Name: generating ips cells from mefs through forced expression of sox-2, oct-4, c-myc, and klf4
Uploaded: 2008-04-07T10:00:00
Duration: 13 min 2 s
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1 단계 : lentivirus 생산을위한 293 세포와 플레이트를 녹여. <ol><li> 15 - ML 튜브 DMEM + 중간 9 ML을 준비합니다. </li><li> 액체 질소 탱크에서 냉동 293 주식의 병을 제거하고 (전부는 아니지만) 대부분의 세포가 해동 때까지 37 ° C의 물을 욕조에 병을 넣어. </li><li> 1 단계에서 15ml 튜브에 동결 유리병과 장소에서 세포를 제거합니다. </li><li> 5 분 180g에 원심 분리기 다음 뜨는 폐기하십시오. </li><li> DMEM + 중간의 10 ML있는 세포를 Resuspend 및 젤라틴 코팅 100 - mm 요리로 전송할 수 있습니다. 그들이 80~90%의 합류하기 전까지 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 세포를 품어. </li><li> 293 세포의 통과 : PBS로 세척 세포는 PBS를 대기음, 그리고 0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 cm 요리마다 4 ML을 추가, 37 1 분 품어 ° C.를 </li><li> 10 ML DMEM + 매체 resuspend 감청하여 요리의 세포, 그리고 15 - ML 튜브로 전송을 분리합니다. 5 분 180g에 원심 분리기 및 뜨는을 대기음. </li><li> DMEM + 매체의 적절한 볼륨을 추가하고 몇 시간을 아래와 pipetting하여 단일 세포 현탁액으로 세포를 헤어지게. </li><li> 세포의 개수를 카운트 및 FP 매체와 ML 당 8x10 5 세포에 농도를 조정합니다. </li><li> 종자 100 - mm 배양 접시 당 8x10 6 셀 (10 ML)에서 세포를, 그리고 37 밤새 품어 ° C, 5 % CO 2. </li></ol> 2 단계 : lentivirus의 plasmids과 수확 바이러스 Transfect 293 세포 <ol><li> 각 10 cm 접시, FUW - 테토 - cDNA 10 μg (Oct4, Sox2, Klf4 또는 C - Myc) pMD - G의 2.5ug와 lentivirus 백본 및 pPax2의 7.5 μg을 사용합니다. </li><li> 튜브로 세 plasmids를 aliquoting 동안 혈청없이 DMEM의 500μl를 포함하는 두 번째 튜브로 Fugene 6 transfection 시약의 30μl를 제공하고 실온에서 5 분 도청 손가락과 부화에 의해 부드럽게 섞는다. </li><li> DNA 믹스 Fugene 6/DMEM-containing 튜브에 드롭하여 놓기를 추가, 20 분 손가락 도청 및 부화하여 부드럽게 섞는다. </li><li> 293의 그릇에 DNA / Fugene 6 복잡한 dropwise을 추가하고 37 밤새 품어 ° C 5 % CO 2. </li><li> 다음날 아침 : transfection을 대기음 시약 함유 매체를 신선한 ES 세포 매체의 5 ML을 추가하고, 배양기에 세포를 반환합니다. </li><li> 48 시간 transfection 후 72시간에서 0.45 - μm의 기공 크기 셀룰로스 아세테이트 필터를 통해 필터링, 15 ML 튜브로 전송할 수, 10 ML 멸균 일회용 주사기를 사용하여 293의에서 매체를 수집합니다. </li><li> ultracentrifugation하여 바이러스 뜨는을 집중. 원하는 볼륨의 바이러스 펠렛을 Resuspend하고 Oct-3/4-, Sox2 -, Klf4 및 C - Myc - lentiviruses을 포함하고있는 매체의 동등한 부분 amixture합니다. </li><li> 바이러스를 만드는 동안, (접시 당 2x10 6 셀) 10 - cm 요리 confluency 90 % Oct4-neo/rtTA 또는 Oct4-GFP/rtTA MEFs을 (통과 &lt;3) 준비 </li><li> PBS 10 ML과 문화 미디어와 세척을 대기음. </li><li> 0.05 % trypsin/0.53 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 접시 당 1 ML을 추가하고, 37 품어 ° C, 10 분, PBS 폐기하십시오. </li><li> 문화 매체 9 ML 추가, 단일 세포로 세포를 중단하고, 15 ML 튜브로 전송할 수 있습니다. </li><li> 세포의 수를 계산하고, ML 당 8x10 4 세포에 농도를 조정합니다. 젤라틴 코팅 10 cm 요리에 세포 현탁액 10 ML (8x10 5 셀)을 전송합니다. 37 밤새 접시를 품어 ° C, 5 % CO 2. </li><li> fibroblast 요리에서 매체를 대기음, 그리고 바이러스가 포함된 매체 10 ML를 추가합니다. 37 4 H에서 하룻밤에 세포 ° C 5 % CO 2 알을 품다. </li><li> 24 후 fibroblast 요리에서 매체를 대기음, 신선한 ES 세포 매체 10 ML를 추가합니다. </li><li> 네 가지 유전자의 표현을 시작하는 매체를 포함하는 Doxycycline와 함께 정기적으로 ES 세포 매체를 교체, 즉, 프로그래밍을 시작합니다. </li><li> Oct4 - 네오 기자를 사용한다면, 6 구일 사이에 언제든지 약물 섹션을 시작합니다. </li><li> 식민지가 뽑힐 정도로 큰이 될 때까지 매일 매체를 변경합니다. 식민지 먼저 프로그래밍의 개시 후 약 일주일 표시가 될 것입니다. 