Name: isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00
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1. Remoção do embrião e dissecção da placenta <ol><li> Para começar, os embriões devem primeiro ser isolados de vacas prenhes. </li><li> Os animais são sacrificados de acordo com os procedimentos aprovados - no nosso caso vamos utilizar uma dose letal do anestésico isoflurano </li><li> Primeiro, spray a barriga com etanol e fazer uma pequena incisão com uma tesoura. </li><li> Arrancar a pele com ambas as mãos para descobrir o abdômen e corte aberto o peritônio. </li><li> Com uma pinça, pegue o cornos uter...

<ol>
	<li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells.">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li><li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation.">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li></ol>

Os procedimentos experimentais descritos neste protocolo irá permitir isolamento e visualização do tecido placentário e tronco hematopoiéticas e células progenitoras. Para um resumo abrangente sobre a produção de celulares espera e número de HSCs na placenta e outros órgãos hematopoiéticos fetal durante o desenvolvimento fetal nos referimos a Gekas, et al. 2005. Para localização de HSCs desenvolvimento e outras células hematopoiéticas na placenta nos referimos a Rhodes, et al. 2008.

Lista de materiais: A glicose 100mM 10mM NaN3 15 ml tubos cônicos (BD) 16-G, 18-G, 20-G, 22-G e 25-G agulhas (BD) Solução de sacarose 30% Pratos Petri 35 milímetros (BD) Paraformaldeído 4% 50 - m filtros celular (Celltrics) 5 ml seringas (BD) Fosfatase alcalina Substrato Kit I (Red Vector, Vector) Fosfatase alcalina Substrato Kit III (Vector Azul, Vector) Solução (Penicilina / Estreptomicina, P / S) de antibióticos Colagenase tipo I (Sigma) Moldes Vinyl Cryomold descartáveis ​​amostras (10mm x 10mm x 5 mm, Tissue-Tek) Citoqueratina anticorpo primário (DakoCytomation) Pinça de dissecção, aço inoxidável ou titânio, número 5 ou 55 Drierite De soro fetal bovino (FBS) Plastic Fisherbrand Microscope Slides Mailer (Fisher) 1000u/ml glicose oxidase Levamisole (Vector) Montagem de mídia, meio aquoso baseado em montagem (VectamountTM AQ) Normais soro de cavalo (Vector) Temperatura ideal de corte (OCT, Tissue-Tek) Peroxidase Substrato Kit DAB (Vector) Tampão fosfato salino (PBS) com Cálcio / Magnésio (w Ca2 + / Mg2 +) Tampão fosfato salino (PBS) sem cálcio / magnésio (w / o Ca2 + / Mg2 +) Box Deslize plástico (possui 100 slides) Tubos de plástico (PVC Nalgene 180 Autoclavável não-tóxico) Test Tube polipropileno de fundo redondo, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinase K 20mg/ml Solução (Amresco) Produtos Research International Corp Pap Super Pen HT Markers * Slide (2,5 mm, Fisher) Da cultura de tecidos tratados em forma de U (de fundo redondo) placas de 96 poços ou 24 poços (BD Falcon) Tween20, SigmaUltra (Sigma) Kit Amplification tiramida (Invitrogen) Vectastain ABC Fosfatase Alcalina Standard Kit (Vector) Vectastain ABC Padrão Elite Kit (Vector)

isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta

Células-tronco hematopoéticas (HSCs) têm a capacidade de se auto-renovar e gerar todos os tipos de célula das linhagens de sangue durante toda a vida de um indivíduo. Todos os HSCs surgem durante o desenvolvimento embrionário, após o qual o seu tamanho da piscina é mantido por auto-renovação divisões celulares. Identificar a origem anatômica do HSCs e os eventos críticos de desenvolvimento regular do processo de desenvolvimento HSC tem sido complicada como muitos sítios anatômicos participar durante a hematopoiese fetal. Recentemente, foi identificada a placenta como um órgão hematopoiético, onde grandes HSCs são gerados e ampliado em única nichos microambientais (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequentemente, a placenta é uma importante fonte de HSCs durante o seu surgimento e expansão inicial. Neste artigo, vamos mostrar técnicas de dissecção para o isolamento de placenta murino de E10.5 e E12.5 embriões, o que corresponde aos estágios de desenvolvimento do início do HSCs eo pico do tamanho da piscina HSC na placenta, respectivamente. Além disso, apresentamos um protocolo otimizado para dissociação enzimática e mecânica de tecido placentário em uma única célula de suspensão para uso em citometria de fluxo ou ensaios funcionais. Nós descobrimos que o uso de colagenase por uma única célula suspensão da placenta dá rendimentos suficientes de HSCs. Um fator importante que afeta o rendimento HSC da placenta é o grau de dissociação mecânica antes e duração, o tratamento enzimático. Nós também fornecemos um protocolo para a preparação de fixo congelado secções de tecido placentário para a visualização do desenvolvimento de HSCs por imuno-histoquímica em seus nichos precisa celular. Como hematopoiéticas antígenos específicos não são preservadas durante a preparação das seções incluídos em parafina, que usam rotineiramente fixo cortes congelados para localizar HSCs placentária e progenitores.

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Nós identificamos a placenta como um órgão hematopoiético importante durante o desenvolvimento. Descobrimos que as células-tronco hematopoéticas (HSCs) são gerados e se expandiu na placenta em única nichos microambientais. Aqui, descrevemos as técnicas experimentais necessárias para o isolamento e visualização de HSCs na placenta mouse.

Isolamento e Análise de Células-Tronco Hematopoéticas da Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells (HSCs)

Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Isolamento e Transplante de Células-Tronco Hematopoéticas (HSCs)

Biologia

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Derivação de Células-Tronco Hematopoéticas murino de Células-Tronco Embrionárias

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Isolation of Early Hematopoietic Stem Cells from Murine Yolk Sac and AGM

Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas início de murino saco vitelino e AGM

In the mouse embryo, early hematopoiesis occurs simultaneously in multiple organs, which includes the yolk sac and aorta-gonad-mesonephros region. These ...

Isolation of Retinal Stem Cells from the Mouse Eye

Isolamento de Células-Tronco da retina do olho do rato

The adult mouse retinal stem cell (RSC) is a rare quiescent cell found within the ciliary epithelium (CE) of the mammalian eye1,2,3. The CE is made up of ...

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentiviral-mediated Knockdown During Ex Vivo Erythropoiesis of Human Hematopoietic Stem Cells

Lentivirus mediada Durante Knockdown Ex Vivo Eritropoese de Células-Tronco Hematopoéticas

Erythropoiesis is a commonly used model system to study cell differentiation. During erythropoiesis, pluripotent adult human hematopoietic stem cells ...

Phenotypic Analysis and Isolation of Murine Hematopoietic Stem Cells and Lineage-committed Progenitors

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

The bone marrow is the principal site where HSCs and more mature blood cells lineage progenitors reside and differentiate in an adult organism. HSCs ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Indução e Análise de epitelial para mesenquimal Transição

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Isolamento e Cultura da Dental epiteliais células-tronco do Adulto Rato Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

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Retroviral Infecção murina Embryonic Stem Cell Derived Cells embrioides corpo de Análise da diferenciação hematopoética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Identificação dos fatores chave que regula a auto-renovação e diferenciação em células precursoras hematopoéticas EML por Análise RNA-seqüenciamento

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...