Wir danken Kathy Gage für ihren hervorragenden redaktionellen Beitrag. Die Illustrationsfiguren sind mit BioRender.com entstanden. Diese Studie wurde mit Mitteln der Abteilung für Anästhesiologie (Duke University Medical Center) und NIH-Zuschüssen NS099590, HL157354 und NS127163 unterstützt.

Das Protokoll wurde vom Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. In der aktuellen Studie wurden männliche C57Bl/6-Mäuse (3-4 Monate alt; 22-28 g) verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.
1. Einzellige Suspension aus dem Gehirn der Maus
HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen Überblick über das Protokoll zur Isolierun...

Gewinnung von Einzelzellsuspensionen aus dem Gehirn und dem Knochenmark von Mäusen

<ol>
	<li>Bohr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+glymphatic+system:+Current+understanding+and+modeling.">The glymphatic system: Current understanding and modeling.</a> iScience. 25 (9), 104987 (2022).</li><li>Jiang-Xie, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+dynamics+direct+cerebrospinal+fluid+perfusion+and+brain+clearance.">Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance.</a> Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).</li><li>Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+compartments+at+the+brain's+borders+in+health+and+neurovascular+diseases.">Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases.</a> Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).</li><li>Herisson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+vascular+channels+connect+skull+bone+marrow+and+the+brain+surface+enabling+myeloid+cell+migration.">Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration.</a> Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).</li><li>Mazzitelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skull+bone+marrow+channels+as+immune+gateways+to+the+central+nervous+system.">Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system.</a> Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).</li><li>Cugurra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Skull+and+vertebral+bone+marrow+are+myeloid+cell+reservoirs+for+the+meninges+and+CNS+parenchyma.">Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma.</a> Science. 373 (6553), eabf7844 (2021).</li><li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+meningeal+b+cells+reveals+a+lymphopoietic+niche+at+the+CNS+borders.">Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders.</a> Science. 373 (6553), eabf9277 (2021).</li><li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+direct+connections+between+the+dura+and+the+brain.">Identification of direct connections between the dura and the brain.</a> Nature. 627, 165-173 (2024).</li><li>Mazzitelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+regulates+skull+bone+marrow+niches+via+direct+access+through+dural+channels.">Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels.</a> Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).</li><li>Pulous, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cerebrospinal+fluid+can+exit+into+the+skull+bone+marrow+and+instruct+cranial+hematopoiesis+in+mice+with+bacterial+meningitis.">Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis.</a> Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+cardiac+arrest+model+for+brain+imaging+and+brain+physiology+monitoring+during+ischemia+and+resuscitation.">Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation.</a> J Vis Exp. (194), e65340 (2023).</li><li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+evaluation+of+a+novel+mouse+model+of+asphyxial+cardiac+arrest+revealed+severely+impaired+lymphopoiesis+after+resuscitation.">Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation.</a> J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142 (2021).</li><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+transcriptomic+analysis+of+the+immune+cell+landscape+in+the+aged+mouse+brain+after+ischemic+stroke.">Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 83 (2022).</li><li>Wang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perk+(protein+kinase+RNA-like+er+kinase)+branch+of+the+unfolded+protein+response+confers+neuroprotection+in+ischemic+stroke+by+suppressing+protein+synthesis.">Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis.</a> Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).</li><li>Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+from+the+ischemic+mouse+brain.">Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain.</a> J Vis Exp. 108, e53658 (2016).</li><li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain:+Systematic+review+and+isolation+methods'+evaluation.">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976 (2022).</li><li>Disano, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolating+central+nervous+system+tissues+and+associated+meninges+for+the+downstream+analysis+of+immune+cells.">Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells.</a> J Vis Exp. 159, e61166 (2020).</li><li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations.">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).</li><li>Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protocol+for+analysis+of+mouse+neutrophil+netosis+by+flow+cytometry.">Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100948 (2021).</li><li>Su, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+immunity+and+neurological+diseases:+New+approaches,+new+insights.">Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights.</a> J Neuroinflammation. 20 (1), 125 (2023).</li><li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+isolation+of+neonatal+and+adult+mouse+dura+leukocytes+for+flow+cytometry+analysis.">Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102272 (2023).</li><li>Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+and+immunohistochemistry+of+the+mouse+dural+meninges+for+immunological+and+virological+assessments.">Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102119 (2023).</li><li>Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Meningeal+whole+mount+preparation+and+characterization+of+neural+cells+by+flow+cytometry.">Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50 (2018).</li></ol>

