Name: localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

Vi vill tacka Dr Michael Baker för hans hjälp i att skapa konstruktioner för gen knock-in och för att tillhandahålla tidsförlopp filmer av växande sensoriska prognoser. Vi vill också tacka Virginia Vandelinder för tekniskt bistånd med experimenten tryckluftspistol.

Partiklar kan vara belagd med olika reagens, såsom dsRNA molekyler, plasmider DNA eller färgämnen. Den typ och diameter av partiklar väljs beroende på reagens och djupet av målet celler i vävnad: större partiklar tränger vidare, men kan orsaka skador på vävnaden. 1. Beredning av dsRNA belagda partiklar <ol><li> Häll 100% isopropanol på is. </li><li> Resuspendera 5 mg guldpartiklar (S1600ri, Seashell Technology, LLC, medeldiameter 1,6 mikrometer) i 100 ml bindande buffert. När ...

<ol>
	<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse.">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression.">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li><li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets.">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li><li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression.">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li><li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles.">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103 (2005).</li><li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun.">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li></ol>

I denna demonstration använde vi den pneumatiska kapillär pistolen för att leverera guldpartiklar till celler i små lokaliserade volymen av en levande blodigel embryo till knock-in och knock-down gener. Målet regionen hade generellt en diameter på ~ 150 ìm och partiklar hittades ~ 15 ìm kring medelvärdet inträngningsdjup, som var inställbart mellan 0 och 50 ìm. När partiklarna var belagda med dsRNA molekyler av axonet vägledning faktorn netrin, orsakade de tydligt synliga knock-down av netrin uttryck som bara förekommit i cel...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>gold particles</td>
<td>Other</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>S1600ri</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>binding buffer</td>
<td>Reagent</td>
<td>Seashell Technology, LLC</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>silicone rubber </td>
<td>Reagent</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>Sylgard 184</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

localized rnai and ectopic gene expression in the medicinal leech

I denna video visar vi användning av en pneumatisk kapillär pistol för korrekt biolistic leverans av reagens till levande vävnad. Vi använder förfarandet för att störa mönster genuttryck i utvalda segment av blodigel embryon, lämnar obehandlade segment som intern kontroll. Den pneumatiska kapillära pistolen kan användas för att nå interna lager av celler i tidiga stadier av utveckling utan att öppna provet. Som en metod för lokal införande av ämnen i levande vävnader, har biolistic leverans med pistolen flera fördelar: den är snabb, beröringsfri och oförstörande. Dessutom kan en enskild kapillär pistol användas för oberoende leverans av olika ämnen. Leveransen region kan ha laterala mått ~ 50-150 ìm och sträcker sig över ~ 15 ìm kring medelvärdet penetrationsdjupet, som är inställbart mellan 0 och 50 ìm. Denna leverans har fördelen av att kunna rikta ett begränsat antal celler i en vald plats mellanting mellan enskild cell slå ner genom mikroinjektion och systemiska knockdown genom extracellulära injektioner eller med hjälp av genetiska metoder. För knackar ner eller knackar i uttryck av axonet vägledning molekylen Netrin, vilket naturligtvis uttrycks av några centrala neuron och i den ventrala kroppen väggen, men inte rygg-domänen, vi levererar molekyler av dsRNA eller plasmid-DNA i kroppen väggen och centrala ganglierna. Detta förfarande omfattar följande steg: (i) utarbetande av experimentuppställning för en specifik analys (justering av den accelererande trycket), (ii) beläggning partiklarna med molekyler av dsRNA eller DNA, (iii) Laddar den belagda partiklar i pistolen, upp till två reagenser i en analys, (iv) förbereda djur för partikeln leverans, (v) leverans av belagda partiklar i målvävnad (body vägg eller ganglier), och (vi) behandla embryon (immunfärgning, immunohistokemi och neuronala märkning) för att visualisera resultaten, vanligtvis 2 till 3 dagar efter leverans. När partiklarna var belagd med netrin dsRNA orsakade de tydligt synliga knock-down av netrin uttryck som bara skett i celler som innehåller partiklar (vanligtvis 1-2 partiklar per cell). Partiklar belagd med en plasmid kodning EGFP inducerad fluorescens i neuronala celler när de stannade i sina kärnor.

Watch this Scientific Journal Video about Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech at JoVE.com

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

I denna video visar vi ett förfarande för en korrekt biolistic leverans av reagens till levande vävnad med en ny miniatyr gen pistol. Vi knackar ner ett uttryck för axonet vägledning molekylen Netrin i akterliket embryon genom att leverera molekyler av dsRNA i ventrala kroppen väggen och ganglier av enstaka segment.

Lokaliserad RNAi och ektopisk Gene Expression i läkemedlet Leech

In this video, we show the use of a pneumatic capillary gun for the accurate biolistic delivery of reagents into live tissue. We use the procedure to ...

Research

JoVE Journal

Biology

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Spinal Cord Electrophysiology

Ryggmärg Elektrofysiologi

The neonatal mouse spinal cord is a model for studying the development of neural circuitries and locomotor movement. We demonstrate the spinal cord ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

Använda Gene Pulser MXcell elektroporation System till transfektera primärceller med hög verkningsgrad

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Robotics och Dynamic bildanalys för studier av genuttryck i plantvävnader

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

Hjälp av ett automatiserat celltalsräknare att förenkla Studier Gene Expression: siRNA Knockdown av IL-4 beroende genuttryck i Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Paraffininbäddade och frysta snitt av Drosophila Vuxen Muskler

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

In vitro Beredning av Active T. castaneum Telomeras

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Mediated Gene Knockdown and Transgenesis by Microinjection in the Necromenic Nematode Pristionchus pacificus

RNAi Medierad Gene Knockdown och genmodifiering genom mikroinjektion i Necromenic Nematode Pristionchus pacificus</em

Although it is increasingly affordable for emerging model organisms to obtain completely sequenced genomes, further in-depth gene function and expression ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analys av global RNA syntes vid den inre cellnivå efter Hypoxi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Mätning av ämnesomsättning i<em&gt; Drosophila</em&gt; Med respiration

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial ...