Name: isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00
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1. Embrione rimozione e dissezione placentare <ol><li> Per cominciare, gli embrioni devono essere prima isolati da dighe incinta. </li><li> Gli animali sono l&#39;eutanasia secondo procedure approvate - nel nostro caso abbiamo intenzione di utilizzare una dose letale di anestetico isoflurano </li><li> In primo luogo, spruzzare il ventre con etanolo e fare una piccola incisione con un paio di forbici. </li><li> Strappare via la pelle con entrambe le mani per scoprire l&#39;addome e tagliare aprire il peritoneo. </li><li...

<ol>
	<li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells.">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li><li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation.">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li></ol>

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo permetterà per l&#39;isolamento e la visualizzazione del tessuto placentare e staminali ematopoietiche e cellule progenitrici. Per un riepilogo completo di rendimento atteso su cellulare e numero di cellule staminali nella placenta fetale e di altri organi ematopoietici durante lo sviluppo fetale si fa riferimento a Gekas, et al. 2005. Per la localizzazione di cellule staminali e lo sviluppo di altre cellule ematopoietiche nella placenta si fa riferimento a Rodi, et al. 2008.

Elencare le materie: Il glucosio 100mM 10mM NaN3 15-ml tubi (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-25-G e G aghi (BD) Soluzione di saccarosio 30% 35 millimetri piastre di Petri (BD) 4% paraformaldeide 50 - I filtri delle cellule m (Celltrics) 5-ml siringhe (BD) Fosfatasi alcalina substrato Kit I (vettore rosso, Vector) Fosfatasi alcalina substrato Kit III (vettore blu, Vector) Antibiotici (penicillina / streptomicina, P / S) soluzione Collagenasi di tipo I (Sigma) Cryomold monouso in vinile Stampi campioni (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Citocheratina Anticorpo primario (DakoCytomation) Dissezione forcipe, acciaio inox o in titanio, numero 5 o 55 Drierite Siero fetale bovino (FBS) Fisherbrand plastica vetrino da microscopio Mailer (Fisher) Glucosio Ossidasi 1000u/ml Levamisolo (Vector) Montaggio di mezzi, a base acquosa Mounting Medium (VectamountTM AQ) Normale siero di cavallo (Vector) Taglio di temperatura ottimale (ottobre, Tissue-Tek) Perossidasi Kit substrato DAB (Vector) Soluzione tampone fosfato (PBS) con calcio / magnesio (Ca2 + w / Mg2 +) Soluzione tampone fosfato (PBS) senza calcio / magnesio (w / o Ca2 + / Mg2 +) Far scorrere scatola di plastica (detiene il 100 diapositive) Tubi di plastica (180 Nalgene PVC atossico autoclavabile) Polipropilene a fondo tondo Provetta, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinasi K 20mg/ml Soluzione (Amresco) Prodotti di ricerca International Corp Super Pap Pen HT * Marcatori scorrere (2,5 mm, Fisher) Tessuto-coltura trattata a forma di U (andata e basso) piastre a 96 pozzetti o 24 pozzetti (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Amplificazione Tyramide Kit (Invitrogen) Vectastain ABC fosfatasi alcalina Standard Kit (Vector) Vectastain ABC standard Elite Kit (Vector)

isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) hanno la capacità di auto-rinnovarsi e di generare tutti i tipi di cellule dei lignaggi di sangue per tutta la durata di un individuo. Tutte le CSE emergono durante lo sviluppo embrionale, dopo di che le loro dimensioni piscina è gestito da auto-rigenerante divisioni cellulari. Identificare l&#39;origine anatomica di cellule staminali e gli eventi critici dello sviluppo che regolano il processo di sviluppo HSC è stato complicato come molti siti anatomici partecipare durante emopoiesi fetale. Recentemente, abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche dove si generano HSCs e ampliato nel unici nicchie microambientali (Gekas, et al 2005, Rodi, et al 2008). Di conseguenza, la placenta è una fonte importante di cellule staminali durante il loro nascita e l&#39;espansione iniziale. In questo articolo, mostriamo le tecniche di dissezione per l&#39;isolamento di murino placenta da 10,5 e E12.5 embrioni, corrispondenti alle fasi di sviluppo di iniziazione di cellule staminali e il picco nella dimensione del pool di HSC nella placenta, rispettivamente. Inoltre, presentiamo un protocollo ottimizzato per dissociazione enzimatica e meccanica del tessuto placentare in cella singola sospensione per l&#39;uso in citometria a flusso o test funzionali. Abbiamo trovato che l&#39;uso di collagenasi per cella singola sospensione della placenta dà rendimenti sufficiente di cellule staminali. Un fattore importante di rendimento HSC dalla placenta è il grado di dissociazione meccanica prima, e la durata di un trattamento enzimatico. Forniamo anche un protocollo per la preparazione di fisso congelati sezioni di tessuto placentare per la visualizzazione di sviluppare HSCs mediante immunoistochimica nelle loro nicchie precise cellulare. Come ematopoietiche antigeni specifici non vengono mantenute durante la preparazione di sezioni in paraffina, si usano abitualmente fisso sezioni congelate per la localizzazione HSCs placentare e progenitori.

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Abbiamo identificato la placenta come organo principale ematopoietiche durante lo sviluppo. Abbiamo trovato che le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono entrambi generati e ampliato nella placenta in unica nicchie microambientali. Qui, descriviamo le tecniche sperimentali necessari per l&#39;isolamento e la visualizzazione di cellule staminali nella placenta del mouse.

Isolamento e analisi delle cellule staminali ematopoietiche dalla placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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