פ.ל.ק. מעריכה את התמיכה הנתמכת על ידי תוכנית המחקר והפיתוח החלוצית של ג'ג'יאנג (2022C03031), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFA0910103), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (22274141, 22074080), הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2022ZD28) ותוכנית המלגות טאישאן של מחוז שאנדונג (tsqn201909106). H.C. מכירה בתמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82202329). המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון האנגג'ואו לרפואה (HIM), האקדמיה הסינית למדעים.

מחקר זה אינו דורש אישור אתי מכיוון שעור החזיר ששימש לניסויים המתוארים בסעיף 3 נרכש כאוזני חזיר אכילות מהשוק ולא מקורו בחיות ניסוי.
1. בידוד של אקסוזומים
<ol><li>תרבית תאים<ol><li>טפחו תאי סרטן אפיתל בשחלות של עכברים ID8 במדיום תרבית מסוג DMEM (Modified Eagle Medium) של דולבקו המכיל 10% נ?...

מדבקות מיקרו-מחטים לאספקה מתמשכת של אקסוזומים ביישומים ביו-רפואיים

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), eaau6977 (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly(amidoamine)+dendrimers:+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform.">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models.">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li><li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes.">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li><li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain.">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy.">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model.">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li><li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH,+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes.">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li><li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment.">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination.">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253 (2023).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array.">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle.">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li><li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery.">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li><li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles.">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644 (2022).</li><li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fear+of+injections+in+young+adults:+Prevalence+and+associations.">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li><li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats.">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li><li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye.">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305 (2022).</li><li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa.">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180 (2019).</li><li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair.">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li><li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer.">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021 (2018).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid:+More+than+a+carrier,+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer.">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081 (2023).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery.">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li></ol>

H. C., F.L.Q ו- S.J.M הם ממציאים בבקשת פטנט שהוגשה על סמך הנתונים בכתב יד זה. H.C. הוא המייסד המדעי של Medcraft Biotech. בע"מ

נכון לעכשיו, השיטות העיקריות לבידוד אקסוזומים כוללות אולטרה-צנטריפוגה, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, אולטרה-סינון, משקעים, חרוזים מגנטיים של זיקה חיסונית ומיקרופלואידיקה24. בשל יכולת ההעמסה המוגבלת של מיקרו-מחטים הנגרמת על ידי שטח קצה המחט הקטן שלהם, יש צורך להגדיל את ריכוז האקסו...

