Dit werk werd ondersteund door een NSF Grant (2152065) en een NSF CAREER Award (1846857). De auteurs willen alle huidige en voormalige leden van het Wachs Lab bedanken voor hun bijdrage aan dit protocol. De diagrammen in figuur 1 zijn gemaakt in Biorender.

De DRG-oogst werd uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) van de Universiteit van Nebraska-Lincoln. Vrouwelijke Sprague Dawley-ratten van 12 weken (~250 g) werden gebruikt voor het onderzoek. De details van de dieren, reagentia en apparatuur die in het onderzoek zijn gebruikt, staan vermeld in de materiaaltabel.
1. Fabricage en assemblage van apparaten met meerdere compartimenten
<ol><li>Computerondersteund o...

Geavanceerd in vitro model voor het bestuderen van neuronale overgevoeligheid in DRG-culturen

<ol>
	<li>Vos, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global,+regional,+and+national+incidence,+prevalence,+and+years+lived+with+disability+for+310+diseases+and+injuries,+1990-2015:+A+systematic+analysis+for+the+global+burden+of+disease+study+2015.">Global, regional, and national incidence, prevalence, and years lived with disability for 310 diseases and injuries, 1990-2015: A systematic analysis for the global burden of disease study 2015.</a> Lancet. 388 (10053), 1545-1602 (2016).</li><li>Goldberg, D. S., Mcgee, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pain+as+a+global+public+health+priority.">Pain as a global public health priority.</a> BMC Public Health. 11 (1), 770 (2011).</li><li>Gaskin, D. J., Richard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+economic+costs+of+pain+in+the+United+States.">The economic costs of pain in the United States.</a> J Pain. 13 (8), 715-724 (2012).</li><li>Kim, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupled+activation+of+primary+sensory+neurons+contributes+to+chronic+pain.">Coupled activation of primary sensory neurons contributes to chronic pain.</a> Neuron. 91 (5), 1085-1096 (2016).</li><li>Im, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alteration+of+sensory+neurons+and+spinal+response+to+an+experimental+osteoarthritis+pain+model.">Alteration of sensory neurons and spinal response to an experimental osteoarthritis pain model.</a> Arthritis Rheum. 62 (10), 2995-3005 (2010).</li><li>Jensen, T. S., Finnerup, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allodynia+and+hyperalgesia+in+neuropathic+pain:+Clinical+manifestations+and+mechanisms.">Allodynia and hyperalgesia in neuropathic pain: Clinical manifestations and mechanisms.</a> Lancet Neurol. 13 (9), 924-935 (2014).</li><li>Berge, O. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predictive+validity+of+behavioral+animal+models+for+chronic+pain.">Predictive validity of behavioral animal models for chronic pain.</a> Br J Pharmacol. 164 (4), 1195-1206 (2011).</li><li>Anderson, W. A., Willenberg, A. R., Bosak, A. J., Willenberg, B. J., Lambert, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+capillary+alginate+gel+(capgel&#8482;)+to+study+the+three-dimensional+development+of+sensory+nerves+reveals+the+formation+of+a+rudimentary+perineurium.">Use of a capillary alginate gel (capgel&#8482;) to study the three-dimensional development of sensory nerves reveals the formation of a rudimentary perineurium.</a> J Neurosci Methods. 305, 46-53 (2018).</li><li>Mohammed Izham, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+possibilities+of+using+in+vitro+model+for+neuropathic+pain+studies.">Exploring the possibilities of using in vitro model for neuropathic pain studies.</a> Neurosci Res Notes. 5, 144 (2022).</li><li>Park, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+three-dimensional+in+vitro+model+of+the+peripheral+nervous+system.">A three-dimensional in vitro model of the peripheral nervous system.</a> NPG Asia Mater. 13 (1), 2 (2021).</li><li>Caparaso, S. M., Redwine, A. L., Wachs, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+a+multi-compartment+in+vitro+model+for+dorsal+root+ganglia+phenotypic+assessment.">Engineering a multi-compartment in vitro model for dorsal root ganglia phenotypic assessment.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 111 (11), 1903-1920 (2023).</li><li>Krug, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+human+neurite+growth+assay+as+specific+screen+for+developmental+neurotoxicants.">Evaluation of a human neurite growth assay as specific screen for developmental neurotoxicants.</a> Arch Toxicol. 87 (12), 2215-2231 (2013).</li><li>F, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+matrix+stiffness+negatively+affects+axon+elongation,+growth+cone+area+and+F-actin+levels+in+a+collagen+type+I+3D+culture.">Extracellular matrix stiffness negatively affects axon elongation, growth cone area and F-actin levels in a collagen type I 3D culture.