F.L.Q. agradece el apoyo del Programa Pionero de Investigación y Desarrollo de Zhejiang (2022C03031), el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (2021YFA0910103), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (22274141, 22074080), la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Shandong (ZR2022ZD28) y el Programa de Becarios Taishan de la Provincia de Shandong (tsqn201909106). H.C. agradece el apoyo financiero de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82202329). Los autores reconocen el uso de instrumentos en la Instalación Central de Instrumentación Compartida en el Instituto de Medicina de Hangzhou (HIM) de la Academia China de Ciencias.

Este estudio no requiere autorización ética, ya que la piel de cerdo utilizada para los experimentos descritos en la sección 3 se compró como orejas de cerdo comestibles en el mercado y no se obtuvo de animales de experimentación.
1. Aislamiento de exosomas
<ol><li>Cultivo celular<ol><li>Cultive células de cáncer epitelial de ovario de ratón ID8 en el medio de cultivo Eagle Medium Modified (DMEM) de Dulbecco que contiene un 10% de suero fetal bovino y una solución d...

Parches de microagujas para la administración sostenida de exosomas en aplicaciones biomédicas

<ol>
	<li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases.">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li><li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biology,+function,+and+biomedical+applications+of+exosomes.">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), eaau6977 (2020).</li><li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication.">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li><li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly(amidoamine)+dendrimers:+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform.">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li><li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models.">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li><li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes.">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li><li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain.">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li><li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy.">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li><li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells.">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730 (2017).</li><li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model.">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li><li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH,+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes.">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li><li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment.">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li><li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination.">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253 (2023).</li><li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array.">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li><li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle.">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li><li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery.">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li><li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles.">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644 (2022).</li><li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fear+of+injections+in+young+adults:+Prevalence+and+associations.">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li><li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats.">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li><li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye.">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305 (2022).</li><li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa.">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180 (2019).</li><li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair.">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li><li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer.">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li><li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization.">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021 (2018).</li><li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage.">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162 (2016).</li><li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hyaluronic+acid:+More+than+a+carrier,+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer.">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081 (2023).</li><li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery.">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li></ol>

H. C., F.L.Q y S.J.M son inventores de una solicitud de patente que se ha presentado sobre la base de los datos de este manuscrito. H.C. es el fundador científico de Medcraft Biotech. Inc.

En la actualidad, los principales métodos de aislamiento de exosomas son la ultracentrifugación, la centrifugación en gradiente de densidad, la ultrafiltración, la precipitación, las perlas magnéticas de inmunoafinidad y la microfluídica24. Debido a la limitada capacidad de carga de las microagujas causada por su pequeño espacio en la punta de la aguja, es necesario aumentar la concentración de exosomas para cargar más. Por lo tanto, elegimos la ultrafiltración para concentrar el sobren...

