Name: В центре внимания автора: Инновационные стратегии на основе микроигл для улучшения доставки и стабильности экзосом
Uploaded: 2024-07-12T14:55:00
Description: Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

F.L.Q. благодарит за поддержку, оказанную Новаторской программой исследований и разработок провинции Чжэцзян (2022C03031), Национальной программой ключевых исследований и разработок Китая (2021YFA0910103), Национальным фондом естественных наук Китая (22274141, 22074080), Фондом естественных наук провинции Шаньдун (ZR2022ZD28) и Программой ученых Тайшань провинции Шаньдун (tsqn201909106). Х.К. выражает признательность за финансовую поддержку от Национального фонда естественных наук Китая (82202329). Авторы признают использование инструментов в Центре общего использования измерительных приборов в Институте медицины Ханчжоу (HIM) Китайской академии наук.

Данное исследование не требует этического разрешения, поскольку свиная кожа, использованная для экспериментов, описанных в разделе 3, была приобретена в качестве съедобных свиных ушей на рынке, а не получена от экспериментальных животных.
1. Выделение экзосом
<o...

Пластыри с микроиглами для устойчивой доставки экзосом в биомедицинских приложениях

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), eaau6977 (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly(amidoamine)+dendrimers:+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform.">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models.">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li><li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes.">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li><li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain.">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy.">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model.">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li><li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH,+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes.">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li><li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment.">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination.">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253 (2023).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array.">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle.">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li><li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery.">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li><li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles.">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644 (2022).</li><li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fear+of+injections+in+young+adults:+Prevalence+and+associations.">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li><li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats.">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li><li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye.">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305 (2022).</li><li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa.">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180 (2019).</li><li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair.">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li><li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer.">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021 (2018).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid:+More+than+a+carrier,+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer.">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081 (2023).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery.">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li></ol>

В настоящее время основными методами выделения экзосом являются ультрацентрифугирование, центрифугирование с градиентом плотности, ультрафильтрация, преципитация, иммуноаффинные магнитные шарики и микрофлюидика24. Из-за ограниченной нагрузочной способности микроигл, в...

