Name: Autor destacado: Modelo AAA murino mejorado que utiliza elastasa para imitar aneurismas humanos
Uploaded: 2024-07-26T13:30:00
Duration: 1 min 21 s
Description: The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

Esta investigación contó con el apoyo del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (NHLBI) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH) bajo el número 1R01HL149404-01A1 (BL), y el Premio Ruth L. Kirschstein del Servicio Nacional de Investigación T32 HL 007936 al Centro de Investigación Cardiovascular (JB) de la Universidad de Wisconsin-Madison. Las figuras fueron creadas o editadas con Biorender.com. El análisis estadístico se realizó con el software GraphPad Prism 10.

Evaluación del desarrollo de aneurisma aórtico en ratones después del tratamiento con elastasa

<ol>
	<li>Kent, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+practice.+Abdominal+aortic+aneurysms.">Clinical practice. Abdominal aortic aneurysms.</a> New Engl J Med. 371 (22), 2101-2208 (2014).</li><li>Wanhainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=European+Society+for+Vascular+Surgery+Guidelines+on+the+management+of+aorto-iliac+abdominal+aortic+aneurysms.">European Society for Vascular Surgery Guidelines on the management of aorto-iliac abdominal aortic aneurysms.</a> Eur J Vasc Endocasc Surg. 57 (1), 8-93 (2019).</li><li>Shimizu, K., Mitchell, R. N., Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cellular+immune+responses+in+abdominal+aortic+aneurysms.">Inflammation and cellular immune responses in abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 26 (5), 987-994 (2006).</li><li>Shen, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aortic+aneurysms+and+dissections+series.">Aortic aneurysms and dissections series.</a> ArteriosclerThromb Vasc Biol. 40 (3), e37-e46 (2020).</li><li>Stanley, J. C., Veith, F., Wakefield, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+Therapy+in+Vascular+and+Endovascular+Surgery+E-Book.">Current Therapy in Vascular and Endovascular Surgery E-Book.</a> Elsevier Health Sciences. , (2014).</li><li>Morgan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identifying+novel+mechanisms+of+abdominal+aortic+aneurysm+via+unbiased+proteomics+and+systems+biology.">Identifying novel mechanisms of abdominal aortic aneurysm via unbiased proteomics and systems biology.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 889994 (2022).</li><li>Yin, L., Kent, E. W., Wang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+murine+models+of+ruptured+abdominal+aortic+aneurysm.">Progress in murine models of ruptured abdominal aortic aneurysm.</a> Front Cardiovasc Med. 9, 950018 (2022).</li><li>Lu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+chronic+advanced+stage+abdominal+aortic+aneurysm+murine+model.">A novel chronic advanced stage abdominal aortic aneurysm murine model.</a> J Vasc Surg. 66 (1), 232-242 (2017).</li><li>Berman, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+aortic+aneurysm+severity+and+growth+depend+on+topical+elastase+concentration+and+lysyl+oxidase+inhibition.">Experimental aortic aneurysm severity and growth depend on topical elastase concentration and lysyl oxidase inhibition.</a> Sci Rep. 12 (1), 99 (2022).</li><li>Deaths, percent of total deaths, and death rates for the 15 leading causes of death in 5-year age groups, by race, and sex. Centers for Disease Control and Prevention Available from: <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm">https://www.cdc.gov/nchs/nvss/mortality/lcwk1.htm</a> (2015)</li><li>Dansey, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+endovascular+and+open+repair+for+abdominal+aortic+aneurysms+in+the+United+States+from+2004+to+2015+and+implications+for+screening.">Epidemiology of endovascular and open repair for abdominal aortic aneurysms in the United States from 2004 to 2015 and implications for screening.</a> J Vasc Surg. 74 (2), 414-424 (2021).</li><li>Daugherty, A., Cassis, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysms.">Mouse models of abdominal aortic aneurysms.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24 (3), 429-434 (2004).</li><li>Busch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translating+mouse+models+of+abdominal+aortic+aneurysm+to+the+translational+needs+of+vascular+surgery.">Translating mouse models of abdominal aortic aneurysm to the translational needs of vascular surgery.</a> JVS Vasc Sci. 2, 219-234 (2021).</li><li>Anidjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elastase-induced+experimental+aneurysms+in+rats.">Elastase-induced experimental aneurysms in rats.</a> Circulation. 82 (3), 973-981 (1990).</li><li>Bhamidipati, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+novel+murine+model+of+aortic+aneurysms+using+peri-adventitial+elastase.">Development of a novel murine model of aortic aneurysms using peri-adventitial elastase.</a> Surgery. 152 (2), 238-246 (2012).</li><li>Xue, C., Zhao, G., Zhao, Y., Chen, Y. E., Zhang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+abdominal+aortic+aneurysm+model+induced+by+perivascular+application+of+elastase.">Mouse abdominal aortic aneurysm model induced by perivascular application of elastase.</a> J Vis Exp. (180), e63608 (2022).</li></ol>

Los autores de este manuscrito no tienen conflictos de intereses que declarar.

