Name: chromatin immunoprecipitation from human embryonic stem cells
Uploaded: 2008-07-22T00:31:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Den presenterade arbete stöds av ett bidrag (RS1-00.477-1) från California Institute för regenerativ medicin (CIRM) till FS

Upptining av ES-celler (Ej På video) ES-celler är frysta i medium som innehåller 10% DMSO. Eftersom DMSO kan inducera differentiering av ES-celler, kan det vara möjligt att tina cellerna sent på dagen och så för att ändra på medellång följande morgon för att minimera effekterna av kvarvarande DMSO. <ol><li> Coat en 6-och vävnadsodling tallrik med 0,1% gelatin i minst 15 minuter och aspirera omedelbart innan till tallriken celler. </li><li> Tina ES-celler (ca 5 × 10 6 celler, vilket motsvarar en sammanhängande 6-bra) i en 37 ° C vattenbad och späd till 10 ml uppvärmd ES-celler medium. </li><li> Pellets cellerna genom att snurra i 10 minuter vid 1000 rpm i en bänkbaserade kliniska centrifug. </li><li> Aspirera av medelstora och försiktigt resuspendera cellerna i 10 ml 37 ° C uppvärmd medium. </li><li> Överföring cellsuspension till 6-brunnar och växer vid 37 ° C i en fuktig 5% CO 2 inkubator. </li><li> Ändra medelstora följande dag för att ta bort döda hudceller och rester av DMSO. </li></ol> Passage och utbyggnad av kulturer ES-celler ES-celler rutinmässigt passerats var 2 / 3 dagar, och mediet byts varannan dag. Således, ES-cellerna kräver daglig uppmärksamhet. Enligt vår erfarenhet feeder-oberoende ES-celler växer snabbt och snabbt försura mediet, vrida den gul. Att låta cellerna att försura medium (genom att inte ändra media varje dag eller passaging cellerna på en för låg utspädning) gör att cellerna att genomgå krisen utlöser överskott differentiering och celldöd, varefter deras totipotency inte kan garanteras. Plätering cellerna på en för låg densitet, otillräcklig spridning av celler under passagen, eller ojämna plätering kan orsaka liknande problem, eftersom cellerna bildar stora klumpar innan sammanflödet och cellerna inom dessa klumpar kommer att skilja eller dö. Könsceller överföring är en kraftigt minskad i celler som har blivit illa behandlad, även när de visas frisk vid tiden för injektion. <ol><li> För en sammanhängande 6-brunnar av celler aspirerar medelstora bort och tvätta med 2-3 ml 37 ° C uppvärmd PBS, pipettering bort från cellerna. </li><li> Täck celler med 1 ml 1 × trypsin lösning i 3-4 minuter eller tills cellerna är jämnt spridda i små klumpar. </li><li> Tillsätt 1 ml av medium för att inaktivera trypsin. </li><li> Samla trypsinized celler och platta (vanligen 2 / 5 av väl) till en nyligen gelatiniserad 6-brunnar. </li></ol> Frysning ES-celler <ol><li> Trypsinize ett sammanflytande 6-brunnar (ca 1 × 10 7 celler) som beskrivs ovan. </li><li> Samla trypsinized celler i 9 ml medium och pellets i 5 minuter vid 1000 rpm. </li><li> Aspirera av medelstora och resuspendera cellpelleten i 1 ml nygjord frysning medium. Alikvotera 0,5 ml av celler i två cryotubes. </li><li> Frys rören vid -80 ° C över natten och transfer till flytande kväve för långsiktig lagring. </li></ol> Chip-on-chip FÖRFARANDE Immunoprecipitation <ol><li> Formaldehyd crosslinking celler (för upphängning celler) <ol><li> Använd 5 x 10 7 - 1 x 10 8 celler för varje immunoprecipitation. </li><li> Lägg färska formaldehyd till cellsuspensionen i en koncentration av 1%. </li><li> Ruvar celler med formaldehydlösning i 10 minuter vid rumstemperatur. </li><li> Tillsätt 1 / 10 Volym av 1,25 M glycin att släcka formaldehyd. </li><li> Skölj cellerna två gånger med 10 ml 1X PBS. </li><li> Pool celler i 50 ml koniska rör och snurra på 700g i 5 min vid 4 ° C. Kassera supernatanten och återsuspendera pelleten i 1,5 ml lyseringsbuffert. Överför celler i en 1,5 ml mikrofugrör. </li></ol></li><li> Flash-frysa tre gånger celler i flytande kväve och använda en vävnad vinkelslip för att bryta celler. När cellerna är tvärbunden, kan de förvaras frysta vid -80 ° C på obestämd tid. </li></ol> Förbereda magnetiska kulor (steg är allt utförs vid 4 ° C) <ol><li> Tillsätt 50 ìl Dynal pärlor till 1,5 ml låg retention mikrorör. Ställ in en tub av pärlor per immunoprecipitation. Tillsätt 1 ml Block. </li><li> Samla pärlor med Dynal MPC. Placera rören i magnetiska rack. Låt pärlor att samla på sidan av röret. Detta bör ta ca 15 s. Invertera rack två gånger för att hjälpa