Экзосомы, которые представляют собой небольшие везикулы, высвобождаемые клетками во внеклеточный матрикс, были предложены в качестве потенциальных биотерапевтических средств и векторов доставки лекарств для лечения ряда заболеваний и видоврака. В процессе биогенеза экзосомы инкапсулируют различные биологически активные молекулы из клеток, включая функциональные белки и нуклеиновыекислоты. В результате, поглощаемые клетками-реципиентами в процессе транспортировки, экзосомы обладают способностью модулировать экспрессию генов и клеточные функциив клетках-мишенях. В качестве своего рода естественного посланника информации экзосомы были в полной мере использованы в регенерации тканей, иммунной регуляции и вкачестве носителя доставки. С помощью инженерных методов специфические лиганды могут быть обогащены на поверхности экзосом, что позволяет индукционизировать или ингибировать сигнальные события в клетках-реципиентах или нацеливаться на определенные типы клеток. Химиотерапевтические агенты также могут быть загружены в экзосомы для лечения рака6. Кроме того, экзосомы обладают способностью пересекать гематоэнцефалический барьер для доставки терапевтического груза, что делает их весьма перспективными для лечения заболеваний головногомозга. По сравнению с липосомами, экзосомы демонстрируют повышенное поглощение клетками и улучшенную биосовместимость. Они способны эффективно проникать в другие клетки, демонстрируя при этом лучшую переносимость и меньшую токсичность9. Тем не менее, традиционная болюсная инъекция экзосом подвержена секвестрации и быстрому выведению печенью, почками и селезенкой вкровоток. Кроме того, экзосомы обладают плохой стабильностью in vitro и чувствительны к условиям хранения, которые ограничивают ихклиническое применение.
Микроиглы, представляющие собой массив наконечников игл микрометрического размера, обладают способностью проникать через физиологические барьеры для доставки низкомолекулярных лекарств12, белков13, нуклеиновых кислот14 и нанолекарств15. Микроиглы точно спроектированы для нацеливания на поражения на поверхности кожи, а их дисперсные кончики обеспечивают равномерное распределение лекарств в целевом участке, тем самым усиливая их терапевтическое воздействие16. Конструкция и состав материала микроигл облегчают сухое хранение биологически активных веществ, таких как белки и нуклеиновые кислоты, повышая их стабильность17. Традиционные инъекционные методы имеют относительно короткую продолжительность действия и могут вызывать боль, вызывая страх у пациентов18. Микрометровая длина микроиглы сводит к минимуму травмирование тканей и предотвращает стимуляцию нервов, тем самым устраняя боль и улучшая комплаентность пациента19. Кроме того, удобный в использовании характер микроигл позволяет пациентам самостоятельно проводить лечение без необходимости использования специализированного персонала16. Помимо кожи, микроиглы также могут быть использованы в таких тканях, как глаза20, слизистая оболочка полости рта21, сердце22 и кровеносные сосуды23. Применение микроигл для клинической доставки экзосом обеспечивает многообещающую и перспективную стратегию.
В связи с этим мы представляем пластырь с микроиглами (exo@MN), нагруженный экзосомами, и раскрываем метод его изготовления. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием двухэтапного метода литья, наряду с центрифугированием и вакуумной сушкой, что способствует агрегации экзосом на кончиках микроигл, тем самым повышая эффективность доставки. Как кончики игл, так и подложка были изготовлены с использованием материалов, которые демонстрируют превосходную биосовместимость и растворимость в воде. Трегалоза и гиалуроновая кислота (ГК) были включены в качестве материалов наконечника для обеспечения защиты экзосом, а поливинилпирролидон (ПВП), растворенный в абсолютном этаноле, был выбран в качестве основного материала. Морфологию микроигольчатого пластыря охарактеризовали с помощью микроскопии и сканирующего электронного микроскопа (СЭМ). Механические испытания микроигл оценивались с помощью растяжителя, чтобы подтвердить их способность проникать в кожу, а скорость высвобождения из кожи свиньи была исследована как 60 с. Кроме того, морфология, размер и содержание белка как в свежих экзосомах, так и в экзосомах в exo@MN были охарактеризованы с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM), анализа отслеживания наночастиц (NTA) и вестерн-блоттинга (WB). Интернализацию экзосом дендритными клетками (ДК) охарактеризовали с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа (КЛСМ), а созревание ДК оценивали с помощью проточной цитометрии. Морфологическая характеристика и биологические функции двух типов экзосом в основном согласуются.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x penicillin-streptomycin solutions</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 kDa pre-stained protein marker</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Uranyl acetate</td>
			<td>Henan Ruixin Experimental Supplies</td>
			<td>GZ02625</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td>nanoArch S130</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% precast gel</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ExpressPlus PAGE GEL</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215; SDS-PAGE loading buffer</td>
			<td>Titan</td>
			<td>04048254</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alix antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>12422-1-AP</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>ab217345</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104713</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto fine coater</td>
			<td>ZIZHU</td>
			<td>JBA5-100</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0012</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Muitifuge X1R pro</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water vacuum pump</td>
			<td>Yuhua Instrument</td>
			<td>SHZ-D(III)</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellXpert C170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper mesh</td>
			<td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&#160;</td>
			<td>JF-ZJKY/300</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (+) -Trehalose dihydrate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>5138-23-4</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0212</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>PowerPac-basic</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>JR100</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117305</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>Amersham ImageQuant 800</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074S</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTL resin</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td></td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)</td>
			<td>Bloomage Biotechnology</td>
			<td>9004-61-9</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion cleaner</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EC-52000IC</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Observe the microneedle tip dissolving process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8</td>
			<td>MeisenCTCC</td>
			<td>&#160;CC90105</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView</td>
			<td>Size analysis of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107619</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST507</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Hefei Kejing Material Technology</td>
			<td>PDC-36G</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>9016-00-6</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9</td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-snap centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344619</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>C1053</td>
			<td>Lysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell park memorial institute 1640</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0548</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Characterization of morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super ECL detection reagent</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>P1030</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tensile meter</td>
			<td>Instron</td>
			<td>68SC-05</td>
			<td>Mechanical testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100plus</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>JF-A500027-0004</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>Exosomes concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum drying oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Technology</td>
			<td>DZF-6024</td>
			<td>Fabrication of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-500-XT</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fabrication and characterization of microneedle patches for loading and delivery of exosomes

