Name: screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis
Uploaded: 2008-07-16T17:18:00
Duration: 10 min 3 s
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우리는이 프로토콜을 개발과 지원 사이먼 Alberti 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원 (GM25874), 하워드 휴즈 의학 연구소 Investigatorship (SL)을, 그리고 국립 과학 재단 predoctoral 훈련 부여 (RH)을에서 교부금에 의해 지원되었다.

<html> 1 부 : 겔 준비 <ol><li> 겔 주조 트레이를 조립. 수평 DNA 전기 영동 표준 장비를 사용할 수 있습니다. 샘플 많은 경우, 우리는 최대 4 개의 50 - 잘 빗과 함께 X 24cm 슬래브 20cm를 준비합니다. 이들은 얼룩 이미지를 왜곡 수 슬래브가 흠집이없는 있는지 확인하십시오. </li><li> 1X 태의 1.5 % 아가로 오스 솔루션 (중간 또는 높은 겔 강도, 낮은 EEO)를 만듭니다. 볼륨 완전히 잠수함 빗 치아를 충분히해야합니다 - 당신은 검색을 최대화하기 위해 가능한 한 많은 예제를로드하는 것이 좋습니다. 마이크로 웨이브는 혼합물은 아가로 오스는 완전히 녹아 때까지. </li><li> 신속하게 10 %의 주식의 0.1 %에 SDS를 추가합니다. 섞어 소용돌이. 일부 아가로 오스는이 단계 동안 굳은 경우, 뜨거운 접시를 사용하여 redissolve하고 끓는 않도록주의하십시오. </li><li> 캐스팅 트레이에 솔루션을 하거라. 그들이 나중에 전송을 방해할 수있는 것처럼 언제 거품이 밖으로 경사각에 빗을 사용합니다. </li><li> 젤 설정한 후, 빗을 제거하고 겔 탱크에 젤 넣습니다. 완전 잠수함 1X 태에서 젤은 SDS 0.1 %를 포함. </li></ol> 2 부 : 준비 샘플 <ol><li> 효모 lysates의 높은 처리량 분석을 위해, 우리는 96 블록에 잘 급속한 동요와 하룻밤 성장 2 - ML 문화로 시작합니다. 이 경우, 각 문화는 overexpressing 관심의 단백질이다. 낮은 풍부한 단백질을 분석하면, 더 큰 문화 볼륨을 사용해야합니다 </li><li> 상온에서 5 분 2000 RCF에서 원심 분리하여 세포를 수확. </li><li> 다시 물, 원심 분리기에서 세포를 Resuspend. </li><li> 1 ML spheroplasting 솔루션 Resuspend. 30 약 30 분 품어 ° C (당신은 현미경으로 spheroplasting 효율성을 확인 수 있습니다.) </li><li> 상온에서 5 분 800 RCF에서 원심 분리기. 완전히 뜨는 제거합니다. </li><li> 100 ML의 용해 버퍼 pelleted spheroplasts을 Resuspend. </li><li> 테이프 2 분 고속에 소용돌이와 함께 블록을 커버. </li><li> 2 분 4,000 RCF에서 펠렛 셀룰러 잔해. </li><li> 조심스럽게 새로운 용기, 예를 들어, 96 - 웰 플레이트 PCR에 뜨는 제거합니다. </li><li> 원하는 경우, lysates의 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 1X 샘플 버퍼를 포함하는 lysates를 생성하는 샘플에 4X 샘플 버퍼를 추가합니다. 상온에서 5 분 알을 품다. </li><li> 젤을로드합니다. 원하는 경우, 샘플 볼륨의 절반을 저장하고 SDS - PAGE 분석을 위해 끓여. 나중에 양도의 범위를 모니터하기 위해, 사전에 묻은 SDS - PAGE 마커를 포함합니다. 또한, 매우 큰 단백질 (예, 닭고기 pectoralis 추출)로 구성된 분자량 마커가 해결 단지의 크기를 추정하는 데 사용할 수 있습니다. </li><li> 염료 앞에는 젤의 끝에서 ~ 1cm에 도달할 때까지 저전압 (≤ 3 V / cm 겔 길이)에서 실행합니다. 이것은 몇 시간이 소요됩니다. 젤 시원한 유지하는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 낮은 분자량의 단백질 (예 : 단량체)의 확산들은 검색을 제한할 수 있습니다. </li></ol> 파트 3 : 전송 <ol><li> 젤 같은 크기로 nitrocellulose의 한 조각을 잘라 버릴거야. </li><li> 젤 같은 크기로 GB004 20 조각과 GB002 압지 8 조각을 잘라 버릴거야. 심지로 사용될 GB004의 추가 부분을 잘라, 겔보다 약 20 cm 폭을합니다. </li><li> 1X TBS에서 nitrocellulose, 심지, 그리고 GB002 4 조​​각을 담가. </li><li> 마른 GB004 20 조각, 다음 마른 GB002 4 조​​각, 다음 사전 서부 유럽 표준시 GB002 중 하나 조각 : 플라스틱 용기에, 다음과 같이 서류의 스택을 조립. 