till att samla pärlor. Avlägsna supernatanten med pipett. </li><li> Tillsätt 1 ml Block och försiktigt återsuspendera pärlor i att ta bort magnetremsan från ställningen och invertering av rack, med rören fortfarande på plats - antingen 10-20 gånger, eller tills kulorna är jämnt omblandning. Samla pärlor som ovan (steg 2). Avlägsna supernatanten med pipett. </li><li> Tvätta pärlor i 1,5 ml Block lösning, som i steg 3, en gång till. </li><li> Återsuspendera pärlor i 750 l Block lösning och tillsätt 10 mikrogram av antikroppar. Inkubera vid 4 ° C i minst 6h, eller över natten, på en rotator. </li><li> Tvätta pärlor tre tIME i 1 ml Block lösning, som beskrivs i steg 3. </li></ol> Cell sonication <ol><li> Ta frysta celler pellets från -80 ° C och överföra celler till rör för sonication. Vi föredrar idag att använda botten av en standard polupropylene, 15 ml koniska rör för sonication. Vi skär röret i två delar på 5 ml-strecket och kasta den övre halvan. Rören kan täckas med parafilm eller med röret lock medan du ställer upp. </li><li> Använda ett rack mikrofugrör, placera röret så sonicator sonden sitter cirka 0,5-1,0 cm över botten av röret. Var noga med att sonden är centrerad och inte kontaktar sidorna av röret. (Probe placering kan påverka om lösningen skummar eller inte under ultraljudsbehandling. Vanligtvis visar skummande att sonicated DNA dåligt kommer att klippas.) </li><li> Sonikera fjädring 6 gånger under 20 sekunder Proverna ska förvaras i en is-vattenbad under sonication. För att minska skumbildning, ursprungligen uteffekt till 0 och öka manuellt för att slutgiltigt makten under första sprack. (Om det finns betydande skum kan alla bubblor avlägsnas genom centrifugering på 20.000 g följt av mjuk resuspension av allt material och lämnar inga skum bubblor.) </li><li> Snurra på 20.000 g under 10 minuter vid 4 ° C till pellets skräp och skörda supernatanten i ett 1,5 ml rör. </li><li> Spara 50 l av cell lysat från varje prov som indata DNA. Förvara vid -20 ° C. Minst en ingång DNA alikvot bör hållas per parti Sonikera lysat. Observera att effekterna av effekterna av ultraljudsbehandling och den resulterande distributionen av fragment storlek endast kan kontrolleras efter Crosslink återföring och rening av DNA. </li></ol> Kromatin immunoprecipitation <ol><li> Lägg till kromatin-motsvarande mängd 5 x 10 7 - 1 x 10 8 celler från Cell ultraljudsbehandling, steg 4 till 50 l antikropp / magnetiska Pärlmixer från att förbereda magnetiska kulor Steg 6 med en slutlig volym på 1 ml (Det kan vara möjligt att justera med lyseringsbuffert, om någonsin). Inkubera över natten på rotator vid 4 ° C. </li></ol> Tvätta <ol><li> Samla pärlor med Dynal MPC. Placera rören i rack. Låt pärlor att samla på sidan av röret. Detta bör ta cirka 20 sekunder Invertera rack två gånger för att hjälpa till att samla alla pärlor. Avlägsna supernatanten med pipett, byta tips mellan prover. </li><li> Tillsätt 1 ml buffert Lysis till varje rör och försiktigt resuspendera pärlor. Detta kan göras genom att ta bort magnetremsan från ställningen och invertering av rack, med rör fortfarande på plats - 10-20 gånger eller tills kulorna är jämnt återsuspenderade. Samla pärlor. Avlägsna supernatanten med pipett. Upprepa detta tvättar 5 gånger, byta tips mellan tvättar. </li><li> Tvätta pärlor 6 gånger i 1 ml IP1 buffert, som beskrivs i steg 2. </li><li> Tvätta pärlor 6 gånger i 1 ml IP2 buffert, som beskrivs i steg 2. </li><li> Tvätta pärlor 6 gånger i 1 ml TE 8,0 buffert, som beskrivs i steg 2. </li><li> Snurra på 960 g till 3 minuter vid 4 ° C och ta bort eventuella rester av TE buffert. </li></ol> Eluering <ol><li> Tillsätt 210 ìl Elution buffert och eluera material från pärlor genom att inkubera rören i ett 65 ° C vattenbad i 15 min. Vortex kort varje 2 min. Detta inkubationstiden kan förlängas så länge som 30 min, vilket kan bidra till att förbättra återvinningen av eluatet. </li><li> Spinn ner pärlor på 16.000 gi 1 minut vid rumstemperatur. </li><li> Ta bort 200 l av supernatanten och övergång till nya rör. Material kan frysas vid -20 ° C och lagras över natten. </li></ol> Crosslink återföring <ol><li> Omvänd Crosslink den immunoprecipitation DNA från Elution, steg 3 genom att inkubera vid 65 ° C i minst 6 timmar och högst 15 timmar (längre tid i Crosslink återföring brukar resultera i ökad buller i microarray analys). Detta