Comprender la compleja fisiopatología del AAA es fundamental para mejorar el tratamiento de la enfermedad por aneurisma aórtico. Si bien se desarrollan activamente nuevas estrategias para mejorar los resultados quirúrgicos, los AAA siguen siendo prevalentes en nuestra sociedad envejecida y la ruptura de un aneurisma sigue siendo una de las principales causas de muerte enlos Estados Unidos. Por lo tanto, las necesidades insatisfechas en las estrategias de detección, prevención y tratamiento de AAA justifican una mayor investigación fundamental sobre el aneurisma11.
Los modelos animales que recapitulan de manera precisa y eficiente las características y comportamientos de los AAA humanos son esenciales para los estudios mecanicistas de la fisiopatología de los aneurismas y la identificación de posibles objetivos terapéuticos. Si bien los modelos animales actuales pueden imitar los aspectos principales de los cambios aneurismales que ocurren en las enfermedades humanas, ningún modelo único representa completamente la verdadera complejidad de los AAA humanos. En la actualidad, los ratones son la especie más ampliamente aceptada para el modelado animal de AAA. Los investigadores deben considerar las diversas fortalezas y debilidades de cada modelo murino para su estudio particular de aneurisma, como los descritos por expertos en las revisiones de Daugherty et al. y Busch et al.12,13.
El uso de elastasa para inducir AAA en roedores fue descrito por primera vez por Anidjar et al. en 1990:14. La perfusión de la aorta con elastasa pancreática porcina mediante una bomba de jeringa crea una dilatación inicial de aproximadamente entre el 50% y el 70%, y los segmentos dilatados muestran favorablemente características patológicas similares a las de los AAA humanos, como la degeneración medial y la inflamación adventicia. Sin embargo, el modelo clásico de perfusión es posiblemente el modelo de aneurisma más desafiante desde el punto de vista técnico, y los aneurismas que generalmente se forman en la segunda semana comienzan a resolverse gradualmente a partir de entonces. Bhamidipati et al. en 2012 demostraron que la aplicación adventicial de elastasa también podría inducir con éxito aneurismas similares que son más reproducibles en tamaño15. Un modelo mucho menos desafiante, el modelo de elastasa tópica se adoptó ampliamente en la investigación de aneurismas. La metodología adicional y las ventajas del modelo de elastasa tópica se discuten en el artículo de métodos de Xue y colegas16.
El modelo elastasa/BAPN del AAA murino fue desarrollado por Lu y sus colegas en 20178. La introducción del agua potable con un 0,2% de BAPN mejoró muchas de las críticas al modelo clásico de elastasa tópica, que ahora produce aneurismas que se expanden continuamente hasta el punto de la ruptura del AAA. En su estudio de 2017, demostraron que los ratones del grupo tratado con elastasa/BAPN tenían tasas de formación de AAA significativamente más altas en comparación con el grupo de elastasa (93% frente a 65%, P < 0,01), que también eran AAA en etapas más avanzadas. Durante un período de estudio de 100 días, los AAA en el grupo de elastasa/BAPN continuaron dilatándose hasta un diámetro basal del >800% y formaron trombo intraluminal (53,8%), y el 46,2% se rompieron espontáneamente antes del final del experimento. Este modelo ha permitido a los investigadores investigar factores que pueden afectar la progresión y la estabilidad del aneurisma a lo largo del tiempo.
Berman et al. exploraron más a fondo el modelo de elastasa/BAPN variando la concentración de elastasa tópica, la duración del estudio, el momento de la administración de BAPN y el impacto del sexo del animal9. El tratamiento con 5 μL de elastasa de mayor concentración (5 mg/mL o 10 mg/mL) produjo aneurismas más grandes que 2,5 mg/mL durante 56 días. La prevalencia de la formación de trombos intraluminales también dependió de la concentración de elastasa, que se produjo en el 28,6% de los ratones tratados con 5 mg/mL y en el 62,5% de los ratones tratados con 10 mg/mL. También demostraron que el modelo de elastasa/BAPN podía inducir aneurismas en ratones hembra. Aunque solo se estudiaron unos pocos ratones hembra (n = 5), encontraron que los aneurismas en las hembras eran más propensos a romperse (2 de 5 ratones) y eran significativamente más grandes que los AAA masculinos a los 56 días.
En este artículo, nuestro objetivo es proporcionar un método para abordar una de las mayores limitaciones del modelado quirúrgico, que es la variación en el procedimiento quirúrgico. Sin un consenso claro sobre el grado de disección y el área de la aorta tratada con elastasa, los resultados de este modelo podrían variar drásticamente entre animales, investigadores e instituciones. Hemos observado numerosas variaciones anatómicas entre ratones, incluyendo el número y tamaño de las arterias y venas lumbares, y la localización del IMA, el despegue de la vena gonadal izquierda, entre otras, que pueden ser limitantes cuando se intenta tratar solo una porción o segmento específico de la aorta infrarrenal. Aquí, demostramos que la disección circunferencial de toda la longitud de la aorta infrarrenal desde la arteria renal izquierda proximalmente a la bifurcación aórtica distalmente ayuda a proporcionar grados reproducibles de exposición aórtica a pesar de las diferencias anatómicas, al tiempo que