Los exosomas, que son pequeñas vesículas liberadas por las células en la matriz extracelular, se han propuesto como potenciales bioterapéuticos y vectores de administración de fármacos para el tratamiento de varias enfermedades y cánceres1. Durante su proceso de biogénesis, los exosomas encapsulan varias moléculas biológicamente activas desde el interior de las células, incluidas las proteínas funcionales y los ácidos nucleicos2. Como resultado, cuando son absorbidos por las células receptoras durante el proceso de transporte, los exosomas tienen la capacidad de modular la expresión génica y las funciones celulares en las células diana3. Como una especie de mensajero de información natural, los exosomas se han aprovechado plenamente en la regeneración de tejidos, la regulación inmunitaria y como portadores de entrega4. A través de técnicas de ingeniería, se pueden enriquecer ligandos específicos en la superficie de los exosomas, lo que permite la inducción o inhibición de eventos de señalización en las células receptoras o se dirige a tipos específicosde células 5. Los agentes quimioterapéuticos también pueden cargarse en exosomas para el tratamiento del cáncer6. Además, los exosomas tienen la capacidad de cruzar la barrera hematoencefálica para la entrega de carga terapéutica, lo que los hace muy prometedores para el tratamiento de trastornos cerebrales7. En comparación con los liposomas, los exosomas presentan una mayor absorción celular y una mejor biocompatibilidad8. Son capaces de entrar eficientemente en otras células, al tiempo que demuestran una mejor tolerancia y una menor toxicidad9. Sin embargo, la inyección tradicional en bolo de exosomas es propensa al secuestro y a la rápida eliminación por parte del hígado, los riñones y el bazo enel torrente sanguíneo. Además, los exosomas tienen poca estabilidad in vitro y son susceptibles a condiciones de almacenamiento que restringen sus aplicaciones clínicas11.
Las microagujas, un conjunto de puntas de aguja de tamaño micrométrico, tienen la capacidad de penetrar las barreras fisiológicas para la administración de fármacos de moléculas pequeñas12, proteínas13, ácidos nucleicos14 y nanomedicinas15. Las microagujas están diseñadas con precisión para atacar las lesiones en la superficie de la piel, y sus puntas dispersas garantizan una distribución uniforme del fármaco en el sitio objetivo, amplificando así su impacto terapéutico16. El diseño y la composición del material de las microagujas facilitan el almacenamiento en seco de sustancias bioactivas como proteínas y ácidos nucleicos, mejorando su estabilidad17. Los métodos tradicionales de inyección tienen una duración de acción relativamente corta y pueden causar dolor, induciendo miedo en los pacientes18. La longitud de la microaguja, del tamaño de un micrómetro, minimiza el trauma tisular y evita la estimulación nerviosa, eliminando así el dolor y mejorando la distensibilidad del paciente19. Además, la facilidad de uso de las microagujas permite a los pacientes autoadministrarse el tratamiento sin necesidad de personal especializado16. Además de la piel, las microagujas también se pueden utilizar en tejidos como los ojos20, la mucosa oral21, el corazón22 y los vasos sanguíneos23. La aplicación de microagujas para la administración clínica de exosomas proporciona una estrategia prometedora y prospectiva.
Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas (exo@MN) cargado con exosomas y divulgamos su método de fabricación. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando un método de fundición de dos pasos, junto con centrifugación y secado al vacío, que promueve la agregación de exosomas en las puntas de las microagujas, mejorando así la eficiencia de la administración. Tanto las puntas de las agujas como el soporte se construyeron con materiales que exhiben una excelente biocompatibilidad y solubilidad en agua. Se incorporaron trehalosa y ácido hialurónico (AH) como materiales de punta para proporcionar protección a los exosomas, y se eligió polivinilpirrolidona (PVP) disuelto en etanol absoluto como material de soporte. La morfología del parche de microagujas se caracterizó mediante microscopía y microscopio electrónico de barrido (SEM). Las pruebas mecánicas de la microaguja se evaluaron utilizando un tensímetro para confirmar su capacidad para penetrar en la piel, y se investigó que la tasa de liberación en la piel de cerdo era de 60 s. Además, se caracterizó la morfología, el tamaño y el contenido de proteínas de los exosomas frescos y de los exosomas en exo@MN mediante microscopio electrónico de transmisión (TEM), análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) y Western blot (WB). La internalización de exosomas por células dendríticas (CD) se caracterizó mediante microscopio láser confocal de barrido (CLSM) y la maduración de las CD se evaluó mediante citometría de flujo. La caracterización morfológica y las funciones biológicas de los dos tipos de exosomas son esencialmente consistentes.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>100x penicillin-streptomycin solutions</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>MA0110</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>180 kDa pre-stained protein marker</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>26616</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3% Uranyl acetate</td>
			<td>Henan Ruixin Experimental Supplies</td>
			<td>GZ02625</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3D printer</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td>nanoArch S130</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4%&#8211;20% precast gel</td>
			<td>Genscript</td>
			<td>ExpressPlus PAGE GEL</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5&#215; SDS-PAGE loading buffer</td>
			<td>Titan</td>
			<td>04048254</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse Alix antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>12422-1-AP</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD63 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>ab217345</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC anti-mouse CD80 antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>104713</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto fine coater</td>
			<td>ZIZHU</td>
			<td>JBA5-100</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BCA assay kit</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0012</td>
			<td>Protein concentration assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>Muitifuge X1R pro</td>
			<td>Cell centrifuge</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Circulating water vacuum pump</td>
			<td>Yuhua Instrument</td>
			<td>SHZ-D(III)</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CO2 incubator</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>CellXpert C170</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal laser scanning microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>A1HD25</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Copper mesh</td>
			<td>Beijing Zhongjingkeyi Technology&#160;</td>
			<td>JF-ZJKY/300</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D- (+) -Trehalose dihydrate</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>5138-23-4</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0212</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate-buffered saline</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0010</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrophoresis system</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>PowerPac-basic</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Jrunbio Scientific</td>
			<td>JR100</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FITC anti-mouse CD11c antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>117305</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD</td>
			<td>LSR Fortessa</td>
			<td>Fluorescence detection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel imager</td>
			<td>Cytiva</td>
			<td>Amersham ImageQuant 800</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HRP-conjugated anti-rabbit IgG</td>
			<td>CST</td>
			<td>7074S</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HTL resin</td>
			<td>BMF technology</td>
			<td></td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyaluronic acid (MW = 300 kDa)</td>
			<td>Bloomage Biotechnology</td>
			<td>9004-61-9</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immersion oil</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>MXA22168</td>
			<td>Fluorescence imaging</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ion cleaner</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>EC-52000IC</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX53</td>
			<td>Observe the microneedle tip dissolving process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse ovarian epithelial cancer cell ID8</td>
			<td>MeisenCTCC</td>
			<td>&#160;CC90105</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanoparticle tracking analysis</td>
			<td>Particle Metrix</td>
			<td>ZetaView</td>
			<td>Size analysis of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pacific Blue anti-mouse I-A/I-E antibody</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>107619</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST507</td>
			<td>Protease inhibitors</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plasma cleaner</td>
			<td>Hefei Kejing Material Technology</td>
			<td>PDC-36G</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane</td>
			<td>Dow Corning</td>
			<td>9016-00-6</td>
			<td>Mold preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyvinylpyrrolidone (MW = 40 kDa)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>9003-39-8</td>
			<td>Fabrication of microneedle&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism&#160;</td>
			<td>GraphPad</td>
			<td>Version 9</td>
			<td>Statistical analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF membrane</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>IPVH00010</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quick-snap centrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>344619</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RIPA lysis buffer</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>C1053</td>
			<td>Lysis membrane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Roswell park memorial institute 1640</td>
			<td>Meilunbio</td>
			<td>MA0548</td>
			<td>Cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scanning electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JSM-IT800</td>
			<td>Morphological characterization of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereo microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>SZX16</td>
			<td>Characterization of morphology</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Super ECL detection reagent</td>
			<td>Applygen</td>
			<td>P1030</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tensile meter</td>
			<td>Instron</td>
			<td>68SC-05</td>
			<td>Mechanical testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission electron microscope</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>JEM-2100plus</td>
			<td>Morphological characterization of exosomes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris buffered saline</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>JF-A500027-0004</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween-20</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>ST825</td>
			<td>Western blotting</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrifuge</td>
			<td>Beckman</td>
			<td>Optima XPN-100</td>
			<td>Exosomes extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultrafiltration tube</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC910096</td>
			<td>Exosomes concentration</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum drying oven</td>
			<td>Shanghai Yiheng Technology</td>
			<td>DZF-6024</td>
			<td>Fabrication of microneedle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum filtration system</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BS-500-XT</td>
			<td>Filtration</td>
		</tr>
	</tbody>
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fabrication and characterization of microneedle patches for loading and delivery of exosomes