inkubation kan göras i en ugn så att röret värms upp jämnt och det är mindre kondens bildas. </li><li> Tina 50 ìl ingång DNA reserveras efter ultraljudsbehandling (steg 13), tillsätt 150 l (3 volymer) av eluering buffert och blanda. Omvänd Crosslink denna ingång DNA genom inkubation vid 65 ° C som i Crosslink återföring, Steg 1. Från denna punkt är varje tub immunoprecipitation eller ingång DNA anses vara en separat slang eller prov för senare processteg. </li></ol> Rening DNA <ol><li> Tillsätt 8 l 10 mg ml-1 RNaseA (0,2 mg ml-1 slutlig koncentration), blanda genom att vända röret flera gånger och inkubera vid 37 ° C i 2 h. </li><li> Tillsätt 4 l 20 mg ml-1 proteinas K (0,2 mikrogram ml-1 slutlig koncentration) och blanda genom att vända röret flera gånger och inkubera vid 55 ° C i 2 h. </li><li> Tillsätt 400 l fenol: kloroform: Isoamyl alkohol (P: C: IA), Vortex och olika etapper med 2 ml Heavy Phaselock rör (följ instruktionerna från Eppendorf). </li><li> Om P: C: IA lösning är gammal eller vid lågt pH, kommer det att finnas degradation av DNA, vilket leder till brus i microarray analys och förlust av upptäckt av giltiga mål. </li><li> Överför vattenskiktet till nya centrifugrör innehållande 16 ìl 5M NaCl (200 mm) slutlig koncentration) och 1,5 l på 20 μ l-1 glykogen (30 mikrogram totalt). </li><li> Tillsätt 800 l EtOH. Inkubera över natten vid -20 ° C eller 30 min vid -80 ° C. </li><li> Snurra på 20.000 g under 10 minuter vid 4 ° C till pellets DNA. Tvätta pellets genom att tillsätta 500 l på 80% EtOH, vortexa att resuspendera pelleten och spinning igen på 20.000 gi 5 min vid 4 ° C. </li><li> Ta bort eventuella återstående 80% EtOH. Spin rören kort att samla eventuella kvarvarande vätska och ta bort vätska med en pipetteman, undvika pellets. Låt rören lufttorka tills pellets är bara torra: pellets bör fortfarande behålla en fuktig utseende. Resuspendera varje pelleten i 70 ìl av 10 mM Tris-HCl, pH 8,0. </li><li> Overdrying av dessa pellets kan göra dem svåra att resuspendera, eller riskerar att flagna och skala bort från sidan av röret. </li><li> Tillval: Spara 15 ìl av immunoprecipitation prov för framtida bruk. Detta material kan användas för att utföra genspecifika PCR bekräftelse på microarray resultat. </li><li> Kvantifiera koncentration genom UV-absorption (260 nm). </li></ol> OBS: I följande steg inklusive bibliotek beredning och förstärkare använder en modifierad GenomePLex WGA kit med 10x Amp Mix från Sigma utan dNTPs: Bibliotek förberedelse Finns i GenomePLex WGA kit med 10x Amp Mix från Sigma <ol><li> Tillsätt 2 l 1X bibliotek Förberedelser buffert till 10 ìl av DNA-prov från Purification DNA, steg 11 i en PCR-rör. </li><li> Tillsätt 1 l av Bibliotek Stabilisering Solution. </li><li> Vortex grundligt, konsolidera genom centrifugering, och placera i värmecykeln vid 95 ° C i 2 minuter. </li><li> Kyl provet på is, konsolidera genom centrifugering genom centrifugering, och sedan återvända till isen. </li><li> Tillsätt 1 l av Bibliotek Förberedelser enzym, virvel grundligt, och centrifugera sedan en kort stund. </li><li> Placera provet i en termocykeln och inkubera enligt följande: <ul><li> 16 ° C i 20 minuter </li><li> 24 ° C i 20 minuter </li><li> 37 ° C i 20 minuter </li><li> 75 ° C i 5 minuter </li><li> 4 ° C håller </li></ul></li><li> Ta prov från termocykeln och centrifugera en kort stund. Prov kan förstärkas omedelbart eller förvaras vid 20 ° C i tre dagar. </li></ol> Förstärkning Finns i GenomePLex WGA kit med 10x Amp Mix från Sigma <ol><li> En Master Mix bereds genom att lägga till följande reagenser till 15 l reaktion från steg 3 nedan: <ul><li> 7,5 l 10X Amp Blanda (utan dNTPs) </li><li> 5,0 l av WGA DNA-polymeras </li><li> 3,0 l av en 10 mm dNTP (vardera) lager (slutlig koncentration 0,4 mM) </li><li> Ta sista reaktion volymen till 75 l med nukleasfritt vatten </li></ul></li><li> Vortex noggrant. Centrifugera kort och börja termocykling. <ul><li> Inledande Denaturering 95 ° C i 3 minuter </li><li> Utför 14 cykler enligt följande: </li><li> Denaturera 94 ° C i 15 sekunder </li><li> Glödga / Extend 65 ° C i 5 minuter </li></ul> Efter cyklingen är klar behålla reaktioner vid 4 ° C eller förvara vid -20 ° C tills för analys eller rening. </li><li> Rena DNA med PCR Rening ® Kit från Quiagen enligt tillverkarens anvisningar och kvantifiera koncentration genom UV-absorption (260 nm). </li><li> Gör återigen en cykel av förstärkning från Library Förberedelser, steg 1 genom Förstärkning, steg 2, med följande anpassningar. • När det gäller den mängd som krävs DNA från steg 3 ovan, att inleda sönderdelning: Om koncentrationen av DNA är ca 200-300 mikrogram / ml, använd 2,5 l av prov och justera med vatten till en slutlig volym på 10 l. Om koncentrationen av DNA är ca 50-60 mikrogram / ml, använd 5 ìl av prov och justera med vatten till en slutlig volym på 10 l. • I denna andra förstärkning process är dNTPs med dTTPs för Master Mix utbyte mot en blandning med 10 mM dATP, 10 mm dGTP, 10 mm dCTP och 8 mm dTTP och 2 mm dUTP vid samma koncentration som tidigare blanda. </li><li> Mät DNA med UV-VIS spektrofotometer (260 nm). Normalt är större än 9 mikrogram förstärkta DNA från varje reaktion. OBS: Märkning av DNA-mål utförs med GeneChip ® WT dubbelsträngat DNA Kit Terminal Märkning från Affymetrix enligt tillverkarens instruktioner, som beskrivs nedan: </li></ol> Fragment förstärks mål <ol><li> Fragment proverna med lämplig tabellen nedan beroende på vilken rad typ målet kommer att hybridized till. Tabell 1. Fragmentering Blanda enda arrayer <table border="1"><tbody><tr><td class="jove_content"> Komponent Volym / Belopp i 1 Rxn </td></tr><tr><td class="jove_content"> Dubbelsträngat DNA 7,5 mikrogram </td></tr><tr><td class="jove_content"> 10X cDNA Fragmentering 4,8 l </td></tr><tr><td class="jove_content"> UDG, 10 U / l 1,5 l </td></tr><tr><td class="jove_content"> APE 1, 100 U / l 2,25 l </td></tr><tr><td class="jove_content"> Nukleasfritt vatten upp till 48 l </td></tr></tbody></table> Finns i GeneChip ® WT dubbelsträngat DNA Terminal Märkning Kit från Affymetrix Tabell 2. Fragmentation Mix för multi-array set <table border="1"><tbody><tr><td> Komponent Volym / Belopp i 1 Rxn </td></tr><tr><td> Dubbelsträngat DNA 9 mikrogram </td></tr><tr><td> 10X cDNA Fragmentering 4,8 l </td></tr><tr><td> UDG, 10 U / l 1,5 l </td></tr><tr><td> APE 1, 100 U / l 2,25 l </td></tr><tr><td> Nukleasfritt vatten upp till 48 </td></tr></tbody></table> Finns i GeneChip ® WT dubbelsträngat DNA Terminal Märkning Kit från Affymetrix </li><li> Sätt upp fragmentering mix antingen enligt tabellerna ovan. Flick-mix och spinn ner rören. </li><li> Inkubera reaktioner på: <ul><li> 37 ° C under 1 h. </li><li> 93 ° C i 2 min. </li><li> 4 ° C i minst 2 minuter. </li></ul></li><li> Flick-mix, spinn ner rören och överför 45 l av provet till ett nytt rör. </li><li> Ta bort 2 ìl av varje prov för gel-shift analys. </li></ol> Etikett fragmenterade dubbelsträngat DNA <ol><li> Förbered dubbel-strängat Blanda DNA-märkning som beskrivs i tabellen nedan: Tabell 3. Sammansättning av dubbelsträngat DNA Märkning Mix <table border="1"><tbody><tr><td> Komponent Volym / Belopp i 1 Rxn </td></tr><tr><td> 5X TdT Buffert 12 l </td></tr><tr><td> TdT 2 l </td></tr><tr><td> DNA-märkning Reagens, 5 mm 1 l </td></tr><tr><td> Total volym 15 l </td></tr></tbody></table> Finns i GeneChip ® WT dubbelsträngat DNA Terminal Märkning Kit från Affymetrix </li><li> Tillsätt 15 ìl av dubbelsträngat DNA Märkning Blanda till DNA-prover, flick-mix, och spinn ner dem. </li><li> Inkubera reaktioner på: <ul><li> 37 ° C i 60 min. </li><li> 70 ° C i 10 min. </li><li> 4 ° C i minst 2 min. </li></ul></li><li> Ta bort 2 ìl av varje prov för gel-shift analys. </li></ol> Gel-shift analys <ol><li> Förbered en 4% agarosgel. </li><li> Inkubera prov från Fragment förstärks mål, Steg 5 och Label fragmenterade dubbelsträngat DNA, steg 4 vid 65 ° C i 2 min. </li><li> Tillsätt 10 ìl Streptavidin (1 mg / ml) och inkubera prover i rumstemperatur i 5 minuter. </li><li> Kör prov från Steg 3 på en 4% agarosgel (Gel-skift analys, steg 1) för att kontrollera förskjutning migration av märkning av produkter. </li></ol> Array hybridisering &amp; Array tvätt Utförd av Genomic Center vid University of California Riverside. Array analys Framförd av datoriserad analys. BUFFER kompositioner: Blockera Lösning: PBS + 0,5% bovint serumalbumin (BSA). Lyseringsbuffert: 50 mM HEPES-KOH, pH 7,5 140 mM NaCl 1 mM EDTA 1% Triton X-100 0,1% SDS 1mm PMSF Slutligt pH 7,5 IP1: lyseringsbuffert + 500 mM NaCl IP2: 10 mM Tris-HCl 250 mm LiCl 1 mM EDTA 0,5% NP-40 0,5% Natrium Dioxycholat Slutligt pH 8,0 TE: 10 mM Tris, pH 7,4 1 mM EDTA Slutligt pH 8,0 Eluering Buffer: TE-buffert + 1% SDS.