</a> J Tissue Eng Regen Med. 16 (2), 151-162 (2021).</li><li>Spearman, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunable+methacrylated+hyaluronic+acid-based+hydrogels+as+scaffolds+for+soft+tissue+engineering+applications.">Tunable methacrylated hyaluronic acid-based hydrogels as scaffolds for soft tissue engineering applications.</a> J Biomed Mater Res A. 108 (2), 279-291 (2020).</li><li>Zhu, W., Oxford, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+of+neonatal+and+adult+DRG+neurons+correlates+with+the+differential+sensitization+of+TRPV1+responses+to+nerve+growth+factor.">Differential gene expression of neonatal and adult DRG neurons correlates with the differential sensitization of TRPV1 responses to nerve growth factor.</a> Neurosci Lett. 500 (3), 192-196 (2011).</li><li>Van De Wijdeven, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structuring+a+multi-nodal+neural+network+in+vitro+within+a+novel+design+microfluidic+chip.">Structuring a multi-nodal neural network in vitro within a novel design microfluidic chip.</a> Biomed Microdevices. 20, 1-8 (2018).</li><li>Chan, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NGF+controls+axonal+receptivity+to+myelination+by+Schwann+cells+or+oligodendrocytes.">NGF controls axonal receptivity to myelination by Schwann cells or oligodendrocytes.</a> Neuron. 43 (2), 183-191 (2004).</li><li>Ng, B. K., Chen, L., Mandemakers, W., Cosgaya, J. M., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterograde+transport+and+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+along+sensory+axons+promote+Schwann+cell+myelination.">Anterograde transport and secretion of brain-derived neurotrophic factor along sensory axons promote Schwann cell myelination.</a> J Neurosci. 27 (28), 7597-7603 (2007).</li><li>Xiao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BDNF+exerts+contrasting+effects+on+peripheral+myelination+of+NGF-dependent+and+BDNF-dependent+drg+neurons.">BDNF exerts contrasting effects on peripheral myelination of NGF-dependent and BDNF-dependent drg neurons.</a> J Neurosci. 29 (13), 4016-4022 (2009).</li><li>Seidlits, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+hyaluronic+acid+hydrogels+with+tunable+mechanical+properties+on+neural+progenitor+cell+differentiation.">The effects of hyaluronic acid hydrogels with tunable mechanical properties on neural progenitor cell differentiation.</a> Biomaterials. 31 (14), 3930-3940 (2010).</li><li>Tomal, W., Ortyl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Water-soluble+photoinitiators+in+biomedical+applications.">Water-soluble photoinitiators in biomedical applications.</a> Polymers. 12 (5), 1073 (2020).</li><li>Leary, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Avma guidelines for the euthanasia of animals: 2013 edition. , (2013).</li><li>Sleigh, J. N., Weir, G. A., Schiavo, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple,+step-by-step+dissection+protocol+for+the+rapid+isolation+of+mouse+dorsal+root+ganglia.">A simple, step-by-step dissection protocol for the rapid isolation of mouse dorsal root ganglia.</a> BMC Res Notes. 9 (1), 82 (2016).</li><li>Naveed, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+methods+of+dissection+protocols+for+the+rapid+isolation+of+rat+dorsal+root+ganglia+under+the+non-microscopic+condition.">Simple methods of dissection protocols for the rapid isolation of rat dorsal root ganglia under the non-microscopic condition.</a> Neuroscience Research Notes. 6 (2), 212 (2023).</li><li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release.">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2 (1), 100333 (2021).</li><li>Bai, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-resolution+anatomical+rat+atlas.">A high-resolution anatomical rat atlas.</a> J Anatomy. 209 (5), 707-708 (2006).</li><li>Bian, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+influence+of+hyaluronic+acid+hydrogel+crosslinking+density+and+macromolecular+diffusivity+on+human+MSC+chondrogenesis+and+hypertrophy.">The influence of hyaluronic acid hydrogel crosslinking density and macromolecular diffusivity on human MSC chondrogenesis and hypertrophy.</a> Biomaterials. 34 (2), 413-421 (2013).</li><li>Haberberger, R. V., Barry, C., Dominguez, N., Matusica, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+dorsal+root+ganglia.">Human dorsal root ganglia.</a> Front Cell Neurosci. 13, 271 (2019).</li><li>Schwaid, A. G., Krasowka-Zoladek, A., Chi, A., Cornella-Taracido, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+rat+and+human+dorsal+root+ganglion+proteome.">Comparison of the rat and human dorsal root ganglion proteome.</a> Scientific Rep. 8 (1), 13469 (2018).</li></ol>