aumenta el éxito de la inducción del aneurisma y proporciona límites claros para el operador. Además, el tamaño y la posición más anterior de la VCI tienden a cubrir la mayor parte de la aorta, lo que puede afectar la cantidad de aorta tratada si no se aísla de la VCI. Si bien es necesario extirpar la fascia retroperitoneal para exponer la aorta, es importante no diseccionar completamente el tejido conectivo de la adventicia de la aorta y exponer ninguna de las capas medias, ya que esto generalmente resulta en una ruptura durante el período de incubación de elastasa de 5 minutos. Esto podría servir como un control interno adicional al grado de disección con este modelo, pero puede ser una curva de aprendizaje frustrante al adoptar este modelo. Además, los operadores aprenderán las áreas de mayor riesgo (Figura 4) que pueden lesionarse fácilmente durante la cirugía y provocar una hemorragia incontrolable.
Si bien es importante que los pasos del procedimiento de este modelo sean coherentes, la duración del estudio y el momento de la ecografía de intervalo pueden variar según el objetivo de la investigación. La dilatación aórtica comienza inmediatamente con la aplicación de elastasa, sin embargo, los estudios que utilizan este modelo suelen seguir a los ratones durante 28 días después de la cirugía7, como en este experimento de ejemplo. Se debe considerar la extensión de la duración del estudio cuando se estudian AAA avanzados, crecimiento a largo plazo, formación de trombos intraluminales o ruptura.
Las medidas perioperatorias adicionales, como mantener la temperatura corporal y el estado de hidratación de los animales, pueden ayudar a mejorar la supervivencia de los animales a este procedimiento invasivo. El uso de una almohadilla térmica durante la cirugía y la colocación en una jaula de recuperación tibia pueden ayudar a evitar la hipotermia. La solución salina debe calentarse antes de usarla para irrigar la cavidad abdominal. Un bolo de líquido subcutáneo inmediatamente después de la cirugía puede explicar pérdidas insensibles de líquido durante la operación y ayudar al animal a mantener una hidratación adecuada durante la fase de recuperación inmediata. Con un manejo cuidadoso de los tejidos y un enfoque metódico consistente, el modelo de elastasa/BAPN puede ser realizado por un operador experimentado entre 30 min y 45 min por ratón y producir de manera confiable AAA con complicaciones perioperatorias muy bajas.
Nuestros resultados demuestran que la combinación de BAPN además de la disección circunferencial de la aorta infrarrenal antes de la aplicación de elastasa produce AAAs grandes y en continua expansión, con diámetros mayores e incidencia de ruptura en períodos más cortos. En este experimento, los AAA se indujeron con éxito en todos los ratones machos (6 de 6) y hembras (6 de 6) tratados con elastasa activa. La exposición a la elastasa durante 5 minutos resultó en un aumento inmediato del diámetro aórtico en aproximadamente un 30-40%, lo que es útil para confirmar la aplicación exitosa y consistente de elastasa entre los grupos de tratamiento. Al igual que Berman et al., hemos demostrado que este modelo puede inducir AAAs en ratones hembra, que también tienen una mayor respuesta a la ruptura que los machos. La mitad de los ratones hembra (3 de 6) se rompieron dentro de los 28 días, en comparación con 0 de 6 de los machos, sin embargo, los ratones hembra pesan menos que los machos. Los ratones machos demostraron un aumento en el diámetro de AAA en un 257% en comparación con el -4% de los controles masculinos, mientras que las hembras sobrevivientes mostraron un aumento del diámetro del 417%, en comparación con el -16% de las hembras de control. Los diámetros aórticos no fueron significativamente diferentes entre los ratones macho y hembra tratados a los 28 días debido al mayor número de rupturas en el grupo de hembras. Especulamos que los ratones simulados exhiben diámetros aórticos más pequeños al final del estudio, ya que la aorta tiende a dilatarse ligeramente durante la disección inicial y luego forma tejido cicatricial a los 28 días.
El modelo elastasa/BAPN posee ciertas limitaciones. La disección circunferencial de la aorta requiere habilidades quirúrgicas finas, pero ayuda a mejorar la replicabilidad y el grado de inducción del aneurisma. Al igual que el modelo de elastasa tópica, también hay un efecto de lote en la actividad de la enzima elastasa, que, como se mencionó anteriormente, es importante utilizar la misma botella de elastasa para todos los animales en un experimento determinado. Si bien la incidencia de trombo y ruptura intraluminal del AAA aumenta con el tiempo y la gravedad del aneurisma, estos no están garantizados ni son totalmente predecibles en este modelo.
En resumen, el modelo de elastasa/BAPN produce AAAs infrarrenales grandes y verdaderos en ratones machos y hembras, que se expanden progresivamente con el tiempo, forman trombos intraluminales y son capaces de romperse. Estas fortalezas de este modelo murino ayudan a recapitular mejor algunos de los comportamientos y características de los aneurismas en humanos. Aunque técnicamente difícil, la disección cuidadosa y completa de la aorta puede aumentar la respuesta aneurismática. En la actualidad, el método elastasa/BAPN es un modelo avanzado para el estudio de los aneurismas de aorta abdominal infrarrenal.