<ol>
	<li>Evans, M. J., Kaufman, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+in+culture+of+pluripotential+cells+from+mouse+embryos.">Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos.</a> Nature. 292, 154-156 (1981).</li><li>Boyer, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+complexes+repress+developmental+regulators+in+murine+embryonic+stem+cells.">Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells.</a> Nature. 441, 349-353 (2006).</li><li>Lee, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+developmental+regulators+by+Polycomb+in+human+embryonic+stem+cells.">Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells.</a> Cell. 125, 301-313 (2006).</li><li>Kornberg, R. D., Lorch, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Twenty-five+years+of+the+nucleosome,+fundamental+particle+of+the+eukaryotic+chromosome.">Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome.</a> Cell. 98, 285-294 (1999).</li><li>Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+and+Hox-specific+roles+for+the+MLL1+methyltransferase.">Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).</li><li>Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noncoding+RNAs+of+trithorax+response+elements+recruit+Drosophila+Ash1+to+Ultrabithorax.">Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax.</a> Science. 311, 1118-1123 (2006).</li></ol>

Kromatin immunoprecipitation (chip) erbjuder en värdefull teknik för dissekering av kromatin-baserade processer under cellulär differentiering. Förutsättningar för framgång denna metod är bra antikroppar och tillgången på kromatinet från celler eller vävnader som saknar antigen av intresse. Genom att kombinera chip med DNA microarray-teknik, stora mängder information kan erhållas. Valideringen av chip resultat beror på tillgången på lämpliga testsystem som kan länka den dynamiska förening av proteiner, modifieringar protein och / eller RNA med genomförandet av biologiska processer under cellens utveckling.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Poteinase-K</td>
<td>Reagent</td>
<td>Roche</td>
<td>#EO0491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNase-A</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fermentas</td>
<td>#EN0531</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>formaldehyde 37%</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>FX040-13</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Chloroform</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>3150</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ethanol </td>
<td>Reagent</td>
<td>Goldshield</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>phenol:chloroform:isoamyl alcohol</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15593-031</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SA, fraction V</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>2930</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dubecco's Phosphate Buffered Saline</td>
<td>Reagent</td>
<td>Gibco</td>
<td>14190</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>HEPES</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>5330</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>S271-10</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>EDTA</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>4050</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Triton X-100 </td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>9410</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>J.T Baker</td>
<td>4095-02</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lithium chloride</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>5910</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris-HCl</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>9230</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NP-40</td>
<td>Reagent</td>
<td>Calbiochem</td>
<td>492015</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Deoxycholic acid, sodium salt</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>BP349-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ammonium acetate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applichem</td>
<td>631-61-8</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>4840</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Glycine</td>
<td>Reagent</td>
<td>EMD</td>
<td>4840</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dynalbeads, protein A</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100.02D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>dynalbeads, protein G</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>100.04D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme</td>
<td>Other</td>
<td>Phenix Research Products</td>
<td>MAX-815S</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 2.0 ml</td>
<td>Reagent</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>955154037</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

