Name: localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

We willen graag Dr Michael Baker te bedanken voor zijn hulp bij het genereren van concepten voor gen knock-in en voor het verstrekken van de time-lapse filmpjes van de groeiende zintuiglijke projecties. Wij zouden ook graag Virginia Vandelinder bedanken voor technische bijstand met het pneumatische pistool experimenten.

Deeltjes kunnen worden gecoat met verschillende reagentia, zoals dsRNA moleculen, DNA-plasmiden of kleurstoffen. Het type en de diameter van de deeltjes worden gekozen op basis van het reagens en de diepte van het doel cellen in het weefsel: grotere deeltjes dringen verder, maar kan wat schade aan het weefsel veroorzaken. 1. De voorbereiding van dsRNA gecoate deeltjes <ol><li> Plaats 100% isopropanol op ijs. </li><li> Resuspendeer 5 mg gouddeeltjes (S1600ri, Seashell Technology, LLC; gemidd...

<ol>
	<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse.">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression.">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li><li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets.">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li><li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression.">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li><li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles.">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103 (2005).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun.">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li></ol>

In deze demonstratie, gebruikten we de pneumatische capillaire gun om gouddeeltjes te leveren in de cellen in kleine lokale volume van een live-bloedzuiger embryo te kloppen in en-down klop genen. De beoogde regio over het algemeen had een diameter van ~ 150 urn en deeltjes werden gevonden ~ 15 micrometer rond het gemiddelde penetratie diepte, die instelbaar is tussen 0 en 50 um. Wanneer de deeltjes werden bekleed met dsRNA moleculen van het axon begeleiding factor netrine, ze veroorzaakt duidelijk zichtbaar knock-down van netrine uitdrukki...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>gold particles</td>
<td>Other</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>S1600ri</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>binding buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>silicone rubber </td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech

In deze video, tonen we het gebruik van een pneumatisch capillaire pistool voor de nauwkeurige biolistische levering van de reagentia in levend weefsel. We maken gebruik van de procedure voor verstoren genexpressie patronen in geselecteerde segmenten van de bloedzuiger embryo&#39;s, waardoor de onbehandelde segmenten als interne controles. De pneumatische capillaire pistool kan worden gebruikt om interne lagen van cellen te bereiken in een vroeg stadium van ontwikkeling zonder het openen van het monster. Als een methode voor gelokaliseerde introductie van stoffen in levende weefsels, de biolistische levering met het pistool heeft verschillende voordelen: het is snel, contact-vrije en niet-destructief. Bovendien kan een enkele capillair pistool gebruikt worden voor zelfstandige levering van verschillende stoffen. De levering regio kan hebben zijdelingse afmetingen van ~ 50 tot 150 micrometer en strekt zich uit over ~ 15 micrometer rond het gemiddelde penetratie diepte, dat is instelbaar tussen 0 en 50 um. Deze levering heeft het voordeel van de mogelijkheid om een ​​beperkt aantal cellen doel in een geselecteerde locatie midden houdt tussen enkele cel knock down door micro-injectie en de systemische knockdown door extracellulaire injecties of door middel van genetische benaderingen. Voor kloppen beneden of kloppen in de expressie van het axon begeleiding molecuul netrine, die natuurlijk wordt uitgedrukt door enkele centrale neuronen en in de ventrale lichaam muur, maar niet de rug-domein, leveren wij moleculen van dsRNA of plasmide-DNA in het lichaam muur en centrale ganglia. Deze procedure omvat de volgende stappen: (i) de voorbereiding van de experimentele opstelling voor een specifieke test (het aanpassen van de versnelde druk), (ii) het bekleden van de deeltjes met moleculen van dsRNA of DNA, (iii) het laden van de gecoate deeltjes in het pistool, maximaal twee reagentia in een assay, (iv) de voorbereiding van de dieren voor het deeltje levering, (v) de levering van gecoate deeltjes in het te onderzoeken weefsel (body muur of ganglia), en (vi) de verwerking van de embryo&#39;s (immunokleuring, immunohistochemie en neuronale etikettering) om de resultaten te visualiseren, meestal 2 tot 3 dagen na de bevalling. Wanneer de deeltjes werden bekleed met netrine dsRNA, ze veroorzaakt duidelijk zichtbaar knock-down van netrine uitdrukking die zich alleen in cellen met deeltjes (meestal, 1-2 deeltjes per cel). Deeltjes bedekt met een plasmide coderend voor EGFP geïnduceerde fluorescentie in neuronale cellen wanneer ze gestopt in hun kernen.

Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

In deze video laten we een procedure voor een nauwkeurige biolistische levering van de reagentia in levend weefsel met een nieuw miniatuur gen pistool. We kloppen beneden de uitdrukking van het axon begeleiding molecuul netrine in bloedzuiger embryo&#39;s door het leveren van moleculen van dsRNA in het ventrale lichaam muur en ganglia van de afzonderlijke segmenten.

Gelokaliseerde RNAi en ectopische genexpressie in de medicinale bloedzuiger

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

De vervaardiging van primaire hematopoietische cellen culturen uit Murine Bone Marrow voor Elektroporatie

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Elektrofysiologie

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Met behulp van de Gene Puiser MXcell Elektroporatie systeem om primaire cellen transfecteren met een hoog rendement

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotica en Dynamic Image Analysis voor Studies van genexpressie in plantenweefsels

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Met behulp van een geautomatiseerde cel Counter aan Gene Expression Studies Vereenvoudigen: siRNA Knockdown van IL-4 Afhankelijk van genexpressie in cellen Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffine ingebedde en vriescoupes van Drosophila Adult Spieren

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro reconstitutie van de Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown en Transgenese door micro-injectie in de Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse van Global RNA synthese in de Single Cell Level volgende Hypoxie

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Meting van Metabolic Rate in<em&gt; Drosophila</em&gt; Gebruik respirometrietest

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...