Un aneurisma se define como una dilatación patológica de un vaso sanguíneo mayor del 50% del diámetro del vaso sano1. A pesar de que los aneurismas de aorta abdominal (AAA) son una afección común en la población envejecida, con una incidencia de aproximadamente el >5% de los hombres > 65 años de edad, no existen estrategias terapéuticas dirigidas para tratar el AAA1. El tratamiento actual del AAA se limita a la reducción de los factores de riesgo y a la reparación quirúrgica con cirugía abierta o endovascular basada en el diámetro aórtico o la tasa de crecimiento2. El mayor peligro del AAA es la rotura del aneurisma, que es mortal si no se trata, y la reparación en este entorno emergente puede conllevar riesgos de mortalidad de hasta el 90%1.
La fisiopatología del AAA es complicada, multifactorial y no se comprende completamente3. Las características del AAA humano incluyen una verdadera dilatación aneurismática de la pared aórtica con infiltración de células inflamatorias, la presencia de trombo intraluminal y una dilatación progresiva que conduce a una eventual ruptura 3,4. Además, los AAA se asocian con la edad avanzada, tienen un predominio sexual masculino:femenino de 9:1 y ocurren con mayor frecuencia en la aorta infrarrenal5. Modelar todas las características y comportamientos de los AAA humanos en animales sigue siendo un desafío continuo6.
El modelo actual de AAA se lleva a cabo principalmente en ratones, y los aneurismas se inducen comúnmente utilizando uno de tres métodos: por infusión de angiotensina II (AngII) a través de una bomba osmótica implantada subcutáneamente, y por aplicación directa de cloruro de calcio (CaCl2) o elastasa a la aorta7. En este último método, la elastasa pancreática porcina (EPP) se aplica a un segmento de la aorta infrarrenal y provoca la degradación enzimática de las fibras de elastina dentro de la lámina elástica de la túnica media. Este daño estructural resulta en el debilitamiento de la pared aórtica y la dilatación externa del aneurisma. Sin embargo, el uso de elastasa tópica sola produce aneurismas infrarrenales relativamente pequeños, que no se agrandan ni se rompen progresivamente con el tiempo. Más recientemente, Lu et al. mejoraron este modelo mediante la administración adicional de β-aminopropionitrilo (BAPN), un inhibidor irreversible de la lisil oxidasa, a sus ratones tratados con elastasa. Al evitar la reticulación de las fibras de elastina y colágeno, la suplementación con BAPN hace que las aortas dañadas por la elastasa se dilaten progresivamente hasta el punto de ruptura. Además, el modelo de elastasa/BAPN tiene una mayor tasa de incidencia de AAA que el modelo de elastasa tópica, y los aneurismas producidos también son más grandes y contienen trombo intraluminal8.
En el modelo de elastasa/BAPN, el grado de disección quirúrgica y la exposición de la aorta a la elastasa pueden afectar el éxito y la replicabilidad de este modelo. En este manuscrito, describimos que la co-administración de agua potable de BAPN y la aplicación tópica de elastasa a la aorta después del aislamiento circunferencial de todo el segmento aórtico infrarrenal mejora la replicabilidad, explica las diferencias anatómicas entre animales y da como resultado una mayor tasa de inducción de AAA, tamaños de aneurismas e incidencia de rupturas. En este artículo, describiremos un enfoque estandarizado para inducir de manera confiable aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones utilizando una combinación de elastasa tópica y agua suplementada con BAPN.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 L induction chamber</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0530XXS</td>
			<td>anesthesia induction chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.9% sodicum chloride injection, USP, 20 mL</td>
			<td>Hospira</td>
			<td>NDC 0409-4888-03</td>
			<td>normal saline</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL syringe Luer-Lok Tip with BD PrecisionGlide Needle 22 G x 3/4</td>
			<td>BD</td>
			<td>REF 309569</td>
			<td>syringe, 22 G needle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate</td>
			<td>TCI</td>
			<td>A0796</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Aminopropionitrile Fumarate salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A3134-25G</td>
			<td>BAPN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Avant Delux gauze sponges, 2&#34; x 2&#34; 4-Ply</td>
			<td>Medline</td>
			<td>NON26224</td>
			<td>gauze sponges</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balding clipper</td>
			<td>Whal Clipper Corporation</td>
			<td>8110</td>
			<td>hair clippers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>betadine surgical scrub (povidone-iodine, 7.5%)</td>
			<td>Avrio</td>
			<td>NCD 67618-154-16</td>
			<td>betadine surgical scrub</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blunt forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5130</td>
			<td>blunt forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprenorphine ER-lab</td>
			<td>ZooPharm</td>
			<td>BERLAB0.5</td>
			<td>buprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>carprofen</td>
			<td>Norbrook</td>
			<td>NDC 55529-131-11</td>
			<td>carprofen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CASTROVIEJO 5.75&#34; straight with lock</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6412</td>
			<td>Castroviejo needle driver</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton tipped wood applicators, 6&#34;</td>
			<td>Dynarex</td>
			<td>No. 4302</td>
			<td>cotton tipped wood applicators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DESMARRES 5.5&#39; rectractor&#160;</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6672</td>
			<td>skin rectractor&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>digital caliper, 0-150 mm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>501601</td>
			<td>digital caliper</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>DPBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elastase from porcine pancrease Type I</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E1250-10MG</td>
			<td>elastase &#62;4.0 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Labs, Inc</td>
			<td>2701</td>
			<td>ethanol diluted to 70%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>eye lube</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td>14716</td>
			<td>eye lube</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Germinator 500 dry sterilizer</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>5-1450</td>
			<td>dry bead sterilizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy mat</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>V016</td>
			<td>heat therapy mat</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat therapy pump</td>
			<td>Adroit Medical Systems</td>
			<td>HTP-1500</td>
			<td>heat therapy pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>isoflurane, USP</td>
			<td>Akorn Animal Health</td>
			<td>NCD 59399-106-01</td>
			<td>isoflurane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-10 pipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>LTS 0.5-10 uL</td>
			<td>pipette</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low profile anesthesia mask, small</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SOMNO-0801</td>
			<td>anesthesia nose cone</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>micro dissector scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-5619</td>
			<td>micro dissector scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>S9i</td>
			<td>microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nii-LED high intensity LED illuminatorLED exertnal light</td>
			<td>Nikon Instruments, Inc</td>
			<td>83359 NII-LED</td>
			<td>external dissection light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>nylon 5-0 monofilament, black non-absorbable suture</td>
			<td>Oasis</td>
			<td>MV-661-V</td>
			<td>5-0 nylon suture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyisoprene surgical gloves, GAMMEX Non-Latex PI Micro, size 7.5</td>
			<td>Ansell</td>
			<td>20685975</td>
			<td>non-latex surgical gloves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reflex 7 mm stainless steel wound clips</td>
			<td>CellPoint Scientific, Inc</td>
			<td>203-1000</td>
			<td>wound clips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>scale</td>
			<td>Ohaus</td>
			<td>Compass CR2200</td>
			<td>scale</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnofFlo Accessory Kit</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>10-8000-71</td>
			<td>tubing for electronic vaporizer&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoFlo electronic vaporizer</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SF2992</td>
			<td>low-flow electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SomnoPath Flow Diverter</td>
			<td>Kent Scientific Corporation</td>
			<td>SP1016</td>
			<td>flow diverter for electronic vaporizer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SS/45 sharp forceps</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-4941</td>
			<td>sharp forceps</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>surgical scissors</td>
			<td>ROBOZ</td>
			<td>RS-6010SC</td>
			<td>surgical scissors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>vessel forceps</td>
			<td>Dumont</td>
			<td>VES 0.35</td>
			<td>vessel forceps</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

