untreated, and repair in this emergent setting can carry mortality risks upwards of 90%1.
The pathophysiology of AAA is complicated, multifactorial, and not fully understood3. Features of human AAA include true aneurysmal dilation of the aortic wall with an infiltration of inflammatory cells, the presence of intraluminal thrombus, and progressive dilation that leads to eventual rupture3,4. Additionally, AAAs are associated with advanced age, have a 9:1 male:female sex predominance, and most commonly occur in the infrarenal aorta5. Modeling all features and behaviors of human AAAs in animals remains an ongoing challenge6.
Current AAA modeling is primarily conducted in mice, and aneurysms are commonly induced using one of three methods-by angiotensin II (AngII) infusion via a subcutaneously implanted osmotic pump, and by direct application of calcium chloride (CaCl2) or elastase to the aorta7. In the latter method, porcine pancreatic elastase (PPE) is applied to a segment of the infrarenal aorta and causes enzymatic degradation of elastin fibers within the elastic lamella of the tunica media. This structural damage results in the weakening of the aortic wall and outward aneurysmal dilation. The use of topical elastase alone, however, produces relatively small infrarenal aneurysms, which fail to progressively enlarge or rupture over time. More recently, Lu et al. improved upon this model by additionally administering &#946;-aminopropionitrile (BAPN), an irreversible inhibitor of lysyl oxidase, to their elastase-treated mice8. By preventing the crosslinking of elastin and collagen fibers, BAPN supplementation causes elastase-damaged aortas to progressively dilate to the point of rupture. The elastase/BAPN model additionally has a higher incidence rate of AAA than the topical elastase model, and the aneurysms produced are also larger and contain intraluminal thrombus8.
In the elastase/BAPN model, the degree of surgical dissection and exposure of the aorta to elastase can impact the success and replicability of this model. In this manuscript, we describe that co-administration of BAPN drinking water and topical elastase application to the aorta following circumferential isolation of the entire infrarenal aortic segment improves replicability, accounts for anatomical differences between animals, and results in a greater AAA induction rate, aneurysm sizes and rupture incidence. In this article, we will describe a standardized approach to reliably inducing advanced abdominal aortic aneurysms in mice using a combination of topical elastase- and BAPN-supplemented water.

Forfatter Spotlight: Forbedret murin AAA-modell som bruker elastase for å etterligne menneskelige aneurismer

Avansert modellering av abdominal aortaaneurisme hos mus ved kombinasjon av aktuell elastase og oral ß-aminopropionitril

Our research aims to understand the pathophysiology of abdominal aortic aneurysm. In particular, we like to know in the molecular term how aneurysm ruptures. We believe by modeling aortic aneurysm in mice, males and females, will help us to develop a new treatment for this highly lethal disease that urgently needs pharmacological treatment.The pathophysiology of abdominal aortic aneurysm is multifactorial and complex, which makes animal modeling difficult. The elastase/BAPN model, however, reliably produces aneurysms in mice, which model many of the features and characteristics of the human disease. Combining BAPN drinking water with topical elastase surgery can produce large true infrarenal aneurysms, which form intraluminal thrombus, progressively dilate, and eventually rupture.This allows researchers the opportunity to study features like rupture risk and aneurysm growth.

