Denna studie stöddes av National Natural Science Foundation of China (82090013).

Det övergripande protokollet kräver 44 dagar, inklusive 1 dag för beredning av luftvägsepitelceller isolerade från murina luftstrupar, 15 dagar för cellproliferation och 28 dagar för CSE-stimulering vid luft-vätskegränssnittet. Alla försöksdjur är inrymda i SPF Barrier Animal Room på Animal Experiment Center of Capital Medical University och har granskats och godkänts av Animal Experiment and Laboratory Animal Ethics Committee of Capital Medical University (AEEI-2020-100) för att uppfylla kraven i ARRIVE-r...

In vitro-modell av murina luftvägsepitelceller och kronisk rökexponering

<ol>
	<li>Ritchie, A. I., Martinez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+challenges+of+defining+early+chronic+obstructive+pulmonary+disease+in+the+general+population.">The challenges of defining early chronic obstructive pulmonary disease in the general population.</a> Am J Respir Crit Care Med. 203 (10), 1209-1210 (2021).</li><li>Caramori, G., Kirkham, P., Barczyk, A., Di Stefano, A., Adcock, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+pathogenesis+of+cigarette+smoking-induced+stable+COPD.">Molecular pathogenesis of cigarette smoking-induced stable COPD.</a> Ann N Y Acad Sci. 1340, 55-64 (2015).</li><li>Leino, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrier+disrupting+effects+of+alternaria+alternata+extract+on+bronchial+epithelium+from+asthmatic+donors.">Barrier disrupting effects of alternaria alternata extract on bronchial epithelium from asthmatic donors.</a> PLoS One. 8 (8), e71278 (2013).</li><li>Benediktsd&#243;ttir, B. E., Arason, A. J., Halld&#243;rsson, S., Gudj&#243;nsson, T., M&#225;sson, M., Baldursson, &. #. 2. 1. 1. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+delivery+characteristics+of+the+progenitor+bronchial+epithelial+cell+line+VA10.">Drug delivery characteristics of the progenitor bronchial epithelial cell line VA10.</a> Pharm Res. 30 (3), 781-791 (2013).</li><li>Walters, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+a+human+airway+epithelium+derived+basal+cell+line+with+multipotent+differentiation+capacity.">Generation of a human airway epithelium derived basal cell line with multipotent differentiation capacity.</a> Respir Res. 14 (1), 135 (2013).</li><li>Prytherch, Z., Job, C., Marshall, H., Oreffo, V., Foster, M., B&#233;ruB&#233;, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+stem+cell+differentiation+in+an+in+vitro+airway+model.">Tissue-specific stem cell differentiation in an in vitro airway model.</a> Macromol Biosc. 11 (11), 1467-1477 (2011).</li><li>Kilkenny, C., Browne, W., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+research:+Reporting+in+vivo+experiments:+The+ARRIVE+guidelines.">Animal research: Reporting in vivo experiments: The ARRIVE guidelines.</a> Br J Pharmacol. 160 (7), 1577-1579 (2010).</li><li>Brekman, A., Walters, M. S., Tilley, A. E., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FOXJ1+prevents+cilia+growth+inhibition+by+cigarette+smoke+in+human+airway+epithelium+in+vitro.">FOXJ1 prevents cilia growth inhibition by cigarette smoke in human airway epithelium in vitro.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 51 (5), 688-700 (2014).</li><li>Bajic, M., Maher, K. A., Deal, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+open+chromatin+regions+in+plant+genomes+using+ATAC-seq.">Identification of open chromatin regions in plant genomes using ATAC-seq.</a> Methods Mol Biol. 1675, 183-201 (2018).</li><li>Shaykhiev, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+events+in+the+pathogenesis+of+chronic+obstructive+pulmonary+disease.+Smoking-induced+reprogramming+of+airway+epithelial+basal+progenitor+cells.">Early events in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Smoking-induced reprogramming of airway epithelial basal progenitor cells.</a> Ann Am Thorac Soc. 11 Suppl 5 (Suppl 5), S252-S258 (2014).</li><li>Raby, K. L., Michaeloudes, C., Tonkin, J., Chung, K. F., Bhavsar, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+airway+epithelial+injury+and+abnormal+repair+in+asthma+and+COPD.">Mechanisms of airway epithelial injury and abnormal repair in asthma and COPD.</a> Front Immunol. 14, 1201658 (2023).</li><li>Zhou, J. -. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cigarette+smoke-initiated+autoimmunity+facilitates+sensitisation+to+elastin-induced+COPD-like+pathologies+in+mice.">Cigarette smoke-initiated autoimmunity facilitates sensitisation to elastin-induced COPD-like pathologies in mice.</a> Eur Respir J. 56 (3), 2000404 (2020).</li><li>Lam, H. C., Choi, A. M. K., Ryter, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air-liquid+interface.">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air-liquid interface.</a> J Vis Exp. 48, 2513 (2011).</li><li>You, Y., Brody, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+differentiation+of+mouse+tracheal+epithelial+cells.">Culture and differentiation of mouse tracheal epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 945, 123-143 (2012).</li><li>Wandalsen, G. F., Lanza, F. d. e. C., Nogueira, M. C. P., Sol&#233;, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+and+safety+of+chloral+hydrate+sedation+in+infants+for+pulmonary+function+tests.">Efficacy and safety of chloral hydrate sedation in infants for pulmonary function tests.</a> Rev Paul Pediatr. 34 (4), 408-411 (2016).</li><li>Jiang, D., Schaefer, N., Chu, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Air-liquid+interface+culture+of+human+and+mouse+airway+epithelial+cells.">Air-liquid interface culture of human and mouse airway epithelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1809, 91-109 (2018).</li><li>Takagi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+prevent+contamination+with+Candida+albicans+during+the+fabrication+of+transplantable+oral+mucosal+epithelial+cell+sheets.">How to prevent contamination with Candida albicans during the fabrication of transplantable oral mucosal epithelial cell sheets.</a> Regen Ther. 1, 1-4 (2015).</li><li>Culp, D. J., Latchney, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mucinlike+glycoproteins+from+cat+tracheal+gland+cells+in+primary+culture.">Mucinlike glycoproteins from cat tracheal gland cells in primary culture.</a> Am J Physiol. 265 (3 Pt 1), L260-L269 (1993).</li><li>Cao, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invited+review:+human+air-liquid-interface+organotypic+airway+tissue+models+derived+from+primary+tracheobronchial+epithelial+cells-overview+and+perspectives.">Invited review: human air-liquid-interface organotypic airway tissue models derived from primary tracheobronchial epithelial cells-overview and perspectives.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 57 (2), 104-132 (2021).</li><li>Beb&#246;k, Z., Tousson, A., Schwiebert, L. M., Venglarik, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+oxygenation+promotes+CFTR+maturation+and+trafficking+in+MDCK+monolayers.">Improved oxygenation promotes CFTR maturation and trafficking in MDCK monolayers.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 280 (1), C135-C145 (2001).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

KOL är en vanlig kronisk luftvägsinflammation. Exponering för tobaksrök leder till kronisk luftvägsinflammation, luftvägsombyggnad och strukturell förstörelse av lungorna, vilket är resultatet av interaktionen mellan olika strukturella celler och immunceller10. Som frontlinjen i det medfödda immunsystemet i lungan spelar luftvägsepitelceller en mycket viktig roll under utvecklingen av sjukdomen11. Ur denna synvinkel är det ett vetenskapligt problem som måste l?...

Kroniskt obstruktiv lungsjukdom (KOL) är en heterogen lungsjukdom med komplexa egenskaper, medan patienter med KOL gradvis tenderar att bliyngre1. Rökning, som är en primär riskfaktor för KOL2, har en djupgående inverkan på luftvägarnas epitelceller, som fungerar som den första barriären mot tobaksrök. Trots detta kända samband är de detaljerade mekanismerna genom vilka tobaksrök inducerar förändringar i luftvägarnas epitelceller fortfarande otillräckligt utforskade. En grundlig förståelse av dessa molekylära förändringar är avgörande för att identifiera tidiga diagnostiska markörer och terapeutiska mål för KOL.
För att ta itu med denna lucka utvecklade vi en ny in vitro-modell med hjälp av murina luftvägsepitelceller. Dessa celler utsattes för långvarig stimulering med cigarettrökextrakt (CSE), vilket gjorde det möjligt för oss att övervaka dynamiska cellulära förändringar och utforska förändringarna i luftvägsepitelcellerna under långvarig tobaksstimulering och den underliggande mekanismen. I denna modell användes transwell för att tillhandahålla luft-vätskegränssnittet för luftvägsepitelceller, och cigarettrökextrakt stimulerades i det tidiga stadiet av epitelcellsdifferentiering fram till slutet av differentieringen efter 28 dagar. Tidigare studier har endast undersökt differentiering och kortvarig stimulering av luftvägsepitelceller (cellinjedominans). De var begränsade till en enda regleringsväg 3,4,5,6. Protokollet som presenteras här använder dock primära luftvägsepitelceller från möss och optimerar cellextraktionsprocessen för bättre cellaktivitet än tidigare metoder för odling av luftvägsepitelceller. Denna modell fokuserar på förändringar i cellulär differentiering tillsammans med omfattande transkriptomiska, proteomiska, metabolomiska och epigenomiska analyser. Genom att använda immunofluorescens och avancerade multi-omics-tekniker syftade vi till att belysa de cellulära svaren hos luftvägsepitelceller på kronisk exponering för tobaksrök, och därigenom bidra till en djupare förståelse av KOL-patogenesen. Denna modell kan användas för att utforska förändringarna i luftvägsepitelcelldifferentieringsmönster och dess mekanism som orsakas av långvarig stimulering av olika föroreningar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x Penicillin/Streptomycin solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 mm Transwell with 0.4 &#181;m Pore Polyester Membrane Insert, Sterile</td>
			<td>BIOFIL</td>
			<td>TCS016012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &#181;m Cell Strainer</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500x Gentamicin/Amphotericin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R01510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetylated &#945;-Tubulin</td>
			<td>CST</td>
			<td>#5335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetyl-&#945;-Tubulin (Lys40) (D20G3)XP Rabbit mAb&#160;</td>
			<td>cellsignal</td>
			<td>#5335</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Animal Component Free Cell Dissociation Kit</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-pan Cytokeratin antibody</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab7753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cigarette</td>
			<td>Marlboro</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Claudin3</td>
			<td>immunoway</td>
			<td>YT0949</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deoxyribonuclase I from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>DN25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ham&#8217;s F-12</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>N6658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin Solution&#160;</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrocortisone Stock Solution</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07925</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mucin 5AC</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab212636</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Occludin</td>
			<td>proteintech</td>