advanced abdominal aortic aneurysm modeling in mice by combination of topical elastase and oral &#223;-aminopropionitrile

El modelo murino de elastasa tópica de aneurisma de aorta abdominal (AAA) mejora cuando se combina con agua potable suplementada con ß-aminopropionitrilo (BAPN) para producir de manera confiable verdaderos aneurismas infrarrenales con comportamientos que imitan los AAA humanos. La aplicación tópica de elastasa a la adventicia de la aorta infrarrenal provoca daño estructural en las capas elásticas de la pared aórtica e inicia la dilatación del aneurisma. La coadministración de BAPN, un inhibidor de la lisil oxidasa, promueve la degeneración sostenida de la pared al reducir la reticulación de colágeno y elastina. Esta combinación da lugar a grandes AAA que se expanden progresivamente, forman trombos intraluminales y son capaces de romperse. El perfeccionamiento de las técnicas quirúrgicas, como el aislamiento circunferencial de todo el segmento aórtico infrarrenal, puede ayudar a estandarizar el procedimiento para una aplicación consistente y completa de la elastasa pancreática porcina a pesar de los diferentes operadores y las variaciones anatómicas entre ratones. Por lo tanto, el modelo de elastasa/BAPN es un enfoque refinado para la inducción quirúrgica de AAA en ratones, que puede recapitular mejor los aneurismas humanos y proporcionar oportunidades adicionales para estudiar el crecimiento de los aneurismas y el riesgo de ruptura.