Hann- og hunnmus C57BL/6J i alderen 22-24 uker ble brukt i denne studien. Infrarenale aortas ble behandlet med 5 μL elastaseenzym (6,9 mg protein/ml, 6 enheter/mg protein) eller denaturert elastase i 5 minutter. Elastase-behandlede hannmus viste en 43,4 % økning i aortadiameter etter 5 minutters eksponering for elastase sammenlignet med ubehandlede aortadiametre ved baseline, mens behandlede kvinnelige aortas økte med 33,6 % (P = 0,0342). Aortadiametre til shams viste relativt ingen endring i løpet av 5 minutters eksponering for denaturert elastase (hanner 0,5 %; hunner -2,8 %). Det var ingen kirurgisk relaterte dødsfall blant de 12 behandlede og 6 falske musene. Data for 28-dagersstudien er vist i tabell 1. Av de kvinnelige behandlede musene døde 3 av 6 av AAA-ruptur; én på postoperativ dag 20 og to på dag 25 (figur 6). Det var ingen AAA-rupturer blant behandlede menn. AAA (definert som en økning >50 % av baseline aortadiameteren eller død ved AAA-ruptur) ble vellykket indusert hos alle behandlede mus (12 av 12). Etter 28 dager var gjennomsnittlig AAA-diameter for behandlede hanner 2,86 ± 0,31 mm, med en gjennomsnittlig endringsprosent på 257 ± 54 %, mens AAA-diametre for de overlevende behandlede hunnmusene var 3,60 ± 1,87 mm, med en gjennomsnittlig prosentvis endring på 417 ± 286 % (figur 7). Falske mus viste relativt ingen endring i aortadiametre.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg"> Figur 6: Overlevelse av hann- og hunnmus av B6 under en 28-dagers elastase/BAPN-modell av AAA. (A) AAA-ruptur oppsto hos 3 av de 6 behandlede hunnmusene, (en mus etter 20 dager, deretter to mus etter 25 dager) mens det ikke var noen rupturer blant de 6 behandlede hannmusene etter 28 dager. (B) Representative bilder ved obduksjon av en hunnmus som døde av AAA-ruptur. AAA-ruptur demonstreres ved et stort retroperitonealt hematom (venstre) og tilstedeværelse av en infrarenal AAA med en veggdefekt (høyre). Forkortelser: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominal aortaaneurisme. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg"> Figur 7: Maksimal aortadiameter for elastase/BAPN og falske hann- og hunnmus B6 etter 28 dager. (A) Behandlede mus viser signifikant større infrarenale diametre etter 28 dager sammenlignet med shams. (B) Kombinasjonen av elastase og BAPN produserer vellykket store infrarenale AAA-er hos både hann- og hunnmus. Forkortelser: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominal aortaaneurisme. Klikk <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td>86 menn Sham</td>
			<td>86 kvinner Sham</td>
			<td>86 mannlig elastase/8APN</td>
			<td>86 hunner Elastase/8APN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Antall mus</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Alder (uker)</td>
			<td>22.3 ± 0.0</td>
			<td>22,7 ± 0,7</td>
			<td>23,1 ± 0,2</td>
			<td>23,2 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Vekt (g; ved operasjon)</td>
			<td>36.3 ± 2.5</td>
			<td>23.7 ± 1.2</td>
			<td>32,8 ± 1,7*</td>
			<td>23,7 ± 0,8</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Aortadiameter før behandling (mm)</td>
			<td>0,89 ± 0,02</td>
			<td>0,75 ± 0,04</td>
			<td>0,81 ± 0,07</td>
			<td>0,73 ± 0,09</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Aortadiameter etter behandling (mm)</td>
			<td>0,90 ± 0,03</td>
			<td>0,73 ± 0,01</td>
			<td>1,15 ± 0,03**</td>
			<td>0,98 ± 0,12**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Prosentvis endring etter 5 min behandling (%)</td>
			<td>0,5 ± 4,4</td>
			<td>-2,8 ± 5,3</td>
			<td>43.4 ± 10.2***</td>
			<td>33,6 ± 4,5***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AAA-forekomst (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">AAA brister etter 28 dager</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Overlevelse til 28 dager</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Maksimal aortadiameter ved 28 dager (mm)</td>
			<td>0,85 ± 0,01</td>
			<td>0,64 ± 0,01</td>
			<td>2,86 ± 0,31*</td>
			<td>3,60 ± 1,87**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Prosentvis endring av aortadiameter etter 28 dager (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Resultater fra en 28-dagers modell av elastase/BAPN murin modell av AAA. Data er gjennomsnittlige ± SD. *P<0,05, **P<0,005, ***P<0,0001 sammenlignet med svindel av samme kjønn via enveis ANOVA Fischers test. Forkortelser: BAPN = ß-aminopropionitril; AAA = abdominal aortaaneurisme.

Denne protokollen beskriver en metodisk kirurgisk tilnærming til modellering av avanserte abdominale aortaaneurismer hos mus ved en kombinasjon av direkte påføring av elastase på infrarenal aorta og administrering av ß-aminopropionitril gjennom drikkevann.

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

advanced-abdominal-aortic-aneurysm-modeling-mice-combination-topical

Research

JoVE Journal

Biology

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking water to reliably produce true infrarenal aneurysms with behaviors that mimic human AAAs. Topically applying elastase to the adventitia of the infrarenal aorta causes structural damage to the elastic layers of the aortic wall and initiates aneurysmal dilation. Co-administering BAPN, a lysyl oxidase inhibitor, promotes sustained wall degeneration by reducing collagen and elastin crosslinking. This combination results in large AAAs that progressively expand, form intraluminal thrombus, and are capable of rupture. Refining surgical techniques, such as circumferentially isolating the entire infrarenal aortic segment, can help standardize the procedure for a consistent and thorough application of porcine pancreatic elastase despite different operators and anatomic variations between mice. Therefore, the elastase/BAPN model is a refined approach to surgically inducing AAA in mice, which may better recapitulate human aneurysms and provide additional opportunities to study aneurysm growth and rupture risk.