			<td>27260-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Cytosci</td>
			<td>CBS004S-BR500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin Solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 
			Basal Medium</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05002&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI 10x Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05003&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-ALI Maintenance Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus 50x Supplement</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PneumaCult-Ex Plus Basal Medium</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>05041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase E</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat tail collagen</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Stemcell</td>
			<td>07050&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro model for studying differentiation and changes of multi-omics on murine airway epithelial cells stimulated with cigarette smoke extract

Kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) tillskrivs till stor del exponering för tobaksrök. Att undersöka hur luftvägsepitelceller funktionellt anpassar sig till tobaksrök är avgörande för att förstå patogenesen av KOL. Den aktuella studien syftade till att sätta upp en in vitro-modell med hjälp av primära murina luftvägsepitelceller för att efterlikna den verkliga effekten av tobaksrök. Till skillnad från etablerade cellinjer behåller primära celler mer in vivo-liknande egenskaper, inklusive tillväxtmönster, åldrande och differentiering. Dessa celler uppvisar en känslig inflammatorisk respons och effektiv differentiering, vilket nära representerar fysiologiska tillstånd. I denna modell odlades primära murina luftvägsepitelceller under 28 dagar under ett luft-vätskegränssnitt med en optimal koncentration av cigarettrökextrakt (CSE), vilket ledde till omvandlingen av ett monolager av odifferentierade celler till ett pseudostratifierat kolonnepitel, vilket indikerar CSE-acklimatisering. Omfattande multi-omics-analyser tillämpades sedan för att belysa de mekanismer genom vilka CSE påverkar differentieringen av basala luftvägsceller. Dessa insikter ger en djupare förståelse för de cellulära processer som ligger till grund för KOL-progression som svar på exponering för tobaksrök.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a heterogeneous lung condition with complex characteristics, while patients with COPD gradually tend to be younger1. Smoking, a primary risk factor for COPD2, has a profound impact on airway epithelial cells, which serve as the initial barrier against tobacco smoke. Despite this known association, the detailed mechanisms through which tobacco smoke induces changes in airway epithelial cells remain inadequately explored. A thorough understanding of these molecular alterations is essential for identifying early diagnostic markers and therapeutic targets for COPD.
To address this gap, we developed a novel in vitro model using murine airway epithelial cells. These cells were subjected to long-term stimulation with cigarette smoke extract (CSE), enabling us to monitor dynamic cellular changes and explore the changes in airway epithelial cells under long-term tobacco stimulation and the underlying mechanism. In this model, transwell was used to provide the air-liquid interface of airway epithelial cells, and cigarette smoke extract was stimulated in the early stage of epithelial cell differentiation until the end of differentiation at 28 days. Previous studies investigated only the differentiation and short-term stimulation of airway epithelial cells (cell line dominance). They were limited to a single regulatory pathway3,4,5,6. However, the protocol presented here uses primary mouse airway epithelial cells and optimizes the cell extraction process for better cell activity than previous airway epithelial cell culture methods. This model focuses on alterations in cellular differentiation alongside comprehensive transcriptomic, proteomic, metabolomic, and epigenomic analyses. Employing immunofluorescence and advanced multi-omics techniques, we aimed to elucidate the cellular responses of airway epithelial cells to chronic tobacco smoke exposure, thereby contributing to a deeper understanding of COPD pathogenesis. This model can be used to explore the changes in airway epithelial cell differentiation pattern and its mechanism caused by long-term stimulation of various pollutants.