אקסוזומים, שהם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים לתוך המטריצה החוץ תאית, הוצעו כטיפולים ביולוגיים פוטנציאליים ווקטורים למתן תרופות לטיפול במספר מחלות וסרטן1. במהלך תהליך הביוגנזה שלהם, אקסוזומים עוטפים מולקולות ביולוגיות פעילות שונות מתוך התאים, כולל חלבונים פונקציונליים וחומצות גרעין2. כתוצאה מכך, כאשר הם נלקחים על ידי התאים המקבלים במהלך תהליך ההובלה, לאקסוזומים יש את היכולת לווסת את ביטוי הגנים ואת תפקודי התאים בתאי היעד3. כסוג של שליח מידע טבעי, אקסוזומים נוצלו במלואם בהתחדשות רקמות, ויסות חיסוני, וכמוביל משלוח4. באמצעות טכניקות הנדסיות, ליגנדות ספציפיות יכולות להיות מועשרות על פני השטח של אקסוזומים, מה שמאפשר אינדוקציה או עיכוב של אירועי איתות בתאי המקבל או מיקוד לסוגי תאים ספציפיים5. ניתן גם לטעון חומרים כימותרפיים לתוך אקסוזומים לטיפול בסרטן6. יתר על כן, אקסוזומים יש את היכולת לחצות את מחסום הדם-מוח עבור משלוח מטען טיפולי, מה שהופך אותם מבטיחים מאוד לטיפול בהפרעות מוח7. בהשוואה לליפוזומים, אקסוזומים מפגינים ספיגה תאית משופרת ותאימות ביולוגית משופרת8. הם מסוגלים להיכנס ביעילות לתאים אחרים תוך הפגנת סבילות טובה יותר ורעילות נמוכה יותר9. עם זאת, הזרקת הבולוס המסורתית של אקסוזומים מועדת לקיבוע ופינוי מהיר על ידי הכבד, הכליות והטחול בזרם הדם10. יתר על כן, לאקסוזומים יש יציבות נמוכה במבחנה והם רגישים לתנאי אחסון, המגבילים את היישומים הקליניים שלהם11.
מיקרו-מחטים, מערך של קצות מחטים בגודל מיקרומטרי, מסוגלים לחדור מחסומים פיזיולוגיים להעברת תרופות במולקולות קטנות12, חלבונים13, חומצות גרעין14 וננו-תרופות15. מיקרו-מחטים מהונדסות במדויק כדי להתמקד בנגעים על פני העור, והקצוות המפוזרים שלהן מבטיחים פיזור תרופות אחיד באתר הממוקד, ובכך מגבירים את השפעתם הטיפולית16. העיצוב והרכב החומר של מיקרו-מחטים מאפשרים אחסון יבש של חומרים ביו-אקטיביים כגון חלבונים וחומצות גרעין, ומשפרים את יציבותם17. לשיטות ההזרקה המסורתיות יש משך פעולה קצר יחסית והן עלולות לגרום לכאב, ולעורר פחד בקרב מטופלים18. אורך המיקרומטר של מיקרו-מחט ממזער טראומה לרקמות ומונע גירוי עצבי, ובכך מבטל כאב ומשפר את היענות המטופל19. בנוסף, האופי הידידותי למשתמש של מיקרו-מחטים מאפשר למטופלים לנהל את הטיפול באופן עצמאי ללא צורך בצוות מיוחד16. בנוסף לעור, מיקרו-מחטים יכולות לשמש גם ברקמות כגון העיניים20, רירית הפה21, הלב22 וכלי הדם23. היישום של microneedles עבור משלוח קליני של exosomes מספק אסטרטגיה מבטיחה ופוטנציאלית.
לפיכך, אנו מציגים תיקון מיקרו-מחט (exo@MN) עמוס אקסוזום וחושפים את שיטת הייצור שלו. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו בשיטת יציקה דו-שלבית, יחד עם צנטריפוגה וייבוש ואקום, המקדמים צבירה של אקסוזומים בקצות המיקרו-מחטים, ובכך משפרים את יעילות ההעברה. גם קצות המחט וגם הגב נבנו מחומרים המציגים תאימות ביולוגית מעולה ומסיסות במים. טרהלוז וחומצה היאלורונית (HA) שולבו כחומרי קצה כדי לספק הגנה לאקסוזומים, ופוליוויניל פירולידון (PVP) מומס באתנול מוחלט נבחר כחומר הגיבוי. המורפולוגיה של מדבקת המיקרו-מחט אופיינה באמצעות מיקרוסקופ ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). הבדיקה המכנית של המיקרו-מחט הוערכה באמצעות מד מתיחה כדי לאשר את יכולתם לחדור לעור, וקצב השחרור על עור חזיר נחקר כ-60 שניות. יתר על כן, המורפולוגיה, הגודל ותכולת החלבונים הן של אקסוזומים טריים והן של אקסוזומים exo@MN אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) וכתמים מערביים (WB). הפנמת האקסוזומים על ידי תאים דנדריטיים (DCs) אופיינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), והבשלת DCs הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה. האפיון המורפולוגי והתפקודים הביולוגיים של שני סוגי האקסוזומים עקביים במהותם.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x penicillin-streptomycin solutions</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 kDa pre-stained protein marker</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Uranyl acetate</td>
			<td>Henan Ruixin Experimental Supplies</td>
			<td>GZ02625</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td>nanoArch S130</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% precast gel</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ExpressPlus PAGE GEL</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215; SDS-PAGE loading buffer</td>
			<td>Titan</td>
			<td>04048254</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alix antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>12422-1-AP</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>ab217345</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104713</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto fine coater</td>
			<td>ZIZHU</td>
			<td>JBA5-100</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0012</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Muitifuge X1R pro</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water vacuum pump</td>
			<td>Yuhua Instrument</td>
			<td>SHZ-D(III)</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellXpert C170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper mesh</td>
			<td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&#160;</td>
			<td>JF-ZJKY/300</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (+) -Trehalose dihydrate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>5138-23-4</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0212</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>PowerPac-basic</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>JR100</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117305</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>Amersham ImageQuant 800</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074S</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTL resin</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td></td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)</td>
			<td>Bloomage Biotechnology</td>
			<td>9004-61-9</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion cleaner</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EC-52000IC</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Observe the microneedle tip dissolving process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8</td>
			<td>MeisenCTCC</td>
			<td>&#160;CC90105</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView</td>
			<td>Size analysis of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107619</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST507</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Hefei Kejing Material Technology</td>
			<td>PDC-36G</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>9016-00-6</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9</td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-snap centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344619</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>C1053</td>
			<td>Lysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell park memorial institute 1640</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0548</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Characterization of morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super ECL detection reagent</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>P1030</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tensile meter</td>
			<td>Instron</td>
			<td>68SC-05</td>
			<td>Mechanical testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100plus</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>JF-A500027-0004</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>Exosomes concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum drying oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Technology</td>
			<td>DZF-6024</td>
			<td>Fabrication of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-500-XT</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of microneedle patches for loading and delivery of exosomes