Hier werden zwei einfache, aber effektive Protokolle zur Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark vorgestellt. Diese Protokolle können zuverlässig eine große Menge lebensfähiger Immunzellen liefern, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen, insbesondere für die Durchflusszytometrie, geeignet sein können.
Um die Neuroinflammation bei verschiedenen Erkrankungen des Gehirns zu untersuchen, wurden viele Protokolle für Immunzellpräparate aus dem Gehirn et...

Das Gehirn, der zentrale Knotenpunkt des Nervensystems, wird durch den Schädel geschützt. Unter dem Schädel befinden sich drei Schichten Bindegewebe, die als Hirnhäute bekannt sind - die Dura mater, die Arachnoidea mater und die Pia mater. Im Subarachnoidalraum zwischen Arachnoidalflüssigkeit und Pia mater zirkuliert der Liquor cerebrospinalis, der das Gehirn abfedert und auch Abfallstoffe über das glymphatische System abtransportiert 1,2. Zusammen bietet diese einzigartige Architektur eine sichere und unterstützende Umgebung, die die Stabilität des Gehirns aufrechterhält und es vor möglichen Verletzungen schützt.
Das Gehirn galt lange Zeit als immunprivilegiert. Diese Vorstellung wurde jedoch teilweise aufgegeben, da sich die Beweise häufen, dass neben den residenten Mikroglia im Parenchym auch die Grenzen des Gehirns, einschließlich des Plexus choroideus und der Hirnhäute, eine Vielzahl von Immunzellen beherbergen3. Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase, der Überwachung der Gehirngesundheit und der Initiierung der Immunantwort auf Hirnverletzungen. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Schädel an der Immunität der Hirnhäute beteiligt ist und zur Immunantwort im Gehirn nach einer Verletzung beitragen kann. Im Jahr 2018 machten Herisson et al. eine bahnbrechende Entdeckung von direkten Gefäßkanälen, die das Schädelknochenmark mit den Hirnhäuten verbinden, und etablierten damit einen anatomischen Weg für die Leukozytenmigration 4,5. Später zeigten Cugurra et al., dass viele myeloische Zellen (z.B. Monozyten und Neutrophile) und B-Zellen in den Hirnhäuten nicht aus dem Blut stammen6. Mit Techniken wie der Transplantation von Knochenlappen der Kalvaria und selektiven Bestrahlungsschemata lieferten die Autoren überzeugende Beweise dafür, dass das Schädelknochenmark als lokale Quelle für myeloische Zellen in den Hirnhäuten sowie als ZNS-Parenchym nach ZNS-Verletzung dient6. Darüber hinaus schlug eine andere Studie vor, dass meningeale B-Zellen ständig vom Schädelknochenmark versorgt werden7. In jüngerer Zeit wurde eine neuartige Struktur, der sogenannte Arachnoidalmanschettenausgang (ACE), als direktes Tor zwischen der Dura mater und dem Gehirn für den Transport von Immunzellen identifiziert8.
Diese aufregenden Erkenntnisse haben wichtige Implikationen für die Entstehung der Infiltration von Immunzellen in das verletzte Gehirn (z. B. nach einem ischämischen Schlaganfall). Eine Vielzahl von Beweisen deutet darauf hin, dass nach einem Schlaganfall viele Immunzellen das Gehirn infiltrieren und sowohl zu akuten Hirnschäden als auch zu chronischer Gehirnerholung beitragen. Die gängige Vorstellung ist, dass es sich bei diesen Zellen um zirkulierende Leukozyten im Blut handelt, die das Gehirn infiltrieren, was weitgehend durch eine durch einen Schlaganfall verursachte Schädigung der Blut-Hirn-Schranke erleichtert wird. Diese Vorstellung wurde jedoch in Frage gestellt. In einer Studie wurden Immunzellen im Schädel und in der Tibia von Mäusen unterschiedlich markiert, und 6 Stunden nach dem Schlaganfall wurde eine signifikant stärkere Abnahme der Neutrophilen und Monozyten im Schädel im Vergleich zum Schädel festgestellt. Die Tibia und weitere vom Schädel stammende Neutrophile waren im ischämischen Gehirn vorhanden. Diese Daten deuten darauf hin, dass in der akuten Schlaganfallphase die Neutrophilen im ischämischen Gehirn hauptsächlich aus dem Schädelknochenmark stammen4. Interessanterweise kann CSF diese Migration leiten. In der Tat zeigten zwei kürzlich erschienene Berichte, dass Liquor Signalsignale vom Gehirn über Schädelkanäle direkt an das Schädelknochenmark weiterleiten und die Zellmigration und Hämatopoese im Schädelknochenmark nach einer ZNS-Verletzung anweisenkann 9,10.