De auteurs van deze studie verklaren dat ze geen belangenconflict hebben.

Dit protocol schetst een methode om volwassen Sprague Dawley DRG's te oogsten en ze te kweken in natuurlijke 3D-hydrogels. In tegenstelling tot deze methode omvatten andere benaderingen voor het oogsten van DRG's van muizen en ratten het isoleren van de wervelkolom. De uitgesneden wervelkolom wordt gehalveerd en het ruggenmerg wordt verwijderd om DRG's 23,24,25 bloot te leggen. Schade aan het ruggenmerg beperkt de bloedtoevoer, ...

Chronische pijn is wereldwijd de belangrijkste oorzaak van arbeidsongeschiktheid en verlies van werk1. Chronische pijn treft ongeveer 20% van de volwassenen wereldwijd en legt een aanzienlijke maatschappelijke en economische lastop 2, met totale kosten die in de Verenigde Staten elk jaar tussen $ 560 en $ 635 miljard worden geschat3.
Het belangrijkste perifere kenmerk van chronische pijnpatiënten is een verlaagde stimulatiedrempel van zenuwen, wat ertoe leidt dat het zenuwstelsel beter reageert op stimuli 4,5. De verlaagde stimulatiedrempel kan resulteren in een pijnlijke reactie op een voorheen niet-pijnlijke stimulus (allodynie) of een verhoogde respons op een pijnlijke stimulus (hyperalgesie)6. De huidige behandelingen voor chronische pijn hebben een beperkte werkzaamheid, en behandelingen die slagen in diermodellen falen vaak in proeven bij mensen vanwege mechanistische verschillen in pijnmanifestatie7. In vitro modellen die perifere sensibilisatiemechanismen nauwkeuriger kunnen nabootsen, hebben het potentieel om de vertaling van nieuwe therapieën te verhogen 8,9. Verder, door het modelleren van belangrijke aspecten van gesensibiliseerde zenuwen in een kweeksysteem, zouden onderzoekers een dieper begrip kunnen ontwikkelen van de mechanismen die verlaagde drempels veroorzaken en nieuwe therapeutische doelen kunnen identificeren die deze omkeren10.
De ideale in vitro platforms of microfysiologische systemen zouden de fysieke scheiding van distale neurieten en dorsale wortelganglia (DRG) cellichaam, een driedimensionale (3D) cellulaire omgeving en de aanwezigheid van native ondersteunende cellen omvatten om in vivo omstandigheden nauwkeurig na te bootsen. Een recent artikel van Caparaso et al.11 toont echter aan dat de huidige DRG-cultuurplatforms een of meer van deze belangrijke kenmerken missen, waardoor ze onvoldoende zijn om in vivo omstandigheden te repliceren. Hoewel deze platforms eenvoudig in te stellen zijn, bootsen ze de biologische basis van perifere sensibilisatie niet na en vertalen ze zich dus mogelijk niet naar in vivo werkzaamheid. Om deze beperking aan te pakken, is een fysiologisch relevant in vitro model ontwikkeld voor de kweek van dorsale wortelganglia (DRG) binnen een hydrogelmatrix met drie geïsoleerde compartimenten om temporele vloeistofisolatie van neurieten en DRG-cellichamen mogelijk te maken11. Dit model biedt zowel fysiologische als anatomische relevantie, wat het potentieel heeft om perifere sensibilisatie van neuronen in vitro te bestuderen.
De groeiende belangstelling voor het gebruik van DRG-explantaten in een 3D-cultuur is te danken aan hun vermogen om robuuste neurietgroei te bevorderen, wat dient als een indirecte indicator van de levensvatbaarheid van DRG12. Hoewel primaire neonatale of embryonale DRG-explantaten voornamelijk worden gebruikt in de huidige in-vitrokweekplatforms 13,14, biedt het gebruik van explantaten van volwassen knaagdieren een beter model van volwassen neuronale fysiologie, die de menselijke DRG-fysiologie nauw nabootst in vergelijking met explantaten van neonatale of embryonale knaagdieren15. Explantatie DRG's verwijzen naar het behoud van het cellulaire en moleculaire weefsel van native DRG-weefsel, voornamelijk door het behoud van native niet-neuronale steuncellen. Hierin beschrijft dit protocol de methodologie om DRG-explantaten van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC) (Figuur 1).
Werkzaamheid is aangetoond bij het kweken van DRG's uit de cervicale, thoracale en lumbale wervelkolom zonder waarneembare verschillen in neurietgroei. Voor deze toepassing was het doel om neurietgroei op te wekken in de buitenste compartimenten van het apparaat; daarom werd in dit artikel geen onderscheid gemaakt tussen DRG-niveaus. Indien nodig voor een specifiek experiment kan het DRG-niveau echter worden aangepast aan de behoeften van de onderzoekers. Er zijn momenteel andere gecompartimenteerde kweekmodellen voor de 3D-cultuur van DRG's16, maar deze apparaten bevatten geen geconserveerde native niet-neuronale steuncellen, wat de translatie kan beperken. Het behoud van de oorspronkelijke structuur van geoogste DRG's is belangrijk omdat het zorgt voor het behoud van niet-neuronale steuncellen, waarvan de interacties met DRG-neuronen essentieel zijn voor het behoud van de functionele eigenschappen van deze neuronen. Verschillende studies hebben gedissocieerde DRG's samen gekweekt met niet-inheemse neuronale cellen zoals Schwann-cellen om myelinisatie van neuronen te bevorderen 17,18,19.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>#5 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-00</td>
			<td>For trimming and cutting DRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10x DMEM</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>D2429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x PBS (autoclaved)</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td></td>