Экзосомы, как новые биотерапевтические средства «следующего поколения» и векторы доставки лекарств, обладают огромным потенциалом в различных областях биомедицины, начиная от доставки лекарств и регенеративной медицины и заканчивая диагностикой заболеваний и иммунотерапией опухолей. Однако быстрый клиренс при традиционной болюсной инъекции и плохая стабильность экзосом ограничивают их клиническое применение. Микроиглы служат раствором, который продлевает время пребывания экзосом в месте введения, тем самым поддерживая концентрацию препарата и способствуя длительному терапевтическому эффекту. Кроме того, микроиглы также обладают способностью поддерживать стабильность биоактивных веществ. Поэтому мы представляем пластырь с микроиглами для загрузки и доставки экзосом и делимся методами, включая выделение экзосом, изготовление и характеристику нагруженных экзосомами микроигольчатых пластырей. Пластыри с микроиглами были изготовлены с использованием трегалозы и гиалуроновой кислоты в качестве материалов наконечника и поливинилпирролидона в качестве основного материала с помощью двухэтапного метода литья. Микроиглы продемонстрировали высокую механическую прочность, а наконечники были способны выдержать 2 Н. Для имитации человеческой кожи использовалась свиная кожа, и кончики микроигл полностью расплавились в течение 60 с после прокола кожи. Экзосомы, высвобождаемые из микроигл, демонстрировали морфологию, размер частиц, маркерные белки и биологические функции, сопоставимые с таковыми у свежих экзосом, что позволяло дендритным клеткам поглощать и способствовать их созреванию.

Exosomes, which are small vesicles released by cells into the extracellular matrix, have been proposed as potential biotherapeutics and drug delivery vectors for the treatment of several diseases and cancers1. During their biogenesis process, exosomes encapsulate various biologically active molecules from within the cells, including functional proteins and nucleic acids2. As a result, when taken up by recipient cells during the transport process, exosomes have the ability to modulate gene expression and cellular functions in the target cells3. As a kind of natural information messenger, exosomes have been fully taken advantage of in tissue regeneration, immune regulation, and as a delivery carrier4. Through engineering techniques, specific ligands can be enriched on the surface of exosomes, enabling the induction or inhibition of signaling events in recipient cells or targeting specific cell types5. Chemotherapeutic agents can also be loaded into exosomes for cancer treatment6. Moreover, exosomes have the ability to cross the blood-brain barrier for therapeutic cargo delivery, making them highly promising for the treatment of brain disorders7. Compared to liposomes, exosomes exhibit enhanced cellular uptake and improved biocompatibility8. They are capable of efficiently entering other cells while demonstrating better tolerance and lower toxicity9. However, the traditional bolus injection of exosomes is prone to sequestration and rapid clearance by the liver, kidneys, and spleen in the bloodstream10. Moreover, exosomes have poor stability in vitro and are susceptible to storage conditions, which restrict their clinical applications11.
Microneedles, an array of micrometric-sized needle tips, have the capability to penetrate physiological barriers for the delivery of small molecule drugs12, proteins13, nucleic acids14, and nanomedicines15. Microneedles are precisely engineered to target lesions on the skin surface, and their dispersed tips ensure uniform drug distribution at the targeted site, thus amplifying their therapeutic impact16. The design and material composition of microneedles facilitate&#160;the dry storage of bioactive substances such as proteins and nucleic acids, enhancing their stability17. Traditional injection methods have a relatively short duration of action and can cause pain, inducing fear in patients18. The micrometer-sized length of microneedle minimizes tissue trauma and prevents nerve stimulation, thereby eliminating pain and improving patient compliance19. Additionally, the user-friendly nature of microneedles allows patients to self-administer the treatment without the need for specialized personnel16. In addition to the skin, microneedles can also be used in tissues such as the eyes20, oral mucosa21, heart22, and blood vessels23. The application of microneedles for the clinical delivery of exosomes provides a promising and prospective strategy.
Hence, we introduce an exosome-loaded microneedle (exo@MN) patch and disclose its fabrication method. The microneedle patches were fabricated using a two-step casting method, along with centrifugation and vacuum drying, which promotes the aggregation of exosomes at the microneedle tips, thereby enhancing delivery efficiency. Both the needle tips and backing were constructed using materials that exhibit excellent biocompatibility and water solubility. Trehalose and hyaluronic acid (HA) were incorporated as tip materials to provide protection for the exosomes, and polyvinylpyrrolidone (PVP) dissolved in absolute ethanol was chosen as the backing material. The morphology of the microneedle patch was characterized using microscopy and scanning electron microscope&#160;(SEM). The mechanical testing of the microneedle was assessed using a tensile meter to confirm their capability to penetrate the skin, and the release rate on pig skin was investigated to be 60 s. Furthermore, the morphology, size, and protein content of both fresh exosomes and exosomes in exo@MN were characterized using transmission electron microscope&#160;(TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting (WB). The internalization of exosomes by dendritic cells (DCs) was characterized using confocal laser scanning microscope&#160;(CLSM), and the maturation of DCs was evaluated through flow cytometry. The morphological characterization and biological functions of the two types of exosomes are essentially consistent.