그들은 일 약 20 뽑힐 정도로 커질 것입니다. </li></ol> 3 단계 : IPS 식민지를 따기 따기 전에 일 : <ol><li> γ - DR4 조사 MEFs과 젤라틴 - 코팅 24 - 잘 접시의 필요한 번호 씨앗 </li></ol> 1 일에 클론을 따기 : <ol><li> 1-2시간 따기 전에 접시에 식민지를 공급. </li><li> V - 바닥 96 잘 요리의 우물에 PBS 15 μl를 추가합니다. </li><li> 식민지는 PBS로 한번 잡았 수가 들어있는 접시를 씻고 요리에 PBS의 10ml를 추가합니다. </li><li> 작은 5μl pipet 팁 (4 μl에 P20 pipetman 설정)와 식민지를 선택합니다. 전송 공동96 - 잘 접시에 잘하는 로니스. </li><li> 잘 멀티 채널 (12) pipetor를 사용하여 각 트립신 20 μl를 추가합니다. Pipet 위아래로 3 회. 37 품어 ° C를 4 분간. </li><li> trypsinized 식민지로 ES 매체 100 μl를 추가합니다. Pipet 위, 아래로 10 회. 12 장소 pipetor의 모든 다른 위치에 팁을 사용하여 24 잘 요리에 96 잘 요리에서 한 번에 6 클론을 전송합니다. </li><li> 세포가 ES 세포 매체와 함께 매일 먹이 confluency 80-90%에 도달할 때까지 37 ° C 5 % CO 2 배양기에서 24 잘 접시에 세포를 성장. 세포는 아마 3-7일의 확장 준비됩니다. </li></ol> 4 단계 <ol><li> IPS 세포의 확장 <ol><li> 매체 기음, 그리고 PBS 1 ML로 세포를 씻어. </li><li> 완전히 PBS를 제거, 0.25 % 트립신 / 37 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 부화 ° 10 분 C의 0.1 ML를 추가합니다. </li><li> ES 매체의 0.4 ML를 추가하고 단일 세포 현탁액과 위아래로 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 6 - 잘 접시의 잘하는 세포 현탁액을 전송, 1.5 ML의 ES 세포 매체를 추가하고, 37 품어 ° C 5 % CO 2 배양기 세포는 6 - 잘 접시에 confluency 80-90%에 도달할 때까지. 이 시점에서 다음과 같이, 세포의 냉동 재고를 준비합니다. </li></ol></li><li> 프리즈 주식의 준비 <ol><li> 매체 기음, 그리고 PBS 2 ML으로 세포를 씻으십시오. </li><li> 완전히 PBS를 제거, 0.25 % 트립신 / 37 1 밀리미터 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 부화 ° 10 분 C 0.5 ML를 추가합니다. </li><li> ES 매체 2 ML 추가 및 단일 세포 현탁액과 위아래로 pipetting하여 세포를 일시 중지합니다. </li><li> 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송, 세포의 수를 계산하고 세포를 스핀 다운. </li><li> , 뜨는을 삭제 ML 당 2x10 6 세포에서 농도 ES 매체와 세포 resuspend. </li><li> 이 ES 세포 냉동 매체 (ES 매체 20 % DMSO)와 유리병 당 0.5 ML로 나누어지는를 준비합니다. </li><li> 튜브를 고정하고 부드럽게 혼합하는 세포 현탁액의 0.5 ML을 전송합니다. </li><li> 세포 동결 용기에 튜브를 넣고 ° C 야간은 -80에서 보관, 장기 보관을 위해 다음날 액체 질소로 전송할 수 있습니다. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Takahashi, K., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+mouse+embryonic+and+adult+fibroblast+cultures+by+defined+factors.">Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors.</a> Cell. 126, 663-676 (2006).</li><li>Wernig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=et+al+.+In+vitro+reprogramming+of+fibroblasts+into+a+pluripotent+ES-cell-like+state.">et al . In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state.</a> Nature. 448, 318-324 (2007).</li><li>Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+germline-competent+induced+pluripotent+stem+cells.">Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells.</a> Nature. 448, 313-317 (2007).</li><li>Maherali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+epigenetic+remodeling+in+directly+reprogrammed+fibroblasts.">Global epigenetic remodeling in directly reprogrammed fibroblasts.</a> Cell Stem Cell. 1, 55-70 (2007).</li><li>Brambrink, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequential+expression+of+pluripotency+markers+during+direct+reprogramming+of+somatic+cells.">Sequential expression of pluripotency markers during direct reprogramming of somatic cells.</a> Cell Stem Cell. 2, 151-159 (2008).</li></ol>

