Name: screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00
Duration: 10 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis at JoVE.com

אנו מודים סיימון אלברטי לסיוע בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק מטעם מכון הבריאות הלאומי (GM25874), הווארד יוז רפואי Investigatorship המכון (ל SL), וכן הקרן הלאומית למדע מענק predoctoral הכשרה (עד ר&quot;ה).

<html> חלק 1: הכנת ג&#39;ל <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את מגש הליהוק ג&#39;ל. ציוד סטנדרטי עבור אלקטרופורזה DNA אופקי יכול לשמש. עבור מספר גדול של דגימות, אנו מכינים 20 ס&quot;מ X 24 ס&quot;מ לוח עם עד ארבעה 50-היטב מסרקים. ודא הלוח אין שריטות, כמו אלה יכולים לעוות את התמונה כתם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פתרון 1.5% agarose (בינונית או גבוהה ג&#39;ל חוזק, EEO נמוך) ב 1X טה. הנפח צריך להיות מספיק כדי לצלול לחלוטין את השיניים מסרק - אתה רוצה לטעון מדגם ככל האפשר על מנת למקסם את הזיהוי. מיקרוגל התערובת עד agarose הוא נמס לגמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף במהירות SDS עד 0.1% מן המניות של 10%. מערבולת לערבב. אם agarose כמה מבצרת במהלך שלב זה, redissolve באמצעות צלחת חמה להיזהר רותחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את הפתרון למגש הליהוק. שימוש במסרק לרוקן את כל הבועות, כפי שהם יכולים מאוחר יותר להפריע ההעברה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל קבע, להסיר מסרקים והמקום הג&#39;ל לתוך הטנק ג&#39;ל. לחלוטין את ג&#39;ל 1X טה לצלול המכיל 0.1% SDS. </li></ol> חלק 2: הכנת דוגמאות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח תפוקה גבוהה של lysates שמרים, אנחנו מתחילים עם 2-ml תרבויות גדל לילה טוב 96-חוסם עם תסיסה מהירה. במקרה זה, כל תרבות היא overexpressing חלבון של עניין. בניתוח חלבונים בשפע נמוך, תרבות כרכים גדולים יש להשתמש </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר תאים על ידי צנטריפוגה ב RCF 2000 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend תאים מים צנטריפוגות שוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend בפתרון 1 מ&quot;ל spheroplasting. דגירה של כ -30 דקות ב -30 ° C (אתה יכול לאשר את היעילות spheroplasting ידי מיקרוסקופית). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה ב RCF 800 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר לחלוטין supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend spheroplasts pelleted במאגר 100 מ&quot;ל תמוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הבלוק עם קלטת מערבולת על מהירות גבוהה במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה הסלולר פסולת בבית RCF 4000 דקות 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוציאים בזהירות supernatant למיכל חדש, למשל, גם צלחת 96-PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, תוכל לקבוע את הריכוז של חלבון lysates. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ מדגם 4X את דגימות כדי ליצור lysates המכיל 1X חיץ המדגם. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען ג&#39;ל. אם תרצה, תוכל לחסוך חצי נפח מדגם להרתיח אותו לניתוח SDS-PAGE. על מנת לנטר את מידת העברת מאוחר יותר, כוללים מראש מוכתם SDS-PAGE הסמן. בנוסף, סמן משקל מולקולרי המורכב של חלבונים גדולים מאוד (למשל, עוף הפקטוראלי לחלץ) יכול לשמש כדי להעריך גודל של מתחמי נפתרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעלה במתח נמוך (3 ≤ V / ס&quot;מ אורך ג&#39;ל) עד ​​הכניסה לצבוע מגיע ~ 1 ס&quot;מ מהקצה של הג&#39;ל. זה ייקח כמה שעות. חשוב הג&#39;ל להישאר רגוע, אחרת דיפוזיה של חלבונים בעלי משקל מולקולרי נמוך (לדוגמה, מונומרים) יכול להגביל את גילוי שלהם. </li></ol> חלק 3: העברת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים פיסת nitrocellulose לממדי כמו הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים 20 חתיכות של GB004 ו -8 פיסות נייר סופג GB002, לממדי כמו הג&#39;ל. חותכים חתיכה נוספת של GB004 לשמש הפתיל; לעשות את זה על 20 סנטימטרים יותר מאשר הג&#39;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את nitrocellulose, פתילה, ו 4 חתיכות של GB002 ב 1X כפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במיכל פלסטיק, להרכיב את ערימת ניירות כדלקמן: 20 חתיכות של GB004 יבש, אז 4 חתיכות של GB002 יבש, אז חתיכה אחת של GB002 מראש רטוב. הנח את nitrocellulose על גבי זה בערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את הג&#39;ל על בקצרה את מגש הליהוק במים כדי להסיר את החיץ פועל עודף. ואז, בזהירות מתחילים להחליק את הג&#39;ל את המגש על הערימה. אמנם החלקת ג&#39;ל את המגש, לכבות את הממברנה עם כפות לפי הצורך. חיץ נוסף עוזר למנוע בועות מלהפוך לכודים תחת הג&#39;ל. פיפטה להעביר עובד היטב למטרה זו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ג&#39;ל הועברה מחסנית, לבדוק ביסודיות על בועות. אם יש כאלה, להרים את קצה הג&#39;ל ולהחיל מחדש חוצץ עד בועות יכול להיות עבד החוצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמים את יתרת three מראש הרטובות GB002 חתיכות על גבי הג&#39;ל. ודא קשר יסודי בין כל השכבות על ידי גלגול פיפטה בחוזקה לרוחב החלק העליון של המחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצלע מחסנית העברה עם שני מגשים גבוהות המכיל כפות. לכסות את הפתיל מראש רטוב על פני מחסנית כזו או סוף הפתיל הוא שקוע כפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הערימה העברת התאספו עם מגש פלסטיק נוספת נושאת משקל נוסף (למשל, בקבוק 500 מ&quot;ל מים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להמשיך להעביר מינימום של שלוש שעות, או למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההעברה, הקרום יכול להיות מעובד על ידי תקן המערבי סופג. </li></ol> Spheroplasting פתרון 1.2 מ &#39;ד סורביטול 0.5 mM MgCl 2 20 מ&quot;מ טריס, pH 7.5 BME 50 מ&quot;מ (להוסיף טרי) 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​Zymolyase 100T (להוסיף צח) coration: להדגיש: &quot;&gt; תמוגה הצפת 100 מ&quot;מ טריס 7.5 50 mM NaCl 10 mM BME (להוסיף צח) מעכבי פרוטאז (להוסיף צח) לדוגמא 4X הצפת טה 2X 20% גליצרול 8% SDS כחול bromophenol להעדפה

