Name: generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging
Uploaded: 2008-07-09T16:32:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging at JoVE.com

National Institutes of Health Kirchstein Fellowship predoctoral gemenskap AI-64.128 (MPM), GM-41.514 (MDC), GM-48.071 (IP)

1) Ta bort båda lårbenet ben från en mus <ol><li> Använd dissekering sax för att klippa bort muskler och exponera lårbenet benet ovanför och nedanför leder (knä och höft). Ta tag i mitten av lårbenet med dissektion pincett och skär över och under lederna för att lämna så mycket av epifysen intakt som möjligt. </li><li> Torka bort så mycket muskler som möjligt med hjälp av små dissektion sax. Överför lårbenet i ett fat RPMI. </li><li> Alla procedurer bör genomföras i luvan från och med nu att ...

<ol>
	<li>Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+the+single+cell+dynamics+of+CD4++T+cell+activation+by+dendritic+cells+in+lymph+nodes.">Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes.</a> J Exp Med. 200, 847-856 (2004).</li><li>Henrickson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+sensing+of+antigen+dose+governs+interactive+behavior+with+dendritic+cells+and+sets+a+threshold+for+T+cell+activation.">T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation.</a> Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).</li><li>Jefford, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+comparison+of+DCs+generated+in+vivo+with+Flt3+ligand+or+in+vitro+from+blood+monocytes:+differential+regulation+of+function+by+specific+classes+of+physiologic+stimuli.">Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli.</a> Blood. 102, 1753-1763 (2003).</li><li>Inaba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+large+numbers+of+dendritic+cells+from+mouse+bone+marrow+cultures+supplemented+with+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor.">Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor.</a> J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).</li><li>Lutz, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+functions+of+IL-4+receptor+types+I+and+II+for+dendritic+cell+maturation+and+IL-12+production+and+their+dependency+on+GM-CSF.">Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF.</a> J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).</li><li>Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+development+of+murine+dendritic+cells+by+GM-CSF+versus+Flt3+ligand+has+implications+for+inflammation+and+trafficking.">Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking.</a> J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).</li><li>Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+dendritic+cells.">Isolation of dendritic cells.</a> Curr Protoc Immunol. 3, (2001).</li><li>Winzler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maturation+stages+of+mouse+dendritic+cells+in+growth+factor-dependent+long-term+cultures.">Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures.</a> J Exp Med. 185, 317-328 (1997).</li><li>Koch, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+necrosis+factor+alpha+maintains+the+viability+of+murine+epidermal+Langerhans+cells+in+culture,+but+in+contrast+to+granulocyte/macrophage+colony-stimulating+factor,+without+inducing+their+functional+maturation.">Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation.</a> J Exp Med. 171, 159-171 (1990).</li><li>Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+repertoire+scanning+is+promoted+by+dynamic+dendritic+cell+behavior+and+random+T+cell+motility+in+the+lymph+node.">T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).</li><li>Wei, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++signals+in+CD4++T+cells+during+early+contacts+with+antigen-bearing+dendritic+cells+in+lymph+node.">Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node.</a> J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).</li><li>Castellino, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+enhance+immunity+by+guiding+naive+CD8++T+cells+to+sites+of+CD4++T+cell-dendritic+cell+interaction.">Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction.</a> Nature. 440, 890-895 (2006).</li></ol>

Dendritiska celler är viktiga förmedlare av det adaptiva immunsvaret och den mest effektiva antigenpresenterande celler kännetecknas hittills. Metoder för människa och mus dendritiska cellodling i litteraturen skiljer sig i den typ av cytokiner som används för att påverka utvecklingen av olika dendritiska celltyper. Anmärkningsvärt är att GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa och IFN-gamma används i olika kombinationer för att producera mogna, omogna, inflammatoriska och steady-state som murin benmärg härrör dendritiska celler ...

generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging

Flera metoder för beredning av murina dendritiska celler kan hittas i litteraturen. Här presenterar vi en metod som ger mer än 85% CD11c stora dendritiska celler i kultur som hem till dränerande lymfkörteln efter subkutan injektion och presentera antigen för att antigen specifika T-celler (se video). Dessutom använder vi Essen Instruments Incucyte att spåra dendritiska celler mognad, där, på dag 10, är ​​morfologi av de odlade cellerna typiska för en mogen dendritiska celler och &lt;85% av celler CD11chigh. Studien av antigen presentation i perifera lymfkörtlar med 2-fotonen imaging visade att det finns tre distinkta faser av dendritiska celler och T-cell interaktion 1, 2. Fas I består av korta seriella kontakter mellan mycket rörliga antigen specifika T-celler och antigen bär dendritiska celler 1, 2. Fas två präglas av långvarig kontakt mellan antigen-specifika T-cell och antigen bärande dendritiska celler 1, 2. Slutligen är fas III kännetecknas av T-celler lossnar från dendritiska celler, återfå rörlighet och börjar dela 1, 2. Detta är ett exempel på den typ av antigen-specifika interaktioner som kan analyseras med två-photon avbildning av antigen-laddad cell tracker dye-märkta dendritiska celler.

Watch this Scientific Journal Video about Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging at JoVE.com

Generation of Bone Marrow Derived Murine Dendritic Cells for Use in 2-photon Imaging

Antigen presentation i sekundära lymfoida organ av dendritiska celler är avgörande för inledandet av T-cells medierade adaptiva immunsvaret. Här kan vi visa på kulturen i benmärgen härrör murina dendritiska celler, aktivering och märkning för 2-photon avbildning.

Generering av benmärg härledda Murine dendritiska celler för användning i 2-fotonen Imaging

Several methods for the preparation of murine dendritic cells can be found in the literature. Here, we present a method that produces greater than 85% ...

Research

JoVE Journal

Biology

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

Dissektion och 2-Photon Imaging för perifera lymfkörtlar på möss

Two-photon imaging has revealed an elegant choreography of motility and cellular interactions within the lymph node under basal conditions and at the ...

In situ Imaging of the Mouse Thymus Using 2-Photon Microscopy

In situ avbildning av Mouse Thymus Använda 2-Photon Mikroskopi

Two-photon Microscopy (TPM) enables us to image deep into the thymus and document the events that are important for thymocyte development.  To follow the ...

A Method for 2-Photon Imaging of Blood Flow in the Neocortex through a Cranial Window

En metod för 2-Photon Imaging av blodflödet i hjärnbarken genom en Kraniell fönster

The ability to image the cerebral vasculature (from large vessels to capillaries) and record blood flow dynamics in the intact brain of living rodents is ...

In Vivo 2-Photon Calcium Imaging in Layer 2/3 of Mice

In Vivo 2-Photon Kalcium Imaging i Layer 2 / 3 av Möss

To understand network dynamics of microcircuits in the neocortex, it is essential to simultaneously record the activity of a large number of neurons .  ...

Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors

Kultur av myeloisk dendritiska celler från benmärg prekursorer

Myeloid dendritic cells (DCs) are frequently used to study the interactions between innate and adaptive immune mechanisms and the early response to ...

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

Beredningen av primära hematopoietisk cell kulturer från Murine Bone Marrow för elektroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

Homing of Hematopoietic Cells to the Bone Marrow

Homing av hematopoetiska celler i benmärgen

Homing is the phenomenon whereby transplanted hematopoietic cells are able to travel to and engraft or establish residence in the bone marrow.  Various ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Osteoclast Derivation from Mouse Bone Marrow

Osteoklast Härledning från benmärg från mus

Osteoclasts are highly specialized cells that are derived from the monocyte/macrophage lineage of the bone marrow. Their unique ability to resorb both the ...

Expression of Fluorescent Fusion Proteins in Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells and Macrophages

Uttryck för fluorescerande fusionsproteinerna i murina benmärg-derived dendritiska celler och makrofager

Dendritic cells and macrophages are crucial cells that form the first line of defense against pathogens. They also play important roles in the initiation ...