This protocol describes a methodical surgical approach to modeling advanced abdominal aortic aneurysms in mice by a combination of directly applying elastase to the infrarenal aorta and administering &#223;-aminopropionitrile through drinking water.

Surgical Approach for Modeling Advanced Abdominal Aortic Aneurysms (AAA) in Mice

To begin, place the anesthetized mouse supine on the surgical field. Apply i-gel and secure the nose cone with surgical tape. Then secure the mouse's front and hind paws with surgical tape.Examine the mouse's lower abdomen for the bladder. To help create space within the abdomen during surgery, induce voiding by gently applying external pressure to the bladder between the thumb, index, and middle fingers. Use a piece of gauze to wick away the urine.Disinfect the abdomen with iodine or a chlorhexidine-based scrub, starting from the center and working outward in a circular motion. Then repeat three times with 70%alcohol. Perform a toe pinch to confirm the depth of the anesthesia.Then place a surgical drape over the mouse with the opening directly over the surgically prepped abdomen. Exchange gloves for sterile gloves. Use a scalpel to make a midline abdominal incision approximately 2-3 centimeters in length.Lift the rectus muscles with forceps to identify the translucent linea alba. Use scissors to enter the abdominal cavity through the linea alba. Then extend along the linea alba proximally and distally.Dampen a strip of gauze and two cotton tipped swabs with warm saline. Create an abdominal roll by tightly rolling one end of the gauze halfway, leaving a generous tail. Using a skin retractor, retract the right abdominal wall.With the help of dampened cotton tipped swabs, perform a right medial visceral rotation by gently sweeping the small and large intestines to the left upper quadrant to visualize the aorta and inferior vena cava. After retracting the bowel out of view, tuck the rolled end of the gauze underneath the bowel. Then bring the tail and around and out of the body to gently swaddle the bowel.Apply gentle tension to the tail of the gauze to hold the bowel out of the field of view. Adjust the abdominal roll and skin retractor to gain an optimal view of the retroperitoneal organs. After confirming that the inferior vena cava and infrarenal aorta are in full view, expose the aorta by entering and dividing the retroperitoneal fascia.Identify the gonadal arteries that run parallel along the anterior infrarenal aorta. Using forceps, bluntly divide the fascia between the gonadal arteries and continue longitudinally to expose the aorta anteriorly. Now, with tips of forceps, gently spread apart the connective tissue fibers between the aorta and inferior vena cava and continue working circumferentially around the aorta at this level.Continue bluntly dissecting the plane between the aorta and inferior vena cava, working caudally toward the aortic bifurcation. Once the right edge of the aorta is separated from the inferior vena cava, return proximally to the level of the left renal vein. Dissect the retroperitoneal fascia off the lateral left edge of the aorta, working circumferentially around until the aorta is fully isolated.After examining the isolated aorta, place a strip of gloves along the right and left edges of the aorta. Using sterile handheld calipers, measure the widest aortic diameter. Dab any extra blood or fluid from the aorta with a cotton tipped swab.Place a 10 x 2 millimeter piece of dry gauze on top of the aorta. Using a pipette, add 5 microliters of elastase to saturate the gauze and aorta. Gently fold the pieces of the glove around the aorta for 5 minutes.After 5 minutes, reset bowel retractions and unfold the pieces of the glove. Irrigate the abdominal cavity with 1 milliliter of warm 0.9%sterile saline while carefully removing the gauze and pieces of gloves from the aorta. Absorb the saline in the abdomen with gauze.Using handheld calipers, remeasure the widest aortic diameter post elastase application. Carefully remove the abdominal roll from underneath the bowel and out of the body. Observe to make sure the bowel appears pink and adequately perfused.Re-approximate the abdominal fascia using a running 5-0 non-absorbable monofilament suture. Close the skin with 3-4 skin staples. Elastase-treated male mice demonstrated a 43.4%increase in aortic diameter after 5 minutes of exposure compared to untreated baseline aortic diameters, while treated female aortas increased by 33.6%Sham mice exhibited relatively no change in aortic diameter.Of the female-treated mice, three of six died from AAA rupture, while no AAA ruptures were observed among treated males. At 28 days, the average AAA diameter of treated males was approximately 2.86 millimeters, with an average percent change of 257. While AAA diameters of surviving treated female mice were 3.6 millimeters, with an average percent change of 417.Sham mice exhibited relatively no change in aortic diameters.