Name: isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta at JoVE.com

1. Embryo verwijdering en placenta dissectie <ol><li> Om te beginnen, moeten embryo&#39;s eerst worden geïsoleerd van zwangere dammen. </li><li> Dieren worden gedood volgens goedgekeurde procedures - in ons geval gaan we een dodelijke dosis van het verdovingsmiddel isofluraan gebruiken </li><li> De eerste, spray de buik met ethanol en een kleine incisie met een schaar. </li><li> Afscheuren van de huid met beide handen op de buik bloot te leggen en open snijden het buikvlies. </li><li> Met een pincet, pak de baarmoeder...

<ol>
	<li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells.">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li><li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation.">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li></ol>

De experimentele procedures beschreven in dit protocol zal zorgen voor isolatie en visualisatie van placenta weefsel en hematopoietische stamcellen en progenitorcellen. Voor een uitgebreide samenvatting over de verwachte opbrengst en het aantal cellen van HSC in de placenta en andere foetale hematopoietische organen gedurende de foetale ontwikkeling verwijzen we naar Gekas, et al.. 2005. Voor het lokaliseren van het ontwikkelen van HSC en andere hematopoietische cellen in de placenta verwijzen we naar Rhodos, et al.. 2008.

Materialen Lijst: 100mm Glucose 10 mM NaN3 15-ml conische buizen (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-G en de 25-G naalden (BD) 30% Sucrose Solution 35mm Petri Schotels (BD) 4% Paraformaldehyde 50 - m cel filters (Celltrics) 5-ml spuiten (BD) Alkalische fosfatase Ondergrond Kit I (Vector Red, Vector) Alkalische fosfatase Ondergrond Kit III (Vector Blue, Vector) Antibioticum (penicilline / streptomycine, P / S)-oplossing Collagenase type I (Sigma) Cryomold Wegwerp Vinyl Specimen Molds (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Cytokeratine primaire antilichaam (DakoCytomation) Dissection tang, roestvrij staal of titanium, nummer 5 of 55 Drierite Foetaal runderserum (FBS) Fisherbrand Plastic microscoopglaasje Mailer (Fisher) Glucose-oxidase 1000u/ml Levamisol (Vector) Montage media, Waterige basis van Mounting Medium (VectamountTM AQ) Normaal Horse Serum (Vector) Optimale Cutting Temperatuur (OCT, Tissue-Tek) Peroxidasesubstraat Kit DAB (Vector) Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) met Calcium / Magnesium (w Ca2 + / Mg2 +) Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) zonder Calcium / Magnesium (w / o Ca2 + / Mg2 +) Kunststof glijbaan Box (bevat 100 dia&#39;s) Plastic slang (Nalgene 180 PVC Niet-giftig Autoclaveerbaar) Polypropyleen ronde bodem Test Tube, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinase K 20mg/ml Solution (Amresco) Research Products International Corp Super Pap Pen HT * Schuif Markers (2,5 mm, Fisher) Tissue-cultuur behandeld U-vormige (ronde bodem) 96-well of 24-well platen (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Tyramide Amplification Kit (Invitrogen) Vectastain ABC Alkalische fosfatase Standard Kit (Vector) Vectastain ABC Standaard Elite Kit (Vector)

isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta

Hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) hebben de mogelijkheid om zichzelf te vernieuwen en het genereren van alle celtypen van het bloed lijnen gedurende het hele leven van een individu. Alle HSCs ontstaan ​​tijdens de embryonale ontwikkeling, waarna de pool grootte wordt onderhouden door zelf-vernieuwing celdelingen. Het identificeren van de anatomische oorsprong van HSC en de kritische ontwikkeling gebeurtenissen reguleren van het proces van HSC ontwikkeling is ingewikkeld als veel lokalisaties deel te nemen tijdens de foetale hematopoiesis. Recent identificeerden we de placenta als een belangrijk orgaan waar hematopoietische HSC&#39;s worden gegenereerd en uitgebreid in een unieke microenvironmental niches (Gekas, et al. 2005, Rhodos, et al. 2008). Bijgevolg is de placenta is een belangrijke bron van HSC tijdens hun opkomst en de eerste uitbreiding. In dit artikel tonen we dissectie technieken voor de isolatie van murine placenta van E10.5 en E12.5 embryo&#39;s, die overeenkomen met de ontwikkelingsstadia van de inleiding van HSC en de piek in de grootte van de HSC zwembad in de placenta, respectievelijk. Daarnaast presenteren we een geoptimaliseerd protocol voor enzymatische en mechanische dissociatie van placenta weefsel in de single-cell suspensie voor gebruik in de flowcytometrie of functionele assays. We hebben gevonden dat het gebruik van collagenase voor single-celsuspensie van placenta voldoende opbrengsten van HSC geeft. Een belangrijke factor die van invloed HSC opbrengst van de placenta is de mate van mechanische dissociatie voorafgaand aan, en de duur van, enzymatische behandeling. We bieden ook een protocol voor de bereiding van vaste-ingevroren placenta weefsel secties voor de visualisatie van de ontwikkeling van HSC door middel van immunohistochemie in hun precieze cellulaire niches. Als hematopoietische specifieke antigenen zijn niet bewaard gebleven tijdens de bereiding van paraffine ingebedde coupes, we routinematig gebruik van vaste vriescoupes voor het lokaliseren van de placenta HSCs en voorouders.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta at JoVE.com

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

We hebben de placenta als een belangrijk hematopoietische organen tijdens de ontwikkeling. Wij vonden dat hematopoietische stamcellen (HSC&#39;s) zijn beide gegenereerd en uitgebreid in de placenta in unieke microenvironmental niches. We beschrijven hier experimentele technieken die nodig zijn voor isolatie en visualisatie van HSC in de muis placenta.

Isolatie en analyse van hematopoietische stamcellen uit de placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

Unit 1

A Hierarchical Stem-Cell System: Blood Cell Formation

SCIENTISTS IN ACTION

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolatie en transplantatie van hematopoietische stamcellen (HSC)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Afleiding van hematopoietische stamcellen van muriene embryonale stamcellen

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolatie van Vroege hematopoietische stamcellen van muizen dooierzak en AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolatie van het netvlies stamcellen van de muis Eye

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirale-gemedieerde Knockdown Tijdens het Ex Vivo Erytropoëse van humane hematopoietische stamcellen

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Fenotypische analyse en isolatie van Murine hematopoëtische stamcellen en Lineage-geëngageerde voorouders

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Inductie en analyse van epitheliale naar mesenchymale transitie

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolatie en Cultuur van Dental epitheliale stamcellen van de volwassen muis Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

Retroviral Infection of Murine Embryonic Stem Cell Derived Embryoid Body Cells for Analysis of Hematopoietic Differentiation

Retrovirale infectie van muizen embryonale stamcellijnen Afgeleid embryoiden lichaamscellen voor Analyse van hematopoietische differentiatie

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identificatie van Key factoren die de Self-vernieuwing en differentiatie in EML Hematopoietic voorloper cellen door RNA-sequencing Analyse

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...