Los exosomas, como bioterapéuticos emergentes de "próxima generación" y vectores de administración de fármacos, tienen un inmenso potencial en diversos campos biomédicos, que van desde la administración de fármacos y la medicina regenerativa hasta el diagnóstico de enfermedades y la inmunoterapia tumoral. Sin embargo, el rápido aclaramiento mediante la inyección tradicional en bolo y la escasa estabilidad de los exosomas restringen su aplicación clínica. Las microagujas sirven como una solución que prolonga el tiempo de residencia de los exosomas en el sitio de administración, manteniendo así la concentración del fármaco y facilitando efectos terapéuticos sostenidos. Además, las microagujas también poseen la capacidad de mantener la estabilidad de las sustancias bioactivas. Por lo tanto, presentamos un parche de microagujas para cargar y administrar exosomas y compartimos los métodos, incluido el aislamiento de exosomas, la fabricación y la caracterización de parches de microagujas cargados con exosomas. Los parches de microagujas se fabricaron utilizando trehalosa y ácido hialurónico como materiales de punta y polivinilpirrolidona como material de soporte a través de un método de fundición de dos pasos. Las microagujas demostraron una resistencia mecánica robusta, con puntas capaces de soportar 2 N. Se utilizó piel de cerdo para simular la piel humana, y las puntas de las microagujas se derritieron completamente dentro de los 60 segundos posteriores a la punción de la piel. Los exosomas liberados por las microagujas mostraron morfología, tamaño de partícula, proteínas marcadoras y funciones biológicas comparables a las de los exosomas frescos, lo que permitió la absorción de las células dendríticas y promovió su maduración.