<ol>
	<li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+[PSI+]+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104.">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li><li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast:+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION.">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li><li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle:+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+[PSI+].">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li><li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+[RNQ+]+seeds+necessary+for+prion+propagation..">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation..</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase.">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li><li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+(eRF3)+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids.">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li><li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability.">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity.">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li><li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein(a)+phenotyping.">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li></ol>

SDD-AGE דווח לראשונה על ידי Kryndushkin et al. 1, ללמוד SDS עמידים קומפלקסים של [PSI +] הפריון של שמרים, ומצא כי השימוש הנרחב ללמוד הן הפריון ואת הפריון הלא אגרגטים 2-9. עם זאת, העברה של חלבונים כדי אלקטרופורזה קרום הבאים ג&#39;ל agarose הוא בעייתי, והוא יכול להביא תמונה כתם מעוות 5. בנוסף, טכניקה electroblotting שקוע הנפוץ ביותר מציג מגבלות מעשיות בגודל של הג&#39;ל ולכן מספר דגימות כי יכול להיות מעובד. אנחנו צריכים לטפל בבעיות אלה על ידי המעסיק להעביר נימי כלפי מטה 10, הליך פשוט אשר משתמשת ערמת ניירות סופג יבש להעברת חלבונים מן הג&#39;ל על קרום nitrocellulose. העברת נימי מונע עיוות ומאפשר ג&#39;לים גדול להיות מעובד בנקל. יש כמה דברים לשקול לפני השימוש SDD-AGE. לקבלת דוגמיות גולמי (למשל, lysates), immunodetection של חלבונים מסוימים הוא הכרחי. SDD-AGE אינו מלא לפגל קומפלקסים חלבונים של עניין, כל כך את החלבון (ים) כדי להתגלות חייב לשאת תג epitope מחוץ לאזור amyloidogenic. Lysates יכולים בדרך כלל להיות מוכנים כפי שהם היו להיות נורמלי SDS-PAGE, עם שני הבדלים חשובים. ראשית, הטיפול חייב להילקח מוגברת כדי למנוע השפלה ידי proteolysis. התנאים חלקית denaturing משמש כאן אינם מספיקים כדי להשבית פרוטאזות, והוא יכול גם לייצר חלבונים היעד רגישים יותר proteolysis. השתמש קוקטייל להשלים מעכבי פרוטאז בריכוז לפחות כפולה מומלץ. שנית, חימום הדגימות יש להימנע. אם פקד כל מונומר שלילי הרצויה, למשל כדי לאשר גבוהה מולקולרית משקל מינים שאינם בשל שינויים קוולנטיים, דגירה של 10 דקות בשעה 95 ° C יכול לשמש, אשר תשחזר ביותר amyloids לחלבון monomeric.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>zymolyase 100T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seikagaku America</td>
<td>120493-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>78429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybond-C extra nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN303E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB004 blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>10427926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB002 (3MM Chr) blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-917</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose (UltraPure)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis

צבירה עמילואיד קשורה רבים misfolding פתולוגיות חלבון בבסיס המאפיינים זיהומיות של פריונים, שהם conformationally עצמית בניית תבנית חלבונים, כי הם חשבו שיש תפקידים מועילים אורגניזמים נמוכה יותר. Amyloids היה קשה ללמוד לשמצה בשל שבחוסר שלהם הטרוגניות מבנית. עם זאת, החלטה של ​​פולימרים עמילואיד על בסיס גודל שבחוסר אבקת כבר מתאפשרת על ידי חצי Denaturing דטרגנט-agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה (SDD-AGE). טכניקה זו היא למצוא שימוש נרחב לגילוי ואפיון של וריאנטים עמילואיד קונפורמציה. הנה, אנחנו מדגימים עיבוד של טכניקה זו המאפשרת את השימוש בו יישומים בקנה מידה גדול, כגון מסכי עבור פריונים הרומן amyloidogenic חלבונים אחרים. השיטה החדשה SDD-AGE משתמשת להעביר נימי של אמינות גדולה יותר וקלות השימוש, והוא מאפשר לכל ג&#39;ל בגודל להיות לאכלס. לכן, מספר גדול של דגימות, שהוכן תאים או חלבונים מטוהרים, יכול להיות מעובד בו זמנית עבור נוכחות של SDS מסיס conformers של החלבונים המתויגים.

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis at JoVE.com

Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

SDD-AGE היא טכניקה יעילה לגילוי ואפיון של עמילואיד פולימרים דמויי תאים. כאן אנו מדגימים עיבוד שעושה בטכניקה זו מקובל יישומים בקנה מידה גדול.

הקרנת עבור צבירת עמילואיד על ידי חצי Denaturing אלקטרופורזה דטרגנט-agarose ג&#39;ל

Amyloid aggregation is associated with numerous protein misfolding pathologies and underlies the infectious properties of prions, which are ...

Research

JoVE Journal

Biology

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)

Denaturing Gradient Gel Electrophoresis DGGE

Denaturing ג&#39;ל אלקטרופורזה Gradient (DGGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis (Urea PAGE)

Denaturing Urea Polyacrylamide Gel Electrophoresis Urea PAGE

Denaturing polyacrylamide דשן ג&#39;ל אלקטרופורזה (עמוד דשן)

Urea PAGE or denaturing urea polyacrylamide gel electrophoresis employs 6-8 M urea, which denatures secondary DNA or RNA structures and is used for their ...

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Live Dissection of Drosophila Embryos: Streamlined Methods for Screening Mutant Collections by Antibody Staining

Dissection חיים של תסיסנית עוברים: שיטות יעיל עבור הקרנת אוספים Mutant ידי מכתים נוגדן

Drosophila embryos between stages 14 and 17 of embryonic development can be readily dissected to generate "fillet" preparations.  In these preparations, ...

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis BN-PAGE for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

ג&#39;ל כחול Native polyacrylamide אלקטרופורזה (BN-PAGE) עבור ניתוח של מתחמי multiprotein מ lysates נייד

Multiprotein complexes (MPCs) play a crucial role in cell signalling, since most proteins can be found in functional or regulatory complexes with other ...

Pouring and Running a Protein Gel by reusing Commercial Cassettes

לשפוך והפעלה Gel חלבון על ידי שימוש חוזר קלטות מסחריים

The evaluation of proteins using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis is a common technique used by biochemistry ...

Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments

ג&#39;ל אלקטרופורזה agarose להפריד את קטעי ה-DNA

Agarose gel electrophoresis is the most effective way of separating DNA fragments of varying sizes ranging from 100 bp to 25 kb1. Agarose is isolated from ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

הקרנת תפוקה גבוהה עבור כימית מאפננים של גני Post-תעתיק מוסדר

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Mucin Agarose Gel Electrophoresis: Western Blotting for High-molecular-weight Glycoproteins

Mucin Agarose ג&#39;ל אלקטרופורזה: מערבי סופג עבור גליקופרוטאינים גבוה בעל משקל מולקולרי


Mucins, the heavily-glycosylated proteins lining mucosal surfaces, have evolved as a key component of innate defense by protecting the epithelium against ...

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...