Name: localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

Gostaríamos de agradecer ao Dr. Michael Baker pela sua ajuda na geração de construções para gene knock-in e por fornecer os filmes de lapso de tempo de crescer projeções sensoriais. Gostaríamos também de agradecer a Virginia Vandelinder de assistência técnica com os experimentos pistola pneumática.

Partículas podem ser revestidos com reagentes diferentes, tais como moléculas de dsRNA, plasmídeos DNA ou corantes. O tipo eo diâmetro das partículas são escolhidos de acordo com o reagente e da profundidade das células-alvo no tecido: partículas maiores penetrar mais, mas pode causar algum dano ao tecido. 1. Preparação de partículas dsRNA revestido <ol><li> Coloque 100% isopropanol no gelo. </li><li> Ressuspender 5 mg partículas de ouro (S1600ri, Seashell Technology, LLC; diâm...

<ol>
	<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse.">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression.">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li><li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets.">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li><li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression.">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li><li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles.">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103 (2005).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun.">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li></ol>

Nesta demonstração, utilizamos a pistola pneumática capilar para entregar partículas de ouro em células localizadas no volume pequeno de um embrião vivo para sanguessuga knock-in e knock-down genes. A região-alvo, geralmente tinha um diâmetro de ~ 150 mm e partículas foram encontrados ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que era ajustável entre 0 e 50 mm. Quando as partículas foram revestidos com moléculas de dsRNA do netrin fator de orientação axônio, eles causaram claramente visível knock-down de netrin...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>gold particles</td>
<td>Other</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>S1600ri</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>binding buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>silicone rubber </td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech

Neste vídeo, mostramos o uso de uma pistola pneumática capilar para a entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo. Nós usamos o procedimento de padrões de expressão gênica perturb em segmentos selecionados de embriões sanguessuga, deixando os segmentos não tratados como controles internos. A pistola pneumática capilar pode ser utilizada para atingir camadas internas de células em estágios iniciais de desenvolvimento sem abrir o espécime. Como um método para a introdução de substâncias localizadas em tecidos vivos, a entrega biobalística com a arma tem várias vantagens: é rápido, sem contato e não-destrutivos. Além disso, uma arma única capilar pode ser utilizado para a entrega independente de substâncias diferentes. A região de entrega pode ter dimensões laterais de ~ 50-150 mm e se estende por ~ 15 mm em torno da profundidade de penetração média, que é ajustável entre 0 e 50 mm. Esta entrega tem a vantagem de ser capaz de atingir um número limitado de células em um local selecionado intermediário entre célula única derrubar por microinjeção e knockdown sistêmica através de injeções extracelular ou por meio de abordagens genéticas. Para derrubar ou bater na expressão da molécula de orientação netrin axônio, que é naturalmente expresso por alguns neurônios centrais e na parede ventral do corpo, mas não o domínio do dorsal, nós entregamos moléculas de dsRNA ou DNA-plasmídeo na parede do corpo e gânglios central. Este procedimento inclui as seguintes etapas: (i) preparação da montagem experimental para um teste específico (ajustando a pressão de aceleração), (ii) revestimento das partículas com as moléculas de dsRNA ou DNA, (iii) o carregamento das partículas revestido na arma, até dois reagentes em um ensaio, (iv) preparar os animais para a entrega de partículas, (v) a entrega de partículas revestidas no tecido alvo (parede do corpo ou gânglios), e (vi) o tratamento dos embriões (imunohistoquímica de positividade, e neuronal rotulagem) para visualizar os resultados, geralmente 2 a 3 dias após o parto. Quando as partículas foram revestidas com netrin dsRNA, que causaram claramente visível knock-down de netrin expressão que só ocorreu em células contendo partículas (geralmente, 1-2 partículas por célula). Partículas revestidas com uma codificação de fluorescência EGFP plasmídeo induzida em células neuronais quando pararam em seus núcleos.

Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

Neste vídeo, mostramos um procedimento para uma entrega precisa biobalística de reagentes em tecido vivo com uma arma gene romance em miniatura. Estamos derrubando a expressão da molécula de orientação netrin axônio em embriões de sanguessuga, fornecendo moléculas de dsRNA na parede ventral do corpo e gânglios dos segmentos individuais.

Localizada RNAi e Expressão Gênica ectópica na sanguessuga medicinal

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Elaboração de culturas de células primárias hematopoéticas de medula óssea de camundongos para Eletroporação

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Biologia

Spinal Cord Electrophysiology

Spinal Cord Eletrofisiologia

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Usando o Sistema de Eletroporação Gene Pulser MXcell para transfectar pilhas com Alta Eficiência

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robótica e Análise de Imagem Dinâmica de Estudos de Expressão Gênica em Tecidos Vegetais

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Usando um contador de células automatizadas para simplificar Estudos da Expressão Gênica: Knockdown siRNA de Expressão IL-4 Gene Dependente em células NAMALWA

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Seções incluído em parafina e congelados de Drosophila Músculos Adulto

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Na reconstituição in vitro da atividade T. Telomerase castaneum

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown e Transgénese por microinjeção no Nematóides Necromenic Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Análise da Global RNA Síntese no nível da célula única seguinte hipóxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

A medição da taxa metabólica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Usando respirometria

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...