An aneurysm is defined as a pathologic dilation of a blood vessel greater than 50% of the healthy vessel diameter1. Despite abdominal aortic aneurysms (AAA) being a commonly encountered condition in the aging population, with an incidence of roughly &#62;5% of males &#62; 65 years of age, there are no directed therapeutic strategies for treating AAA1. Current management of AAA is limited to risk factor reduction and surgical repair with either open or endovascular surgery based on aortic diameter or growth rate2. The greatest danger of AAA is aneurysm rupture, which is fatal if untreated, and repair in this emergent setting can carry mortality risks upwards of 90%1.
The pathophysiology of AAA is complicated, multifactorial, and not fully understood3. Features of human AAA include true aneurysmal dilation of the aortic wall with an infiltration of inflammatory cells, the presence of intraluminal thrombus, and progressive dilation that leads to eventual rupture3,4. Additionally, AAAs are associated with advanced age, have a 9:1 male:female sex predominance, and most commonly occur in the infrarenal aorta5. Modeling all features and behaviors of human AAAs in animals remains an ongoing challenge6.
Current AAA modeling is primarily conducted in mice, and aneurysms are commonly induced using one of three methods-by angiotensin II (AngII) infusion via a subcutaneously implanted osmotic pump, and by direct application of calcium chloride (CaCl2) or elastase to the aorta7. In the latter method, porcine pancreatic elastase (PPE) is applied to a segment of the infrarenal aorta and causes enzymatic degradation of elastin fibers within the elastic lamella of the tunica media. This structural damage results in the weakening of the aortic wall and outward aneurysmal dilation. The use of topical elastase alone, however, produces relatively small infrarenal aneurysms, which fail to progressively enlarge or rupture over time. More recently, Lu et al. improved upon this model by additionally administering &#946;-aminopropionitrile (BAPN), an irreversible inhibitor of lysyl oxidase, to their elastase-treated mice8. By preventing the crosslinking of elastin and collagen fibers, BAPN supplementation causes elastase-damaged aortas to progressively dilate to the point of rupture. The elastase/BAPN model additionally has a higher incidence rate of AAA than the topical elastase model, and the aneurysms produced are also larger and contain intraluminal thrombus8.
In the elastase/BAPN model, the degree of surgical dissection and exposure of the aorta to elastase can impact the success and replicability of this model. In this manuscript, we describe that co-administration of BAPN drinking water and topical elastase application to the aorta following circumferential isolation of the entire infrarenal aortic segment improves replicability, accounts for anatomical differences between animals, and results in a greater AAA induction rate, aneurysm sizes and rupture incidence. In this article, we will describe a standardized approach to reliably inducing advanced abdominal aortic aneurysms in mice using a combination of topical elastase- and BAPN-supplemented water.

Autor destacado: Modelo AAA murino mejorado que utiliza elastasa para imitar aneurismas humanos

Modelado avanzado de aneurisma de aorta abdominal en ratones mediante combinación de elastasa tópica y ß-aminopropionitrilo oral

Our research aims to understand the pathophysiology of abdominal aortic aneurysm. In particular, we like to know in the molecular term how aneurysm ruptures. We believe by modeling aortic aneurysm in mice, males and females, will help us to develop a new treatment for this highly lethal disease that urgently needs pharmacological treatment.The pathophysiology of abdominal aortic aneurysm is multifactorial and complex, which makes animal modeling difficult. The elastase/BAPN model, however, reliably produces aneurysms in mice, which model many of the features and characteristics of the human disease. Combining BAPN drinking water with topical elastase surgery can produce large true infrarenal aneurysms, which form intraluminal thrombus, progressively dilate, and eventually rupture.This allows researchers the opportunity to study features like rupture risk and aneurysm growth.