chromatin immunoprecipitation from human embryonic stem cells

Den funktionella och strukturella komplexiteten i den myriad av celler i flercelliga organismer härrör från ett litet antal stamceller. Stamceller kännetecknas av två grundläggande egenskaper: självförnyelse och multipotency som gör att en stamcell differentieras till nästan alla celltyper 1. Progressionen stamceller till differentierade celler kännetecknas av förlust av multipotency, strukturella och morfologiska förändringar och hierarkiska aktivitet transkriptionsfaktorer och signalmolekyler, vars verksamhet upprätta och underhålla celltyp specifika mönster genuttryck. På molekylär nivå innebär celldifferentiering dynamiska förändringar av struktur och sammansättning av kromatin och upptäckt av dessa dynamiska förändringar kan ge värdefulla insikter i funktionella egenskaper stamceller och celldifferentiering processen 2,3. Kromatin är en mycket kompakt DNA-protein komplex som bildas när cellerna paketet kromosomalt DNA med proteiner, huvudsakligen histoner 4. Stemcellness och celldifferentiering har samband med förekomsten av specifika matriser av reglerande proteiner såsom epigenetiska faktorer histon varianter, och faktorer transkription 2,3,5. Kromatin immunoprecipitation (chip) ger en värdefull metod för att kontrollera förekomsten av RNA, proteiner och modifieringar protein i kromatin 6,7. Jämförelsen av kromatin från olika celltyper, som kan belysa dynamiska förändringar i protein-kromatin föreningar som sker under celldifferentiering. Kromatin immunoprecipitation innebär rening av in vivo tvärbunden kromatin. De isolerade kromatin är reducerad till mindre fragment genom enzymatisk spjälkning eller mekanisk kraft. Kromatin fragment fälls ut med hjälp av specifika antikroppar mot målproteiner eller protein och ändringar DNA. De utfällda DNA eller RNA renas och används som mall för PCR-eller DNA microarray baserade analyser. Förutsättningar för en lyckad ChIP är högkvalitativa antikroppar till önskad antigen och tillgången på kromatinet från kontroll celler som inte uttrycker målmolekyl. Chip kan korrelera förekomsten av proteiner, protein och RNA ändringar, och RNA med specifika mål-DNA, och beroende på valet av outread verktyg, upptäcker sammanslutning av målmolekyler vid specifikt mål gener eller i samband med en hela genomet. Jämförelsen av fördelningen av proteiner i kromatin att skilja celler kan belysa de dynamiska förändringar av kromatin sammansättning som sammanfaller med utvecklingen av celler längs en cellsläktträd.