В центре внимания автора: Инновационные стратегии на основе микроигл для улучшения доставки и стабильности экзосом

Изготовление и определение характеристик микроигольчатых пластырей для загрузки и доставки экзосом

My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar microneedles for delivery of exosomes.We use microneedle to pierce the biological barrier and then deliver exocells directly to the vector area efficiently. By storing them dry, we enhance their stability, making them precise, easy, and convenient for both clinical and home use. My lab, we focused on key technologies for developing the advanced microneedle-based delivery systems and that can load and deliver various therapeutics.Includes MRA, small molecular drug, antibodies, cell, and exosome. We are also investigate their chemical and physical properties and therapeutic efficacy in different biomedical applications.

Здесь мы представляем протокол выделения экзосом, изготовления и характеризации exo@MN патча. На рисунке 1 показана технологическая схема изготовления exo@MN патча. Экзосомы смешивали с трегалозой и ГК, а затем смесь добавляли в форму для микроигл и центрифугировали. Этот пр?...

Экзосомы обладают значительным клиническим потенциалом, но их практическое применение ограничено из-за легкого клиренса in vivo и плохой стабильности. Микроиглы представляют собой решение, обеспечивающее локализованную доставку путем прокола физиологических барьеров и сохранения в сухом состоянии, тем самым устраняя ограничения введения экзосом и расширяя их клиническую полезность.

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging from drug delivery and regenerative medicine to disease diagnosis and tumor immunotherapy. However, the rapid clearance by traditional bolus injection and poor stability of exosomes restrict their clinical application. Microneedles serve as a solution that prolongs the residence time of exosomes at the administration site, thereby maintaining the drug concentration and facilitating sustained therapeutic effects. In addition, microneedles also possess the ability to maintain the stability of bioactive substances. Therefore, we introduce a microneedle patch for loading and delivering exosomes and share the methods, including isolation of exosomes, fabrication, and characterization of exosome-loaded microneedle patches. The microneedle patches were fabricated using trehalose and hyaluronic acid as the tip materials and polyvinylpyrrolidone as the backing material through a two-step casting method. The microneedles demonstrated robust mechanical strength, with tips able to withstand 2 N. Pig skin was used to simulate human skin, and the tips of microneedles completely melted within 60 s after skin puncture. The exosomes released from the microneedles exhibited morphology, particle size, marker proteins, and biological functions comparable to those of fresh exosomes, enabling dendritic cells uptake and promoting their maturation.

Exosomes possess significant clinical potential, but their practical application is limited due to easy in vivo clearance and poor stability. Microneedles present a solution by enabling localized delivery by puncturing physiological barriers and dry-state preservation, thereby addressing the limitations of exosome administration and expanding their clinical utility.