En este estudio se utilizaron ratones machos y hembras C57BL/6J de 22 a 24 semanas de edad. Las aortas infrarrenales se trataron con 5 μL de enzima elastasa (6,9 mg de proteína/mL, 6 unidades/mg de proteína) o elastasa desnaturalizada durante 5 min. Los ratones machos tratados con elastaso mostraron un aumento del 43,4% en el diámetro aórtico después de 5 minutos de exposición a la elastasa en comparación con los diámetros aórticos basales no tratados, mientras que las aortas femeninas tratadas aumentaron un 33,6% (P = 0,0342). Los diámetros aórticos de las mascarillas no mostraron cambios durante 5 minutos de exposición a la elastasa desnaturalizada (hombres 0,5%; mujeres -2,8%). No hubo muertes relacionadas con la cirugía entre los 12 ratones tratados y los 6 ratones simulados. Los datos del estudio de 28 días se muestran en la Tabla 1. De los ratones hembra tratados, 3 de 6 murieron por rotura de AAA; uno el día 20 del postoperatorio y dos el día 25 (Figura 6). No hubo rupturas de AAA entre los hombres tratados. Los AAA (definidos como un aumento >50% del diámetro basal de la aorta o la muerte por ruptura de AAA) se indujeron con éxito en todos los ratones tratados (12 de 12). A los 28 días, el diámetro promedio de AAA de los machos tratados fue de 2,86 ± 0,31 mm, con un cambio porcentual promedio de 257 ± 54%, mientras que los diámetros de AAA de los ratones hembra tratados sobrevivientes fueron de 3,60 ± 1,87 mm, con un cambio porcentual promedio de 417 ± 286% (Figura 7). Los ratones simulados no mostraron relativamente ningún cambio en los diámetros aórticos.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig06.jpg"> Figura 6: Supervivencia de ratones B6 machos y hembras durante un modelo de elastasa/BAPN de AAA de 28 días. (A) La ruptura de AAA ocurrió en 3 de los 6 ratones hembra tratados (un ratón a los 20 días, luego dos ratones a los 25 días), mientras que no hubo rupturas entre los 6 ratones machos tratados a los 28 días. (B) Imágenes representativas en la necropsia de un ratón hembra que murió por rotura de AAA. La rotura del AAA se manifiesta por un gran hematoma retroperitoneal (izquierda) y la presencia de un AAA infrarrenal con un defecto de la pared (derecha). Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrilo; AAA = aneurisma de aorta abdominal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66812/66812fig07.jpg"> Figura 7: Diámetros aórticos máximos de elastasa/BAPN y ratones B6 machos y hembras simulados a los 28 días. (A) Los ratones tratados exhiben diámetros infrarrenales significativamente mayores a los 28 días en comparación con los simulados. (B) La combinación de elastasa y BAPN produce con éxito grandes AAA infrarrenales en ratones B6 machos y hembras. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrilo; AAA = aneurisma de aorta abdominal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66812/66812fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"></td>
			<td>86 hombres Sham</td>
			<td>86 Mujer Sham</td>
			<td>86 elastaso macho/8APN</td>
			<td>86 elastaso hembra/8APN</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Número de ratones</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Edad (semanas)</td>
			<td>22,3 ± 0,0</td>
			<td>22,7 ± 0,7</td>
			<td>23,1 ± 0,2</td>
			<td>23,2 ± 0,2</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Peso (g; en el momento de la cirugía)</td>
			<td>36,3 ± 2,5</td>
			<td>23,7 ± 1,2</td>
			<td>32,8 ± 1,7*</td>
			<td>23,7 ± 0,8</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diámetro aórtico previo al tratamiento (mm)</td>
			<td>0,89 ± 0,02</td>
			<td>0,75 ± 0,04</td>
			<td>0,81 ± 0,07</td>
			<td>0,73 ± 0,09</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diámetro aórtico post-tratamiento (mm)</td>
			<td>0,90 ± 0,03</td>
			<td>0,73 ± 0,01</td>
			<td>1,15 ± 0,03**</td>
			<td>0,98 ± 0,12**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Cambio porcentual después de 5 min de tratamiento (%)</td>
			<td>0,5 ± 4,4</td>
			<td>-2,8 ± 5,3</td>
			<td>43,4 ± 10,2***</td>
			<td>33,6 ± 4,5***</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Incidencia de AAA (%)</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>6 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">El AAA se rompe a los 28 días</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 3</td>
			<td>0 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Supervivencia hasta 28 días</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>3 / 3</td>
			<td>6 / 6</td>
			<td>3 / 6</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Diámetro aórtico máximo a los 28 días (mm)</td>
			<td>0,85 ± 0,01</td>
			<td>0,64 ± 0,01</td>
			<td>2,86 ± 0,31*</td>
			<td>3,60 ± 1,87**</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Cambio porcentual del diámetro aórtico a los 28 días (%)</td>
			<td>-4 ± 2</td>
			<td>-16 ± 2</td>
			<td>257 ± 54*</td>
			<td>417 ± 286**</td>
		</tr></tbody></table>Tabla 1: Resultados de un modelo de 28 días del modelo murino de elastasa/BAPN de AAA. Los datos se ± media de DE. *P<0.05, **P<0.005, ***P<0.0001 en comparación con simulacros del mismo sexo a través de la prueba de Fischer ANOVA de un factor. Abreviaturas: BAPN = ß-aminopropionitrilo; AAA = aneurisma de aorta abdominal.

Este protocolo describe un enfoque quirúrgico metódico para modelar aneurismas de aorta abdominal avanzados en ratones mediante una combinación de aplicación directa de elastasa a la aorta infrarrenal y administración de ß-aminopropionitrilo a través del agua potable.

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking ...

advanced-abdominal-aortic-aneurysm-modeling-mice-combination-topical

Research

JoVE Journal

Biology

Advanced Abdominal Aortic Aneurysm Modeling in Mice by Combination of Topical Elastase and Oral &#223;-aminopropionitrile

The topical elastase murine model of abdominal aortic aneurysm (AAA) is enhanced when combined with &#223;-aminopropionitrile (BAPN)-supplemented drinking water to reliably produce true infrarenal aneurysms with behaviors that mimic human AAAs. Topically applying elastase to the adventitia of the infrarenal aorta causes structural damage to the elastic layers of the aortic wall and initiates aneurysmal dilation. Co-administering BAPN, a lysyl oxidase inhibitor, promotes sustained wall degeneration by reducing collagen and elastin crosslinking. This combination results in large AAAs that progressively expand, form intraluminal thrombus, and are capable of rupture. Refining surgical techniques, such as circumferentially isolating the entire infrarenal aortic segment, can help standardize the procedure for a consistent and thorough application of porcine pancreatic elastase despite different operators and anatomic variations between mice. Therefore, the elastase/BAPN model is a refined approach to surgically inducing AAA in mice, which may better recapitulate human aneurysms and provide additional opportunities to study aneurysm growth and rupture risk.