Watch this Scientific Journal Video about Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells at JoVE.com

Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells

Differentieringen av ESK sammanfaller med celltyp specifika förändringar i struktur och sammansättning av kromatin. Upptäckten av dessa förändringar ger värdefulla insikter i de mekanismer som definierar stemcellness och celldifferentiering. Kromatin immunoprecipitation (chip) är en värdefull metod för att dissekera de molekylära mekanismerna bakom differentiering stamceller.

Kromatin Immunoprecipitation från mänskliga embryonala stamcellslinjer

The functional and structural complexity of the myriad of cells in metazoan organisms arises from a small number of stem cells. Stem cells are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Propagation of Human Embryonic Stem (ES) Cells

Propagation of Human Embryonic Stem ES Cells

Spridning av mänskliga embryonala stamceller (ES-celler)

Derivation of Hematopoietic Stem Cells from Murine Embryonic Stem Cells

Härledning av hematopoetiska stamceller från Murine embryonala stamceller

A stem cell is defined as a cell with the capacity to both self-renew and generate multiple differentiated progeny.  Embryonic stem cells (ESC) are ...

Derivation of Human Embryonic Stem Cells by Immunosurgery

Derivering av mänskliga embryonala stamceller genom Immunosurgery

The ability of human embryonic stem cells to self-renew and differentiate into all cell types of 
the body suggests that they hold great promise for both ...

Culture and Maintenance of Human Embryonic Stem Cells  

Kultur och underhåll av mänskliga embryonala stamcellslinjer

Human embryonic stem (hES) cells must be monitored and cared for in order to maintain healthy, undifferentiated cultures. At minimum, the cultures must be ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Kromosomala Sprid Beredning av mänskliga embryonala stamceller för karyotypning

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Freezing and Thawing Human Embryonic Stem Cells

Nedfrysning och upptining mänskliga embryonala stamcellslinjer

Since James Thomson et al developed a technique in 1998 to isolate and grow hES in culture, freezing cells for later use and thawing and expanding cells ...

Differentiation of Embryonic Stem Cells into Oligodendrocyte Precursors

Differentiering av embryonala stamceller till Oligodendrocyte Prekursorer

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. For regenerative cell therapy in demyelinating diseases, there is significant ...

Fate Mapping of Human Embryonic Stem Cells by Teratoma Formation

Ödet Kartläggning av mänskliga embryonala stamcellslinjer som Teratom Bildning

Human embryonic stem cells (hESCs) have an unlimited capacity for self-renewal, and the ability to differentiate into cells derived from all three ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

Kromatin Immunoprecipitation (chip) för analys Dynamisk Histon Ändring i aktiverade genuttryck i humana celler

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

Photobleaching Assays (FRAP &amp; FLIP) to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Photobleaching Assays FRAP & FLIP to Measure Chromatin Protein Dynamics in Living Embryonic Stem Cells

Fotoblekning tester (FRAP &amp; Flip) för att mäta Chromatin Protein Dynamics i Living embryonala stamceller

Fluorescence Recovery After Photobleaching (FRAP) and Fluorescence Loss In Photobleaching (FLIP) enable the study of protein dynamics in living cells with ...