אקסוזומים, כטיפולים ביולוגיים מתפתחים של "הדור הבא" ווקטורים של אספקת תרופות, טומנים בחובם פוטנציאל עצום בתחומים ביו-רפואיים מגוונים, החל ממתן תרופות ורפואה רגנרטיבית ועד אבחון מחלות ואימונותרפיה של גידולים. עם זאת, הפינוי המהיר על ידי הזרקת בולוס מסורתית ויציבות ירודה של אקסוזומים מגבילים את היישום הקליני שלהם. מיקרו-מחטים משמשות כפתרון המאריך את זמן השהייה של האקסוזומים באתר הניהול, ובכך שומר על ריכוז התרופה ומקל על השפעות טיפוליות מתמשכות. בנוסף, microneedles גם יש את היכולת לשמור על יציבות של חומרים ביו-אקטיביים. לכן, אנו מציגים מדבקת מיקרו-מחט לטעינה והעברה של אקסוזומים וחולקים את השיטות, כולל בידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של מדבקות מיקרו-מחטים עמוסות אקסוזומים. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו באמצעות טרהלוז וחומצה היאלורונית כחומרי קצה ופוליוויניל פירולידון כחומר הגיבוי בשיטת יציקה דו-שלבית. המיקרו-מחטים הפגינו חוזק מכני חזק, עם קצוות המסוגלים לעמוד ב-2 N. עור חזיר שימש להדמיית עור אנושי, וקצות המיקרו-מחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות לאחר ניקוב העור. האקסוזומים ששוחררו מהמיקרו-מחטים הציגו מורפולוגיה, גודל חלקיקים, חלבוני סמן ותפקודים ביולוגיים דומים לאלה של אקסוזומים טריים, מה שאיפשר לתאים הדנדריטיים להיקלט ולקדם את הבשלתם.

