Name: isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00
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1. Retrait de l&#39;embryon et du placenta de dissection <ol><li> Pour commencer, les embryons doivent d&#39;abord être isolés à partir des barrages enceinte. </li><li> Les animaux sont euthanasiés selon les procédures approuvées - dans notre cas nous allons utiliser une dose létale de l&#39;isoflurane anesthésie </li><li> Tout d&#39;abord, le ventre de pulvérisation avec de l&#39;éthanol et de faire une petite incision avec une paire de ciseaux. </li><li> Arrachez la peau avec les deux mains pour découvrir ...

<ol>
	<li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells.">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li><li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation.">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li></ol>

Les procédures expérimentales décrites dans ce protocole permettra à l&#39;isolement et la visualisation des tissus placentaires et souches hématopoïétiques et les cellules progénitrices. Pour un résumé complet sur le rendement attendu et cellulaires nombre de CSH dans le placenta et les autres organes hématopoïétiques fœtales à travers le développement du fœtus nous nous référons à Gekas, et al. 2005. Pour la localisation des CSH en développement et d&#39;autres cellules hématopoïétiques dans le placenta nous nous r...

Liste de Matériaux: Le glucose 100 mM 10 mM NaN3 15 ml conique tubes (BD) 16-G, 18 G, 20 G, 22-G et 25 G-aiguilles (BD) 30% Solution Sucrée 35mm boîtes de Pétri (BD) Paraformaldéhyde à 4% 50 - Filtres de cellules m (Celltrics) Seringues de 5 ml (BD) Phosphatase alcaline Substrat Kit I (Vector Rouge, Vector) Phosphatase alcaline Substrat Kit III (Blue Vector, Vector) Antibiotiques (pénicilline / streptomycine, P / S) solution de Collagénase de type I (Sigma) Cryomold moules jetables Spécimen de vinyle (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Cytokératine anticorps primaire (DakoCytomation) Pinces à dissection, acier inoxydable ou en titane, numéro 5 ou 55 Drierite Sérum fœtal bovin (FBS) Fisherbrand plastique Microscope Glissez Mailer (Fisher) 1000u/ml glucose oxydase Lévamisole (Vector) Montage des médias, à base aqueuse milieu de montage (VectamountTM AQ) Sérum de cheval normal (Vector) Température de coupe optimale (PTOM, Tissue-Tek) Substrat Peroxydase DAB Kit (Vector) Tampon phosphate salin (PBS) avec du calcium / magnésium (Ca 2 + w / Mg 2 +) Tampon phosphate salin (PBS) sans calcium / magnésium (w / o Ca2 + / Mg2 +) Slide Box plastique (détient 100 diapositives) Tubes en plastique (PVC Nalgene 180 autoclavable non toxique) Tube en polypropylène de test à fond rond, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Protéinase K 20mg/ml Solution (Amresco) Produits de recherche International Corp super Pap Pen HT marqueurs * Slide (2,5 mm, Fisher) Culture tissulaire traitée en U (à fond rond) des plaques de 96 puits ou 24 puits (Falcon BD) Tween 20, SigmaUltra (Sigma) Kit d&#39;amplification tyramide (Invitrogen) Vectastain ABC phosphatase alcaline standard Kit (Vector) Vectastain ABC Standard Elite Kit (Vector)

isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) ont la capacité de s&#39;auto-renouveler et de générer tous les types de cellules des lignées de sang à travers la vie d&#39;un individu. Tous les CSH apparaissent pendant le développement embryonnaire, après quoi leurs dimensions de la piscine est maintenue par l&#39;auto-renouvellement des divisions cellulaires. Identifier l&#39;origine anatomique des CSH et les événements critiques de développement régulation du processus de développement HSC a été compliqué car beaucoup de sites anatomiques participer durant l&#39;hématopoïèse fœtale. Récemment, nous avons identifié le placenta comme un organe majeur où les CSH hématopoïétiques sont générées et élargi dans des niches uniques microenvironnementales (Gekas, et al 2005, à Rhodes, et al 2008). En conséquence, le placenta est une source importante de CSH au cours de leur émergence et l&#39;expansion initiale. Dans cet article, nous montrons les techniques de dissection pour l&#39;isolement du placenta de souris E10.5 E12.5 et embryons, ce qui correspond aux étapes de développement de l&#39;initiation des CSH et le pic de la taille de la piscine HSC dans le placenta, respectivement. En outre, nous présentons un protocole optimisé pour la dissociation enzymatique et mécanique du tissu placentaire dans une seule cellule de suspension pour une utilisation en cytométrie en flux ou des tests fonctionnels. Nous avons constaté que l&#39;utilisation de la collagénase pour une seule cellule de suspension du placenta donne des rendements suffisants de CSH. Un facteur important affectant le rendement HSC du placenta est le degré de dissociation mécanique avant, et la durée de traitement enzymatique. Nous fournissons également un protocole pour la préparation de surgelés fixe des coupes de tissus placentaires pour la visualisation de développer CSH par immunohistochimie dans leurs niches précises cellulaire. Comme hématopoïétiques antigènes spécifiques ne sont pas conservés lors de la préparation des sections paraffine, nous utilisent couramment fixes coupes congelées pour localiser les CSH et les progéniteurs placentaire.

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Nous avons identifié le placenta comme un organe majeur lors du développement hématopoïétique. Nous avons constaté que les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont à la fois générées et développées dans le placenta dans des niches uniques microenvironnementales. Ici, nous décrivons des techniques expérimentales nécessaires à l&#39;isolement et la visualisation des CSH dans le placenta de souris.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

L&#39;isolement et la transplantation de cellules souches hématopoïétiques (CSH)

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Analyse phénotypique et isolement de cellules souches hématopoïétiques murines et Lineage-engagés progéniteurs

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Rétroviral infection de cellules souches embryonnaires murines dérivées de cellules du corps embryoïdes pour l&#39;analyse de la différenciation hématopoïétique

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Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identification des facteurs clés de régulation auto-renouvellement et de différenciation dans les cellules hématopoïétiques précurseurs EML par l&#39;analyse de l&#39;ARN-séquençage

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...