Name: localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

ברצוננו להודות לד&quot;ר מיכאל בייקר על עזרתו ביצירת מבנים עבור גן עקום פנימה לצורך מתן זמן לשגות סרטים התחזיות החושית הגוברת. אנחנו רוצים גם להודות וירג&#39;יניה Vandelinder לקבלת סיוע טכני עם הניסויים אקדח פנאומטי.

חלקיקים יכולים להיות מצופים חומרים כימיים שונים, כגון מולקולות dsRNA, פלסמידים DNA או צבעים. סוג וקוטרו של חלקיקים נבחרים על פי מגיב ועומק התאים היעד ברקמות: חלקיקים גדולים יותר לחדור, אך עלול לגרום נזק לרקמה. 1. הכנה של חלקיקים dsRNA מצופה...

<ol>
	<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse.">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression.">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li><li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets.">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li><li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression.">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li><li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles.">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103 (2005).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun.">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li></ol>

בהפגנה זו, השתמשנו אקדח פנאומטי נימי להעביר חלקיקי זהב לתוך תאים בנפח מקומי קטן של העובר עלוקה לחיות לדפוק-in לדפוק למטה גנים. אזור היעד היה בדרך כלל בקוטר של ~ 150 מיקרומטר וחלקיקים נמצאו ~ 15 מיקרומטר סביב עומק החדירה מתכוון, אשר מתכווננת בין 0 ל 50 מיקרומטר. כאשר החלקיקים היו מצופים ?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>gold particles</td>
<td>Other</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>S1600ri</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>binding buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>silicone rubber </td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech

בסרטון הזה, אנו מראים את השימוש באקדח פנאומטי נימי עבור משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך רקמת חיים. אנו משתמשים בהליך לביטוי דפוסי להפריע גנים מגזרים נבחרים של עוברים עלוקה, עוזב את פלחי מטופל כמו בקרות פנימיות. אקדח פנאומטי נימי ניתן להשתמש כדי להגיע לשכבות הפנימיות של תאים בשלבים המוקדמים של הפיתוח מבלי לפתוח את הדגימה. כשיטה מבוא מקומי של חומרים אל תוך רקמות חיות, המסירה biolistic עם האקדח יש מספר יתרונות: הוא מהיר, ללא מגע ולא הרסנית. בנוסף, אקדח נימי יחיד יכול לשמש לאספקת עצמאית של חומרים שונים. אזור המשלוח יכול להיות ממדים לרוחב של ~ 50-150 מיקרומטר והוא משתרע על פני כ ~ 15 מיקרומטר עומק החדירה מתכוון, אשר מתכווננת בין 0 ל 50 מיקרומטר. מסירה זו יש את היתרון של היכולת היעד מספר מוגבל של תאים במיקום שנבחר ביניים בין תא בודד להפיל על ידי microinjection ו מציאה מערכתי באמצעות זריקות או תאיים באמצעות גישות גנטיות. עבור דריסה או לדפוק בביטוי של Netrin מולקולה הדרכה האקסון, אשר באה לידי ביטוי באופן טבעי על ידי כמה נוירונים המרכזי בקיר גוף הגחון, אך לא את תחום הגבי, אנו מספקים מולקולות של dsRNA או DNA פלסמיד, לתוך הקיר הגוף מרכזי הגרעינים. הליך זה כולל את השלבים הבאים: (א) הכנת תוכנית ההתקנה ניסיוני assay מסוים (התאמת הלחץ מאיץ), (ii) ציפוי חלקיקים עם מולקולות של dsRNA או DNA, (iii) טעינת חלקיקים מצופים לתוך האקדח, עד שני ריאגנטים באחד assay, (ד) הכנת חיות למסירה החלקיקים, (v) משלוח של חלקיקים מצופים לרקמת המטרה (קיר הגוף או הגנגליונים), ו (vi) עיבוד עוברי (immunostaining אימונוהיסטוכימיה ו העצבית תיוג) כדי לחזות את התוצאות, בדרך כלל 2 עד 3 ימים לאחר הלידה. כאשר החלקיקים היו מצופים netrin dsRNA, הם גרמו בבירור לדפוק למטה הביטוי netrin שרק התרחש התאים המכילים חלקיקים (בדרך כלל, 1-2 חלקיקים בכל תא). חלקיקים מצופים פלואורסצנטי קידוד פלסמיד EGFP המושרה בתאים עצביים כאשר הם עצרו הגרעינים שלהם.

Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

בסרטון הזה, אנו מראים נוהל משלוח biolistic מדויק של חומרים כימיים לתוך הרקמה לחיות עם אקדח גנים רומן זעיר. אנחנו מפילה את הביטוי של מולקולות הנחיה Netrin האקסון בעוברים עלוקה על ידי אספקת מולקולות של dsRNA בקיר גוף הגחון ועל הגרעינים של מגזרים בודדים.

לוקליזציה RNAi ו ביטוי גנים מחוץ לרחם של עלוקה מרפא

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

הכנת ראשי בתרביות תאים hematopoietic ממח העצם Murine עבור electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

חוט השדרה Electrophysiology

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

שימוש ג&#39;ין Pulser מערכת MXcell electroporation כדי Transfect תאים ראשוניים עם יעילות גבוהה

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

רובוטיקה ניתוח תמונה דינאמית ללימודים של ביטוי גנים ברקמות הצמח

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

שימוש מונה תא אוטומטי כדי לפשט את הביטוי מחקרים ג&#39;ין: siRNA מציאה הביטוי IL 4-Gene תלויים תאים Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

מדורים פרפין-Embedded קפואים של תסיסנית סקס שרירים

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

ב הכינון במבחנה של ט פעילים castaneum שהטלומרז

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi מתווכת מציאה ין Transgenesis ידי Microinjection ב נמטודות Necromenic Pristionchus פקיפיקוס</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

מדידה של קצב חילוף החומרים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; באמצעות Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...