			<td>7.3 - 7.5 pH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plates</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82050-892</td>
			<td>To temporarily store harvested and cut DRGs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 mL Syringe sterile, single use</td>
			<td>BD</td>
			<td>309657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>48 well plates</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>677180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60 mm Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB0875713A</td>
			<td>To hold media for trimming and cutting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aluminium foil</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B27 Plus 50x</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>17504044</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagen type I</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>50205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved cup Friedman Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16221-14</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #3 forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11293-00</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>16000044</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form cure</td>
			<td>Form Labs</td>
			<td></td>
			<td>curing agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Form wash</td>
			<td>Form Labs</td>
			<td></td>
			<td>To wash excess resins off MC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass bead sterilizer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>NC9531961</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass vials (8 mL)</td>
			<td>DWK Life Sciences (Wheaton)</td>
			<td>224724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMax</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1M)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High temp V2 resin</td>
			<td>FormLabs</td>
			<td>FLHTAM02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic Acid Sodium Salt</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>53747</td>
			<td>Used to make MAHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Irgacure</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>410896</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminin</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>344600501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large blunt-nose scissors</td>
			<td>Militex</td>
			<td>EG5-26</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large forceps (serrated tips)</td>
			<td>Militex</td>
			<td>9538797</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large sharp-nosed scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14010-15</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Retention pipette tips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-707-017</td>
			<td>For pipetting collagen and MAHA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methacrylated hyaluronic acid (MAHA)</td>
			<td>Prepared in lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td>85 - 115 % methacrylation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nerve Growth Factor (NGF)</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>556-NG-100</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neurobasal A Media</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>10888022</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm</td>
			<td>Bemis</td>
			<td>PM996</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin (PS)</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>516106</td>
			<td>For DRG media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH test strips</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>BDH35309.606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips (1000 &#181;L)</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1111-2021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Preform 3.23.1 software</td>
			<td>Formslab</td>
			<td></td>
			<td>To upload STL file</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat</td>
			<td>Charles River</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Resin 3D printer</td>
			<td>Form Labs</td>
			<td>Form 3L</td>
			<td>3D printing MC device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small sharp-nosed scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14094-11</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>S6014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight cup rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16004-16</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight edge spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15024-10</td>
			<td>For dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scaplel blade (No. 10)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22-079-690</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syring filters, PES (0.22 &#181;m)</td>
			<td>Celltreat</td>
			<td>229747</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tiny spring scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14003</td>
			<td>For trimming and cutting DRG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV lamp</td>
			<td>Analytik Jena US</td>
			<td></td>
			<td>To photocrosslink hydrogel (15 - 18 mW/cm2)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harvesting, embedding, and culturing dorsal root ganglia in multi-compartment devices to study peripheral neuronal features