이 비디오에서는, 우리는 Oct4-GFP/R26-M2rtTA과 Nanog-GFP/R26-M2rtTA 생쥐에서 추출한 MEFs에서 GFP 양성, pluripotent IPS 세포를 생성하는 inducible, lentiviral 시스템을 사용하는 방법을 보여줍니다. 그것은 프로그래밍 과정 transgene 표현의 제어를위한 수 있기 때문에이 절차는 IPS 세포를 생성하는 유용한 방법입니다. IPS 세포의 생성에 바이러스의 사용은 임상 환경에서 이러한 세포의 사용을 막는 있지만,이 절차는 우리가 아직 정의 프로그래밍 작업을 밑줄 주요 생물 학적 질문 중 일부에 대답 수 없습니다.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Doxycycline hyclate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>D9891-100G</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

generating ips cells from mefs through forced expression of sox-2, oct-4, c-myc, and klf4

Pluripotency는 Oct4의 바이러스 도입하여 차별 murine에서 유도된 수 있습니다 Sox2, Klf4, 그리고 C - Myc (타카하시와 야마 나카, 2006; Wernig, 외, 2007;. 오키타, 외, 2007;.. Maherali, 외, 2007). 우리는이 네 전사 요소 doxycycline에서 표현되는 프로그래밍 전략을 고안해야 (독스) lentiviral 벡터 (Brambrink 외., 2008) - inducible. 이러한 inducible 구조를 사용하여, 우리는 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs)에서 유도된 pluripotent 줄기 (IPS) 세포를 유도하실 수 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 네 개의 전사 요소를 표현하고 IPS 세포를 생산하기 위해이 바이러스를 감염 MEFs하는 방법을 보여줍니다 inducible의 lentiviruses의 생성에 대한 절차를 설명합니다. inducible의 lentiviruses를 사용하여, 문화 매체 doxycyline의 추가에 의해 제어의 4 가지 요소의 표현. 전통 retroviral 감염을 통해이 시스템의 장점은 프로그래밍과 유전자 발현 요구 사항의 반응 속도론은 세부 분석 수 있도록 해제에 대한 유전자를 켜고있는 능력입니다.

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Generating iPS Cells from MEFS through Forced Expression of Sox-2, Oct-4, c-Myc, and Klf4

이 동영상은 inducible의 lentivirus를 사용하여 유도된 pluripotent 줄기 세포를 생성하는 절차를 보여줍니다 표현 Oct4, Sox2, C - Myc와 Klf4.

삭스 - 2의 강제 표현을 통해 MEFS에서 IPS 세포를 생성, 10 - 4, C - Myc, 그리고 Klf4

Pluripotency can be induced in differentiated murine by viral transduction of Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc (Takahashi and Yamanaka, 2006;  Wernig, et al., ...

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