Angesichts dieser jüngsten Erkenntnisse ist es wichtig geworden, Veränderungen in Immunzellen sowohl im Gehirn als auch im Schädelknochenmark zu analysieren, um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen. Für solche Untersuchungen wird eine ausreichende Anzahl hochwertiger Immunzellen für nachgelagerte Analysen wie Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) benötigt. Hier geht es darum, zwei optimierte Verfahren zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Hirngewebe und Schädelknochenmark vorzustellen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schädeldecke (Stirnbein, Hinterhauptbein und Scheitelknochen) des Schädels typischerweise zur Entnahme von Knochenmark verwendet wird, und dieses Knochenmark wird in dieser Studie ausdrücklich als Schädelknochenmark bezeichnet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76332-066</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>76332-068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1x HBSS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical tubes</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>339653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-well V-bottom microplate&#160;</td>
			<td>SARSTEDT</td>
			<td>82.1583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AURORA&#160; flow cytometer</td>
			<td>Cytek bioscience</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BSA</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP9706-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD11b-AF594</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>101254</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-BV785</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115543</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-FITC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>115506</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-APC</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100312</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3-PE</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>100206</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-Alex 700</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>103128</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45-BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103133</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Strainer 70 um</td>
			<td>Avantor</td>
			<td>732-2758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dressing Forceps&#160;</td>
			<td>V. Mueller</td>
			<td>NL1410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15575-038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fc Block</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>101320</td>
			<td>1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Roboz</td>
			<td>RS-5047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N7167</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-BV421</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127628</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ly6G-PerCp-cy5.5</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>127615</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1-APC-cy7</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>108723</td>
			<td>1:500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll (density gradient medium)</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>17089101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffer saline (10x)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>70011-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RBC Lysis Buffer (10x)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>SKLAR</td>
			<td>64-1250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size</td>
			<td>DWK Life Sciences</td>
			<td>357544</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolating immune cells from mouse brain and skull

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Immunantwort, die durch Erkrankungen des Gehirns (z. B. Hirnischämie und autoimmune Enzephalomyelitis) ausgelöst wird, nicht nur im Gehirn, sondern auch im Schädel auftritt. Ein wichtiger Schritt zur Analyse von Veränderungen in Immunzellpopulationen sowohl im Gehirn als auch im Schädelknochenmark nach einer Hirnschädigung (z. B. Schlaganfall) ist die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl hochwertiger Immunzellen für nachgelagerte Analysen. Hier werden zwei optimierte Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark zur Verfügung gestellt. Die Vorteile beider Protokolle spiegeln sich in ihrer Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirksamkeit bei der Gewinnung einer großen Menge lebensfähiger Immunzellen wider. Diese Zellen können für eine Reihe von Downstream-Anwendungen geeignet sein, wie z. B. Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Transkriptomanalyse. Um die Wirksamkeit der Protokolle zu demonstrieren, wurden Immunphänotypisierungsexperimente an Schlaganfallgehirnen und normalem Hirnschädelknochenmark mittels Durchflusszytometrie durchgeführt, und die Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen veröffentlichter Studien überein.

The brain, the central hub of the nervous system, is protected by the skull. Beneath the skull are three layers of connective tissue known as the meninges - the dura mater, arachnoid mater, and pia mater. Cerebrospinal fluid (CSF) circulates in the subarachnoid space between the arachnoid mater and pia mater, cushioning the brain and also removing waste via the glymphatic system1,2. Together, this unique architecture provides a secure and supportive environment that maintains the stability of the brain and shields it from potential injury.
The brain has long been considered immune-privileged. However, this notion has been partially abandoned as mounting evidence indicates that, in addition to resident microglia in the parenchyma, the borders of the brain, including the choroid plexus and meninges, host a diverse array of immune cells3. These cells play critical roles in maintaining homeostasis, surveilling brain health, and initiating the immune response to brain injury. Notably, recent findings indicate that the skull is involved in meninges immunity, and may contribute to the immune response in the brain after injury. In 2018, Herisson et al. made a seminal discovery of direct vascular channels that link the skull bone marrow to the meninges, thereby establishing an anatomical route for leukocyte migration4,5. Later, Cugurra et al. demonstrated that many myeloid cells (e.g., monocytes and neutrophils) and B cells in the meninges do not originate from the blood6. Using techniques such as calvaria bone-flap transplantation and selective irradiation regimens, the authors provided compelling evidence that the skull bone marrow serves as a local source for myeloid cells in the meninges as well as CNS parenchyma after CNS injury6. Further, another study proposed that meningeal B cells are constantly supplied by the skull bone marrow7. More recently, a novel structure, termed the arachnoid cuff exit (ACE), has been identified as a direct gateway between the dura mater and the brain for immune cell trafficking8.
These exciting findings have important implications for the origin of infiltrating immune cells into the injured brain (e.g., after ischemic stroke). A large body of evidence has indicated that after stroke, many immune cells infiltrate the brain, contributing to both acute brain damage and chronic brain recovery. The conventional notion&#160;is that these cells are circulating leukocytes in the blood that infiltrate the brain, which is largely facilitated by stroke-induced blood-brain barrier damage. However, this notion has been challenged. In one study, immune cells in the skull and the tibia of mice were labeled differently, and at 6 h after stroke, a significantly greater decrease in neutrophils and monocytes was found in the skull vs. the tibia, and more skull-derived neutrophils were present in the ischemic brain. These data suggest that in the acute stroke phase, neutrophils in the ischemic brain primarily originate from the skull bone marrow4. Interestingly, CSF may guide this migration. Indeed, two recent reports demonstrated that CSF can directly relay signaling cues from the brain into the skull bone marrow via skull channels, and instruct cell migration and hematopoiesis in the skull bone marrow after CNS injury9,10.
In light of these recent findings, it has become important to analyze changes in immune cells in both the brain and the skull bone marrow, when studying the immune response to brain disorders. In such investigations, sufficient numbers of high-quality immune cells are needed for downstream analyses such as cell sorting, flow cytometry analysis, and single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). Here, the overall goal is to present two optimized procedures for preparing single-cell suspensions from brain tissue and skull bone marrow. It is important to note that the calvaria (frontal bone, occipital bone, and parietal bones) of the skull are typically used to extract bone marrow, and this bone marrow is specifically referred to as skull bone marrow throughout this study.

