Name: isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta
Uploaded: 2008-06-24T16:25:00
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1. La eliminación del embrión y la placenta disección <ol><li> Para empezar, los embriones debe ser aislado de las presas embarazadas. </li><li> Los animales son sacrificados de acuerdo con los procedimientos aprobados - en nuestro caso vamos a usar una dosis letal del anestésico isoflurano </li><li> En primer lugar, rocíe el vientre con etanol y hacer una pequeña incisión con un par de tijeras. </li><li> Arranca la piel con las dos manos para descubrir el abdomen y se abre el peritoneo. </li><li> Con unas pinza...

<ol>
	<li>Gekas, C., Dieterlen-Lievre, F., Orkin, S. H., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+placenta+is+a+niche+for+hematopoietic+stem+cells.">The placenta is a niche for hematopoietic stem cells.</a> Dev Cell. 8, 365-375 (2005).</li><li>Rhodes, K. E., Gekas, C., Wang, Y., Lux, C. T., Francis, C. S., Chan, D. N., Conway, S., Orkin, S. H., Yoder, M. C., Mikkola, H. K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Emergence+of+Hematopoietic+Stem+Cells+Is+Initiated+in+the+Placental+Vasculature+in+the+Absence+of+Circulation.">The Emergence of Hematopoietic Stem Cells Is Initiated in the Placental Vasculature in the Absence of Circulation.</a> Cell Stem Cell. 2, 252-263 (2008).</li></ol>

Los procedimientos experimentales descritos en este protocolo permitirá que para el aislamiento y la visualización de tejido de la placenta y la madre hematopoyéticas y las células progenitoras. Para un resumen completo sobre el rendimiento esperado y el número de celular de las CMH en la placenta y otros órganos hematopoyéticos fetal durante el desarrollo fetal que se refieren a Gekas, et al. 2005. Para la localización de las CMH en desarrollo y otras células hematopoyéticas de la placenta que se refieren a Rodas, et al. 2008.

Lista de Materiales: La glucosa 100 mM 10 mM NaN3 15 ml tubos cónicos (BD) 16-G, 18 G, 20 G, 22 G y 25-G agujas (BD) 30% de sacarosa solución 35 mm placas de Petri (BD) Paraformaldehído al 4% 50 - m filtros celular (Celltrics) Jeringas de 5 ml (BD) Fosfatasa alcalina sustrato Kit I (Vector Rojo, Vector) Fosfatasa alcalina sustrato Kit III (Blue Vector, Vector) Antibióticos (penicilina / estreptomicina, P / S) solución Colagenasa tipo I (Sigma) Cryomold Moldes desechables de vinilo de la muestra (10 mm x 10 mm x 5 mm, Tissue-Tek) Citoqueratina primaria de anticuerpos (DakoCytomation) Pinzas de disección, de acero inoxidable o de titanio, el número 5 o 55 Drierite De suero fetal bovino (FBS) Fisherbrand plástico portaobjetos del microscopio Mailer (Fisher) Glucosa oxidasa 1000u/ml Levamisol (Vector) Montaje de los medios de comunicación, de base acuosa medio de montaje (VectamountTM AQ) Suero normal de caballo (Vector) La temperatura óptima de corte (octubre, Tissue-Tek) Kit de sustrato de peroxidasa DAB (Vector) Tampón fosfato salino (PBS) con calcio / magnesio (w Ca2 + / Mg2 +) Tampón fosfato salino (PBS) sin calcio / magnesio (w / o Ca2 + / Mg2 +) Caja de diapositivas de plástico (capacidad para 100 diapositivas) Tubería de plástico (Nalgene 180 PVC no tóxico autoclave) Polipropileno de fondo redondo de tubo de ensayo, 5 ml (12x75 mm, BD Falcon) Proteinasa K 20mg/ml solución (Amresco) Investigación de Productos International Corp Súper Pluma de Papanicolaou HT * Marcadores de diapositivas (2,5 mm, Fisher) De cultivo de tejidos tratados en forma de U (de fondo redondo) placas de 96 pozos, o bien 24 (BD Falcon) Tween 20, SigmaUltra (Sigma) Kit de amplificación tiramida (Invitrogen) Vectastain ABC de fosfatasa alcalina Standard Kit (Vector) Vectastain ABC Kit estándar Elite (Vector)

isolation and analysis of hematopoietic stem cells from the placenta

Las células madre hematopoyéticas (HSC) tienen la capacidad de auto-renovación y generar todos los tipos celulares de los linajes de sangre durante toda la vida de un individuo. Todos los HSCs surgir durante el desarrollo embrionario, después de que su tamaño de la agrupación se mantiene gracias a la auto-renovación de las divisiones celulares. Identificar el origen anatómico de las CMH y los acontecimientos de desarrollo fundamental que regula el proceso de desarrollo de HSC se ha complicado ya que muchos sitios anatómicos participar durante la hematopoyesis fetal. Recientemente, hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas en HSCs se generan y se amplió en exclusiva nichos microambientales (Gekas, et al 2005, Rodas, et al 2008). En consecuencia, la placenta es una fuente importante de HSC durante su surgimiento y la expansión inicial. En este artículo se muestran las técnicas de disección para el aislamiento de los murinos placenta de E10.5 E12.5 y embriones, correspondientes a las etapas de desarrollo de la iniciación de las CMH y el pico en el tamaño de la piscina HSC en la placenta, respectivamente. Además, presentamos un protocolo optimizado para la disociación enzimática y mecánica de tejido de la placenta en una sola célula de suspensión para su uso en citometría de flujo o ensayos funcionales. Hemos encontrado que el uso de colagenasa por una sola célula de suspensión de la placenta produce rendimientos suficientes de las CMH. Un factor importante que afecta el rendimiento HSC de la placenta es el grado de disociación mecánica antes, y la duración de, tratamiento enzimático. Disponemos también de un protocolo para la preparación de las secciones fijas congeladas de tejido placentario para la visualización del desarrollo de HSC por inmunohistoquímica en sus nichos celulares precisos. Como hematopoyéticas antígenos específicos no se conservan durante la preparación de las secciones incluidas en parafina, que utilizan habitualmente fija las secciones congeladas para la localización de la placenta y HSCs progenitores.

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Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hemos identificado la placenta como un órgano principal hematopoyéticas durante el desarrollo. Encontramos que las células madre hematopoyéticas (HSC), son generados y ampliado en la placenta en el único nichos microambientales. A continuación, describimos las técnicas experimentales necesarias para el aislamiento y la visualización de la CMH en la placenta del ratón.

Aislamiento y análisis de las células madre hematopoyéticas de la placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

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Isolation and Transplantation of Hematopoietic Stem Cells HSCs

Aislamiento y trasplante de células madre hematopoyéticas (HSC)

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El análisis fenotípico y aislamiento de células madre hematopoyéticas murinas y progenitores comprometidos Lineage

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Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

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Aislamiento y cultivo de células madre epiteliales dental del adulto Ratón Incisivo

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

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Infección retroviral murino de células madre embrionarias células derivadas embrioide cuerpo para el Análisis de la diferenciación hematopoyética

Embryonic stem cells (ESCs) are an outstanding model for elucidating the molecular mechanisms of cellular differentiation. They are especially useful for ...

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Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

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