Exosomes, which are small vesicles released by cells into the extracellular matrix, have been proposed as potential biotherapeutics and drug delivery vectors for the treatment of several diseases and cancers1. During their biogenesis process, exosomes encapsulate various biologically active molecules from within the cells, including functional proteins and nucleic acids2. As a result, when taken up by recipient cells during the transport process, exosomes have the ability to modulate gene expression and cellular functions in the target cells3. As a kind of natural information messenger, exosomes have been fully taken advantage of in tissue regeneration, immune regulation, and as a delivery carrier4. Through engineering techniques, specific ligands can be enriched on the surface of exosomes, enabling the induction or inhibition of signaling events in recipient cells or targeting specific cell types5. Chemotherapeutic agents can also be loaded into exosomes for cancer treatment6. Moreover, exosomes have the ability to cross the blood-brain barrier for therapeutic cargo delivery, making them highly promising for the treatment of brain disorders7. Compared to liposomes, exosomes exhibit enhanced cellular uptake and improved biocompatibility8. They are capable of efficiently entering other cells while demonstrating better tolerance and lower toxicity9. However, the traditional bolus injection of exosomes is prone to sequestration and rapid clearance by the liver, kidneys, and spleen in the bloodstream10. Moreover, exosomes have poor stability in vitro and are susceptible to storage conditions, which restrict their clinical applications11.
Microneedles, an array of micrometric-sized needle tips, have the capability to penetrate physiological barriers for the delivery of small molecule drugs12, proteins13, nucleic acids14, and nanomedicines15. Microneedles are precisely engineered to target lesions on the skin surface, and their dispersed tips ensure uniform drug distribution at the targeted site, thus amplifying their therapeutic impact16. The design and material composition of microneedles facilitate&#160;the dry storage of bioactive substances such as proteins and nucleic acids, enhancing their stability17. Traditional injection methods have a relatively short duration of action and can cause pain, inducing fear in patients18. The micrometer-sized length of microneedle minimizes tissue trauma and prevents nerve stimulation, thereby eliminating pain and improving patient compliance19. Additionally, the user-friendly nature of microneedles allows patients to self-administer the treatment without the need for specialized personnel16. In addition to the skin, microneedles can also be used in tissues such as the eyes20, oral mucosa21, heart22, and blood vessels23. The application of microneedles for the clinical delivery of exosomes provides a promising and prospective strategy.
Hence, we introduce an exosome-loaded microneedle (exo@MN) patch and disclose its fabrication method. The microneedle patches were fabricated using a two-step casting method, along with centrifugation and vacuum drying, which promotes the aggregation of exosomes at the microneedle tips, thereby enhancing delivery efficiency. Both the needle tips and backing were constructed using materials that exhibit excellent biocompatibility and water solubility. Trehalose and hyaluronic acid (HA) were incorporated as tip materials to provide protection for the exosomes, and polyvinylpyrrolidone (PVP) dissolved in absolute ethanol was chosen as the backing material. The morphology of the microneedle patch was characterized using microscopy and scanning electron microscope&#160;(SEM). The mechanical testing of the microneedle was assessed using a tensile meter to confirm their capability to penetrate the skin, and the release rate on pig skin was investigated to be 60 s. Furthermore, the morphology, size, and protein content of both fresh exosomes and exosomes in exo@MN were characterized using transmission electron microscope&#160;(TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting (WB). The internalization of exosomes by dendritic cells (DCs) was characterized using confocal laser scanning microscope&#160;(CLSM), and the maturation of DCs was evaluated through flow cytometry. The morphological characterization and biological functions of the two types of exosomes are essentially consistent.

Author Spotlight: אסטרטגיות חדשניות מבוססות מיקרו-מחטים לשיפור האספקה והיציבות של Exosome

ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים

My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar microneedles for delivery of exosomes.We use microneedle to pierce the biological barrier and then deliver exocells directly to the vector area efficiently. By storing them dry, we enhance their stability, making them precise, easy, and convenient for both clinical and home use. My lab, we focused on key technologies for developing the advanced microneedle-based delivery systems and that can load and deliver various therapeutics.Includes MRA, small molecular drug, antibodies, cell, and exosome. We are also investigate their chemical and physical properties and therapeutic efficacy in different biomedical applications.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של טלאי exo@MN. איור 1 מדגים את תרשים הזרימה של התהליך לייצור טלאי exo@MN. האקסוזומים עורבבו עם טרהלוז וחומצה היאלורונית, ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתבנית המיקרו-מחטים והצנטריפוגות. תהליך זה הקל על הצטברות האקסוזומים בקצו...

אקסוזומים הם בעלי פוטנציאל קליני משמעותי, אך היישום המעשי שלהם מוגבל בשל פינוי קל in vivo ויציבות ירודה. מיקרו-מחטים מציגות פתרון בכך שהן מאפשרות אספקה מקומית על ידי ניקוב מחסומים פיזיולוגיים ושימור מצב יבש, ובכך נותנות מענה למגבלות מתן האקזוזום ומרחיבות את התועלת הקלינית שלהן.

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

635 Views.  Tianjin University. My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar mi...