이 스택의 상단에있는 nitrocellulose 있다고 믿는다. </li><li> 초과 실행 버퍼를 제거하는 물에 캐스팅 트레이 간략에서 젤 린스. 그런 다음, 조심스럽게 스택에 트레이에서 젤 슬라이드 시작합니다. 트레이에서 젤 슬라이딩 있지만, 필요에 따라 TBS와 멤브레인을 줄여봐. 추가 버퍼 젤 아래에 갇혀되는 것을 거품을 방지하는 데 도움이됩니다. 전송 피펫이 목적을 위해 잘 작동합니다. </li><li> 젤이 스택으로 이동되었습니다 후, 거품에 대해 철저히 확인하십시오. 어떤이있는 경우, 젤의 가장자리를 채취해서 거품이 해낼 수있을 때까지 버퍼를 다시 적용합니다. </li><li> 젤 위에 나머지 세 미리 침수 GB002 조각을 넣어. 단단히 스택의 맨 위에 피펫 롤링하여 모든 레이어 간의 접촉을 철저히 보장합니다. </li><li> TBS 담긴 두개의 높은 쟁반과 플렝크 전송 스택을. 심지의 양쪽 끝에이 TBS에 빠져들 것입니다 이러한 스택에 걸쳐 사전 서부 유럽 표준시 심지를 드레이프. </li><li> 추가 무게를 (예, 물 500 ML 병) 베어링 추가 플라스틱 트레이로 조립 전송 스택을 커버. </li><li> 세 시간이나 밤새 최소 진행 전송을 허용합니다. </li><li> 전송 후, 멤브레인 표준 양식은 모래 바닥으로 처리할 수 있습니다. </li></ol> Spheroplasting 솔루션 1.2 M D - sorbitol 0.5 MM MgCl 2 20 MM 트리스, 산도 7.5 50 MM의 BME (신선 추가) 0.5 MG / ML Zymolyase 100T는 (신선한 추가) coration : 밑줄; &quot;&gt; 용해 완충액 100 MM 트리스 7.5 50 MM NaCl 10 MM BME는 (신선한 추가) 단백 분해 효소 억제제는 (신선한 추가) 4X 샘플 버퍼 2X 태 20 % 글리세롤 8퍼센트 SDS 취향에 bromophenol 블루

<ol>
	<li>Kryndushkin, D. S., Alexandrov, I. M., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+[PSI+]+prion+aggregates+are+formed+by+small+Sup35+polymers+fragmented+by+Hsp104.">Yeast [PSI+] prion aggregates are formed by small Sup35 polymers fragmented by Hsp104.</a> J. Biol. Chem. 278, 49636-49643 (2003).</li><li>Alexandrov, I. M., Vishnevskaya, A. B., Ter-Avanesyan, M. D., Kushnirov, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+and+Propagation+of+Polyglutamine-based+Amyloids+in+Yeast:+TYROSINE+RESIDUES+ENABLE+POLYMER+FRAGMENTATION.">Appearance and Propagation of Polyglutamine-based Amyloids in Yeast: TYROSINE RESIDUES ENABLE POLYMER FRAGMENTATION.</a> J. Biol. Chem. 283, 15185-15192 (2008).</li><li>Allen, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperones+as+modulators+of+prion+life+cycle:+novel+effects+of+Ssa+and+Ssb+on+the+Saccharomyces+cerevisiae+prion+[PSI+].">Hsp70 chaperones as modulators of prion life cycle: novel effects of Ssa and Ssb on the Saccharomyces cerevisiae prion [PSI+].</a> Genetics. 169, 1227-1242 (2005).</li><li>Aron, R., Higurashi, T., Sahi, C., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J-protein+co-chaperone+Sis1+required+for+generation+of+[RNQ+]+seeds+necessary+for+prion+propagation..">J-protein co-chaperone Sis1 required for generation of [RNQ+] seeds necessary for prion propagation..</a> The EMBO journal. 26, 3794-3803 (2007).