Het meest voorkomende perifere neuronale kenmerk van pijn is een verlaagde stimulatiedrempel of overgevoeligheid van terminale zenuwen van de dorsale wortelganglia (DRG). Een mogelijke oorzaak van deze overgevoeligheid houdt verband met de interactie tussen immuuncellen in het perifere weefsel en neuronen. In vitro modellen hebben fundamentele kennis opgeleverd om te begrijpen hoe deze mechanismen leiden tot overgevoeligheid van de nociceptoren. In vitro modellen staan echter voor de uitdaging om de werkzaamheid te vertalen naar mensen. Om deze uitdaging aan te gaan, is een fysiologisch en anatomisch relevant in vitro model ontwikkeld voor de kweek van intacte dorsale wortelganglia (DRG's) in drie geïsoleerde compartimenten in een plaat met 48 putjes. Primaire DRG's worden geoogst van volwassen Sprague Dawley-ratten na humane euthanasie. Overtollige zenuwwortels worden bijgesneden en de DRG wordt in de juiste maten gesneden voor kweek. DRG's worden vervolgens gekweekt in natuurlijke hydrogels, waardoor een robuuste groei in alle compartimenten mogelijk is. Dit systeem met meerdere compartimenten biedt anatomisch relevante isolatie van de DRG-cellichamen uit neurieten, fysiologisch relevante celtypen en mechanische eigenschappen om de interacties tussen neurale en immuuncellen te bestuderen. Dit cultuurplatform biedt dus een waardevol hulpmiddel voor het onderzoeken van isolatiestrategieën voor behandelingen, wat uiteindelijk leidt tot een verbeterde screeningsaanpak voor het voorspellen van pijn.

Chronic pain is the leading cause of disability and loss of work globally1. Chronic pain affects about 20% of adults globally and imposes a significant societal and economic burden2, with total costs estimated between $560 and $635 billion every year in the United States3.
The main peripheral feature exhibited by chronic pain patients is a lowered stimulation threshold of nerves, which leads to the nervous system being more responsive to stimuli4,5. The lowered stimulation threshold can result in a painful response to a previously non-painful stimulus (allodynia) or a heightened response to a painful stimulus (hyperalgesia)6. Current chronic pain treatments have limited efficacy, and treatments that succeed in animal models often fail in human trials due to mechanistic differences in pain manifestation7. In vitro models that can more accurately mimic peripheral sensitization mechanisms have the potential to increase the translation of new therapeutics8,9. Further, by modeling key aspects of sensitized nerves in a culture system, researchers could develop a deeper understanding of the mechanisms that drive lowered thresholds and identify novel therapeutic targets that reverse them10.
The ideal in vitro platforms or microphysiological systems would incorporate the physical separation of distal neurites and dorsal root ganglia (DRG) cell body, a three-dimensional (3D) cellular environment, and the presence of native support cells to closely mimic in vivo conditions. However, a recent paper by Caparaso et al.11 shows that current DRG culture platforms lack one or more of these key features, making them insufficient in replicating in vivo conditions. Even though these platforms are easy to set up, they do not mimic the biological basis of peripheral sensitization and thus may not translate to in vivo efficacy. To address this limitation, a physiologically relevant in vitro model has been developed for the culture of dorsal root ganglia (DRG) within a hydrogel matrix with three isolated compartments to allow temporal fluidic isolation of neurites and DRG cell bodies11. This model offers both physiological and anatomical relevance, which has the potential to study peripheral sensitization of neurons in vitro.
The growing interest in the use of DRG explants in a 3D culture is due to their ability to facilitate robust neurite growth, which serves as an indirect indicator of DRG viability12. While primary neonatal or embryonic DRG explants are predominantly used in current in vitro culture platforms13,14, using explants from adult rodents provides a better model of mature neuronal physiology, which closely mimics human DRG physiology compared to explants from neonatal or embryonic rodents15. Explant DRGs refer to the preservation of the cellular and molecular tissue of native DRG tissue, primarily by maintaining native non-neuronal support cells.Herein, this protocol describes the methodology to harvest and culture DRG explants from adult Sprague Dawley rats in a multi-compartment (MC) device (Figure 1).
Efficacy has been shown in culturing DRGs from the cervical, thoracic, and lumbar spine with no observable differences in neurite growth. For this application, the objective was to elicit neurite growth into the outer compartments of the device; therefore, this article did not discriminate among DRG levels. However, if needed for a specific experiment, the DRG level can be tailored to meet experimenters&#39; needs. There are currently other compartmentalized culture models for the 3D culture of DRGs16, however, these devices do not contain preserved native non-neuronal support cells, which can limit translation. Preserving the native structure of harvested DRGs is important because it ensures the retention of non-neuronal support cells, whose interactions with DRG neurons are essential for maintaining the functional properties of these neurons. Several studies co-cultured dissociated DRGs with non-native neuronal cells such as Schwann cells to promote myelination of neurons17,18,19.