This protocol describes a methodical surgical approach to modeling advanced abdominal aortic aneurysms in mice by a combination of directly applying elastase to the infrarenal aorta and administering &#223;-aminopropionitrile through drinking water.

Investigación

Biología

Surgical Approach for Modeling Advanced Abdominal Aortic Aneurysms (AAA) in Mice

To begin, place the anesthetized mouse supine on the surgical field. Apply i-gel and secure the nose cone with surgical tape. Then secure the mouse's front and hind paws with surgical tape.Examine the mouse's lower abdomen for the bladder. To help create space within the abdomen during surgery, induce voiding by gently applying external pressure to the bladder between the thumb, index, and middle fingers. Use a piece of gauze to wick away the urine.Disinfect the abdomen with iodine or a chlorhexidine-based scrub, starting from the center and working outward in a circular motion. Then repeat three times with 70%alcohol. Perform a toe pinch to confirm the depth of the anesthesia.Then place a surgical drape over the mouse with the opening directly over the surgically prepped abdomen. Exchange gloves for sterile gloves. Use a scalpel to make a midline abdominal incision approximately 2-3 centimeters in length.Lift the rectus muscles with forceps to identify the translucent linea alba. Use scissors to enter the abdominal cavity through the linea alba. Then extend along the linea alba proximally and distally.Dampen a strip of gauze and two cotton tipped swabs with warm saline. Create an abdominal roll by tightly rolling one end of the gauze halfway, leaving a generous tail. Using a skin retractor, retract the right abdominal wall.With the help of dampened cotton tipped swabs, perform a right medial visceral rotation by gently sweeping the small and large intestines to the left upper quadrant to visualize the aorta and inferior vena cava. After retracting the bowel out of view, tuck the rolled end of the gauze underneath the bowel. Then bring the tail and around and out of the body to gently swaddle the bowel.Apply gentle tension to the tail of the gauze to hold the bowel out of the field of view. Adjust the abdominal roll and skin retractor to gain an optimal view of the retroperitoneal organs. After confirming that the inferior vena cava and infrarenal aorta are in full view, expose the aorta by entering and dividing the retroperitoneal fascia.Identify the gonadal arteries that run parallel along the anterior infrarenal aorta. Using forceps, bluntly divide the fascia between the gonadal arteries and continue longitudinally to expose the aorta anteriorly. Now, with tips of forceps, gently spread apart the connective tissue fibers between the aorta and inferior vena cava and continue working circumferentially around the aorta at this level.Continue bluntly dissecting the plane between the aorta and inferior vena cava, working caudally toward the aortic bifurcation. Once the right edge of the aorta is separated from the inferior vena cava, return proximally to the level of the left renal vein. Dissect the retroperitoneal fascia off the lateral left edge of the aorta, working circumferentially around until the aorta is fully isolated.After examining the isolated aorta, place a strip of gloves along the right and left edges of the aorta. Using sterile handheld calipers, measure the widest aortic diameter. Dab any extra blood or fluid from the aorta with a cotton tipped swab.Place a 10 x 2 millimeter piece of dry gauze on top of the aorta. Using a pipette, add 5 microliters of elastase to saturate the gauze and aorta. Gently fold the pieces of the glove around the aorta for 5 minutes.After 5 minutes, reset bowel retractions and unfold the pieces of the glove. Irrigate the abdominal cavity with 1 milliliter of warm 0.9%sterile saline while carefully removing the gauze and pieces of gloves from the aorta. Absorb the saline in the abdomen with gauze.Using handheld calipers, remeasure the widest aortic diameter post elastase application. Carefully remove the abdominal roll from underneath the bowel and out of the body. Observe to make sure the bowel appears pink and adequately perfused.Re-approximate the abdominal fascia using a running 5-0 non-absorbable monofilament suture. Close the skin with 3-4 skin staples. Elastase-treated male mice demonstrated a 43.4%increase in aortic diameter after 5 minutes of exposure compared to untreated baseline aortic diameters, while treated female aortas increased by 33.6%Sham mice exhibited relatively no change in aortic diameter.Of the female-treated mice, three of six died from AAA rupture, while no AAA ruptures were observed among treated males. At 28 days, the average AAA diameter of treated males was approximately 2.86 millimeters, with an average percent change of 257. While AAA diameters of surviving treated female mice were 3.6 millimeters, with an average percent change of 417.Sham mice exhibited relatively no change in aortic diameters.