Exosomes, which are small vesicles released by cells into the extracellular matrix, have been proposed as potential biotherapeutics and drug delivery vectors for the treatment of several diseases and cancers1. During their biogenesis process, exosomes encapsulate various biologically active molecules from within the cells, including functional proteins and nucleic acids2. As a result, when taken up by recipient cells during the transport process, exosomes have the ability to modulate gene expression and cellular functions in the target cells3. As a kind of natural information messenger, exosomes have been fully taken advantage of in tissue regeneration, immune regulation, and as a delivery carrier4. Through engineering techniques, specific ligands can be enriched on the surface of exosomes, enabling the induction or inhibition of signaling events in recipient cells or targeting specific cell types5. Chemotherapeutic agents can also be loaded into exosomes for cancer treatment6. Moreover, exosomes have the ability to cross the blood-brain barrier for therapeutic cargo delivery, making them highly promising for the treatment of brain disorders7. Compared to liposomes, exosomes exhibit enhanced cellular uptake and improved biocompatibility8. They are capable of efficiently entering other cells while demonstrating better tolerance and lower toxicity9. However, the traditional bolus injection of exosomes is prone to sequestration and rapid clearance by the liver, kidneys, and spleen in the bloodstream10. Moreover, exosomes have poor stability in vitro and are susceptible to storage conditions, which restrict their clinical applications11.
Microneedles, an array of micrometric-sized needle tips, have the capability to penetrate physiological barriers for the delivery of small molecule drugs12, proteins13, nucleic acids14, and nanomedicines15. Microneedles are precisely engineered to target lesions on the skin surface, and their dispersed tips ensure uniform drug distribution at the targeted site, thus amplifying their therapeutic impact16. The design and material composition of microneedles facilitate&#160;the dry storage of bioactive substances such as proteins and nucleic acids, enhancing their stability17. Traditional injection methods have a relatively short duration of action and can cause pain, inducing fear in patients18. The micrometer-sized length of microneedle minimizes tissue trauma and prevents nerve stimulation, thereby eliminating pain and improving patient compliance19. Additionally, the user-friendly nature of microneedles allows patients to self-administer the treatment without the need for specialized personnel16. In addition to the skin, microneedles can also be used in tissues such as the eyes20, oral mucosa21, heart22, and blood vessels23. The application of microneedles for the clinical delivery of exosomes provides a promising and prospective strategy.
Hence, we introduce an exosome-loaded microneedle (exo@MN) patch and disclose its fabrication method. The microneedle patches were fabricated using a two-step casting method, along with centrifugation and vacuum drying, which promotes the aggregation of exosomes at the microneedle tips, thereby enhancing delivery efficiency. Both the needle tips and backing were constructed using materials that exhibit excellent biocompatibility and water solubility. Trehalose and hyaluronic acid (HA) were incorporated as tip materials to provide protection for the exosomes, and polyvinylpyrrolidone (PVP) dissolved in absolute ethanol was chosen as the backing material. The morphology of the microneedle patch was characterized using microscopy and scanning electron microscope&#160;(SEM). The mechanical testing of the microneedle was assessed using a tensile meter to confirm their capability to penetrate the skin, and the release rate on pig skin was investigated to be 60 s. Furthermore, the morphology, size, and protein content of both fresh exosomes and exosomes in exo@MN were characterized using transmission electron microscope&#160;(TEM), nanoparticle tracking analysis (NTA), and western blotting (WB). The internalization of exosomes by dendritic cells (DCs) was characterized using confocal laser scanning microscope&#160;(CLSM), and the maturation of DCs was evaluated through flow cytometry. The morphological characterization and biological functions of the two types of exosomes are essentially consistent.

Autor destacado: Estrategias innovadoras basadas en microagujas para mejorar la administración y la estabilidad de los exosomas

Fabricación y caracterización de parches de microagujas para la carga y entrega de exosomas

My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar microneedles for delivery of exosomes.We use microneedle to pierce the biological barrier and then deliver exocells directly to the vector area efficiently. By storing them dry, we enhance their stability, making them precise, easy, and convenient for both clinical and home use. My lab, we focused on key technologies for developing the advanced microneedle-based delivery systems and that can load and deliver various therapeutics.Includes MRA, small molecular drug, antibodies, cell, and exosome. We are also investigate their chemical and physical properties and therapeutic efficacy in different biomedical applications.

Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento de exosomas, fabricación y caracterización de exo@MN parche. La Figura 1 ilustra el diagrama de flujo del proceso para la fabricación de exo@MN parche. Los exosomas se mezclaron con trehalosa y HA, y luego la mezcla se agregó al molde de microagujas y se centrifugó. Este proceso facilitó la agregación de exosomas en las puntas de las agujas, promoviendo una rápida liberación. Después del secado, se agregó una solución de PVP y s...

Los exosomas poseen un potencial clínico significativo, pero su aplicación práctica es limitada debido a la fácil eliminación in vivo y la poca estabilidad. Las microagujas presentan una solución al permitir la administración localizada mediante la perforación de barreras fisiológicas y la conservación en estado seco, abordando así las limitaciones de la administración de exosomas y ampliando su utilidad clínica.

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

635 Views.  Tianjin University. My research focused on the efficient development of exosomes, the development of the microneedle strategy can increase exsome stability, enhance provide more possibility for the clinical application of exosomes. We will successfully develop the for advanced microneedle delivery systems. Those include self-healing porous microneedles for sustained drug delivery, ultrasound microneedle device for rapid loading and delivery of drugs, and cryomicroneedles for delivery of living cell, and sugar mi...