Författare i fokus: Utveckling och karakterisering av en in vitro-modell för att studera kronisk exponering för cigarettrök och dess inverkan på luftvägsepitelceller i KOL-forskning

In vitro-modell för att studera differentiering och förändringar av multi-omics på murina luftvägsepitelceller stimulerade med cigarettrökextrakt

The scope of our research is to develop and characterize an in vitro model using airway epithelial cells to study the effects of chronic CSC exposure. We aimed to understand the cellular response that occurred in airway epithelial cells under long-term cigarette smoke exposure, which is relevant to the pathogenesis of COPD. The recognition of intricate epithelium immune cell interaction in COPD is considered a pivotal recent development in COPD research.We have established a novel in vitro model that mimic chronic CSC exposure in airway epithelial cells. Our findings open up new avenue of investigating the long-term effect of chronic cigarette smoke exposure on airway epithelial cells and their role in COPD progression. In the future, our laboratory will focus on exploring specific pathway that regulate epithelial cells differentiation and the role of airway epithelial cells heterogenetic in COPD treatment response.

Differentiering Murina luftvägsepitelceller differentierades framgångsrikt efter odling vid ett luft-vätskegränssnitt med ett differentieringsmedium i 28 dagar. Förekomst av cilierade celler och bägarceller påvisades genom immunofluorescensanalys av ciliemarköracetylerat α-Tubulin (grönt; Figur 3A) och bägarcellsmarkören Mucin5AC, respektive6 (röd; figur 3B).
Bestämning av CSE-koncentration f?...

Här beskriver vi en in vitro-modell för att isolera och differentiera murina luftvägsepitelceller, med fokus på deras acklimatisering till kroniskt cigarettrökextrakt (CSE). Modellen kan användas för att på ett heltäckande sätt karakterisera multi-omics-effekten av CSE, vilket möjligen ger insikter i de cellulära svaren under kronisk rökexponering.

Chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is largely attributed to tobacco smoke exposure. Investigating how airway epithelial cells functionally adapt ...

in-vitro-model-for-studying-differentiation-changes-multi-omics-on

Research

JoVE Journal

Biology

In Vitro Model for Studying Differentiation and Changes of Multi-Omics on Murine Airway Epithelial Cells Stimulated with Cigarette Smoke Extract

372 Views.  Capital Medical University. The scope of our research is to develop and characterize an in vitro model using airway epithelial cells to study the effects of chronic CSC exposure. We aimed to understand the cellular response that occurred in airway epithelial cells under long-term cigarette smoke exposure, which is relevant to the pathogenesis of COPD. The recognition of intricate epithelium immune cell interaction in COPD is considered a pivotal recent development in COPD research.We have established a novel in v...

Video: Author Spotlight: Development and Characterization of an In Vitro Model to Study Chronic Cigarette Smoke Exposure and Its Impact on Airway Epithelial Cells in COPD Research