Auteur in de schijnwerpers: in vitro en in vivo modellen om de doeltreffendheid van de behandeling van chronische pijn te verbeteren

Het oogsten, inbedden en cultiveren van dorsale wortelganglia in apparaten met meerdere compartimenten om perifere neuronale kenmerken te bestuderen

Our research seeks to understand some of the underlying mechanisms that contribute to chronic musculoskeletal pain, so we can develop novel targeted treatments. Thus, we have developed in vitro and in vivo models of chronic low back pain and neuronal sensitization. Current therapeutics that work in vivo in animal models often fail clinical trials due to mechanistic differences between animal models and human subject chronic pain phenotype.Individual test by that model, nociceptor hypersensitivity present in chronic pain have the potential to identify more promising treatments for chronic pain in humans. Our protocol clearly demonstrates how to isolate primary dorsal root ganglia, and culture them in a multi compartment device. By keeping intact primary dorsal root ganglia, we maintain native support cells and culture them in a multi compartment device, allowing anatomically relevant isolation between neuronal somas and peripheral neurites.This tool will help to culture primary dorsal root ganglia in a more physiologically and anatomically relevant way, thereby increasing translational efficacy of findings. Specifically, we are excited to use this system to identify novel treatment for nociceptor hypersensitivity present in chronic pain.

Het huidige protocol beschreef een techniek om DRG te oogsten en te kweken van volwassen Sprague Dawley-ratten in een apparaat met meerdere compartimenten (MC). Zoals te zien is in figuur 1, werd DRG geoogst van volwassen ratten bijgesneden en gesneden in ~0,5 mm. De bijgesneden en gesneden DRG's werden vervolgens ingebed in een hydrogel in het soma-gebied van het MC-apparaat (Figuur 2) en gedurende 27 dagen gekweekt voordat neurietkwantificerin...

Dit protocol biedt een techniek om geëxplanteerd dorsaal wortelganglion (DRG) van volwassen Sprague Dawley-ratten te oogsten en te kweken in een apparaat met meerdere compartimenten (MC).

The most common peripheral neuronal feature of pain is a lowered stimulation threshold or hypersensitivity of terminal nerves from the dorsal root ganglia ...

harvesting-embedding-culturing-dorsal-root-ganglia-multi-compartment

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Harvesting, Embedding, and Culturing Dorsal Root Ganglia in Multi-compartment Devices to Study Peripheral Neuronal Features

314 Views.  University of Nebraska-Lincoln. Our research seeks to understand some of the underlying mechanisms that contribute to chronic musculoskeletal pain, so we can develop novel targeted treatments. Thus, we have developed in vitro and in vivo models of chronic low back pain and neuronal sensitization. Current therapeutics that work in vivo in animal models often fail clinical trials due to mechanistic differences between animal models and human subject chronic pain phenotype.Individual test by that model, nociceptor hyper...