Isolation of Exosomes from Mouse Ovarian Epithelial Cancer Cells for Generating Microneedle Patch

To begin, take cultured mouse ovarian epithelial cancer cells. Remove the culture medium from the Petri dishes and wash twice with DPBS. Add 20 milliliters of Dulbecco's Modified Eagle Medium without FBS and penicillin-streptomycin solution.Incubate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 48 hours. Then collect the cell culture supernatant from 20 Petri dishes of 15-centimeter diameter. Centrifuge at 300 G for 10 minutes at four degrees Celsius and collect the supernatant.Centrifuge the supernatant at 2, 000 G for 10 minutes at four degrees Celsius, and collect the supernatant to remove cellular debris. Now turn on the vacuum pump and connect it to the air inlet of the vacuum filtration system. Filter the supernatant through the 0.22-micron polyethersulfone membrane to remove vesicles or impurities larger than 0.22 microns.Add 15 milliliters of the filtered supernatant to the inner tube of the 100-kilodalton ultrafiltration tube. Centrifuge at 3, 500 G for 10 minutes at four degrees Celsius. Then remove the liquid from the outer tube.Next, collect the liquid from the inner tube. Add one milliliter of DPBS to the inner tube. Pipette repeatedly to resuspend exosomes, and then collect them.Centrifuge the liquid at 10, 000 G for 60 minutes at four degrees Celsius. Transfer the supernatant to a six-milliliter quick-snap centrifuge tube and seal it with a heat sealer. Cut open the tube after ultracentrifuging the supernatant for two hours.Once the supernatant is removed, resuspend the pellet in 100 microliters of DPBS to obtain the exosome solution.

Выделение экзосом из эпителиальных клеток эпителия яичников мышей для получения микроигольчатого пластыря

Fabrication of Microneedle Using Exosomes Isolated from Mouse Ovarian Epithelial Cancer Cells

To begin, mix components A and B of polydimethylsiloxane, or PDMS, in a ratio of 10 to one. After stirring the mixture well, pour the mixture into a master mold. Place the PDMS mold under a pressure of one pound per square inch for 15 minutes to remove air bubbles.Cure the PDMS mold at 60 degrees Celsius for two hours. De-mold to obtain the production mold of the microneedle. Then, clean the production mold with ultra pure water before use.Quantify the protein content of the prepared exosome solution using a BCA assay kit. Add an appropriate amount of DPBS to the exosome solution. Now, prepare a solution of 200 milligrams per milliliter of trehalose using DPBS as the solvent.Stir for 20 minutes to ensure full dissolution. Next, prepare a solution of hyaluronic acid and polyvinylpyrrolidone, or PVP, using DPBS and ethanol as the solvent, respectively. Stir overnight to ensure full dissolution.Mix the exosome solution and trehalose solution in an equal ratio. Add an equal volume of hyaluronic acid solution and mix thoroughly to obtain the tip solution. Using a plasma cleaner, process the surface of the PDMS mold for 30 seconds at a low grade to enhance its hydrophilicity.Add 40 microliters of the tip solution to the PDMS mold. Centrifuge at 3, 000G for three minutes at room temperature to ensure the liquid fills the needle layer of the mold. Remove excess liquid from the mold and dry at room temperature in a vacuum drying oven for one day.Then, add 200 microliters of PVP solution to the PDMS mold. Centrifuge at 3, 000G for three minutes at room temperature to ensure the liquid fills the mold's backing layer. After drying the mold for one day, de-mold to obtain the exosome-loaded microneedle's patch.

Изготовление микроигл с использованием экзосом, выделенных из клеток эпителиального рака яичников мышей

Morphological and Mechanical Characterization of Exosome Loaded Microneedle Patches

To begin, prepare the exosome loaded microneedle patch and paste its backing onto a 45-degree inclined surface. Position the patch under a stereo microscope. Turn on the illuminator and capture the morphology of the patch using a four times objective lens.For mechanical testing, cut out a three-by-three array from the patch and place it with the tips facing upwards on the rigid platform of a tensile meter. Adjust the height of the probe to bring it close to the needle tips without touching them. Set the parameters to stop automatically when the pressure reaches 20 Newton.Compress the needle tips vertically at a 0.5 millimeter per minute speed before recording the load versus displacement profile. The tips in the exosome loaded microneedle patch exhibited a conical shape arranged in a 10-by-10 array with sharp and intact needle tips. The tip of the microneedle can withstand the force of two Newtons, allowing it to penetrate through the skin barrier.