Autor im Rampenlicht: Untersuchung der komplexen Immunantwort nach Hirnischämie

Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Our research focuses on the complex immune response following brain ischemia caused by ischemic stroke and cardiac arrest. Brain ischemia triggers the activation resident immune cells in the brain and the infiltration of immune cells. However, our understanding of this immune cells remains limited.We aim to dissect the immune state, origin, and functional roles of this brain cells after ischemia. Recent research highlights the surprising role of the skull in the brain's immune response following injury. Therefore, it is important to analyze changes in immune cells in both the brain tissue and the skull bone marrow after brain ischemia.To this end, a critical step is to obtain a sufficient number of high-quality immune cells for further analysis. Our protocols enable researchers to rapidly obtain large quantities of available immune cells from the brain and the skull bone marrow. The brain immune cell protocol uses a mechanical dissociation approach at low temperature throughout, ensuring better preservation of the transcriptional and the proteomic profiles.The skull bone marrow protocol is simple, yet effective for extracting bone marrow cells from the skull. We'll continue our comprehensive research on the impact of brain ischemia on immune cells in brain tissue and the skull. Given that neuroinflammation plays a key role in the pathophysiology of brain injury after ischemia, our research is expected to discover novel therapeutic targets for brain protection after ischemic stroke or cardiac arrest.

Zur Präparation von Immunzellen aus dem Hirngewebe der Maus liefert das Protokoll im Allgemeinen Zellen mit hoher Lebensfähigkeit (84,1 % ± 2,3 % [mittlere ± SD]). Etwa 70%-80% dieser Zellen sind CD45-positiv. Im normalen Mäusegehirn sind erwartungsgemäß fast alle CD45+-Zellen Mikroglia (CD45LowCD11b+). Dieses Protokoll wurde im Labor für verschiedene Anwendungen verwendet, darunter Durchflusszytometrie-Analysen, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und scRNA-seq-Analysen. ...

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...

Unsere Forschung konzentriert sich auf die komplexe Immunantwort nach Hirnischämie, die durch ischämischen Schlaganfall und Herzstillstand verursacht wird. Die Ischämie des Gehirns löst die Aktivierung von im Gehirn ansässigen Immunzellen und die Infiltration von Immunzellen aus. Unser Verständnis dieser Immunzellen ist jedoch noch begrenzt.Unser Ziel ist es, den Immunzustand, den Ursprung und die funktionelle Rolle dieser Gehirnzellen nach einer Ischämie zu untersuchen. Neuere Forschungen unterstreichen die überraschende Rolle des Schädels bei der Immunantwort des Gehirns nach einer Verletzung. Daher ist es wichtig, Veränderungen der Immunzellen sowohl im Hirngewebe als auch im Schädelknochenmark nach einer Hirnischämie zu analysieren.Zu diesem Zweck ist es ein entscheidender Schritt, eine ausreichende Anzahl hochwertiger Immunzellen für die weitere Analyse zu gewinnen. Unsere Protokolle ermöglichen es den Forschern, schnell große Mengen verfügbarer Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark zu gewinnen. Das Protokoll der Immunzellen des Gehirns verwendet einen mechanischen Dissoziationsansatz bei niedriger Temperatur, um eine bessere Erhaltung des transkriptionellen und des proteomischen Profils zu gewährleisten.Das Schädelknochenmarkprotokoll ist einfach, aber effektiv für die Entnahme von Knochenmarkzellen aus dem Schädel. Wir werden unsere umfassende Forschung über die Auswirkungen von Hirnischämie auf Immunzellen im Hirngewebe und im Schädel fortsetzen. Angesichts der Tatsache, dass Neuroinflammation eine Schlüsselrolle in der Pathophysiologie von Hirnverletzungen nach Ischämie spielt, wird erwartet, dass unsere Forschung neue therapeutische Ziele für den Schutz des Gehirns nach ischämischem Schlaganfall oder Herzstillstand entdeckt.

isolating-immune-cells-from-mouse-brain-and-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

1.3K Views.  Duke University Medical Center. Our research focuses on the complex immune response following brain ischemia caused by ischemic stroke and cardiac arrest. Brain ischemia triggers the activation resident immune cells in the brain and the infiltration of immune cells. However, our understanding of this immune cells remains limited.We aim to dissect the immune state, origin, and functional roles of this brain cells after ischemia. Recent research highlights the surprising role of the skull in the brain's immune response...