</li><li>Bagriantsev, S. N., Kushnirov, V. V., Liebman, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+amyloid+aggregates+using+agarose+gel+electrophoresis.">Analysis of amyloid aggregates using agarose gel electrophoresis.</a> Methods in Enzymology. 412, 33-48 (2006).</li><li>Borchsenius, A. S., Muller, S., Newnam, G. P., Inge-Vechtomov, S. G., Chernoff, Y. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+variant+maintained+only+at+high+levels+of+the+Hsp104+disaggregase.">Prion variant maintained only at high levels of the Hsp104 disaggregase.</a> Current Genetics. 49, 21-29 (2006).</li><li>Salnikova, A. B., Kryndushkin, D. S., Smirnov, V. N., Kushnirov, V. V., Ter-Avanesyan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonsense+suppression+in+yeast+cells+overproducing+Sup35+(eRF3)+is+caused+by+its+non-heritable+amyloids.">Nonsense suppression in yeast cells overproducing Sup35 (eRF3) is caused by its non-heritable amyloids.</a> J. Biol. Chem. 280, 8808-8812 (2005).</li><li>Tank, E. M., Harris, D. A., Desai, A. A., True, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prion+protein+repeat+expansion+results+in+increased+aggregation+and+reveals+phenotypic+variability.">Prion protein repeat expansion results in increased aggregation and reveals phenotypic variability.</a> Mol. Cell. Biol. 27, 5445-5455 (2007).</li><li>Douglas, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chaperone-dependent+amyloid+assembly+protects+cells+from+prion+toxicity.">Chaperone-dependent amyloid assembly protects cells from prion toxicity.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 7206-7211 (2008).</li><li>Nagy, B., Costello, R., Csako, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Downward+blotting+of+proteins+in+a+model+based+on+apolipoprotein(a)+phenotyping.">Downward blotting of proteins in a model based on apolipoprotein(a) phenotyping.</a> Analytical Biochemistry. 231, 40-45 (1995).</li></ol>

SDD - AGE 먼저 Kryndushkin 외 의해보고되었다. 1, SDS 방지 단지 공부를 [PSI +] 효모의 프리온, 이후 프리온이 아닌 프리온 집계 2-9 모두를 공부하고 널리 사용 발견했습니다. 그러나, 아가로 오스 겔에서 막 다음 전기 영동으로 단백질의 양도 문제이며, 왜곡된 얼룩 이미지 5 발생할 수 있습니다. 또한, 가장 일반적으로 사용하는 잠수 electroblotting 기술은 젤의 크기에 대한 실질적인 제한을 도입하기 때문에 처리할 수 샘플의 수입니다. 우리는 아래로 모세 전송 10, 겔에서 nitrocellulose 막에 단백질을 전송 마른 모래 바닥 논문의 스택을 사용하는 간단한 절차를 채용하여 이러한 문제를 해결했습니다. 모세관 전송 왜곡을 방지하고 대형 젤 쉽게 처리할 수 있습니다. SDD - AGE를 사용하기 전에 고려해야 할 몇 가지가 있습니다. 원유 샘플 (예 : lysates), 특정 단백질의 면역이 필요합니다. SDD - 나이가 충분히 관심의 단백질 단지를 변성하지 감지하는 단백질 (들)은 amyloidogenic 지역 이외의 에피토프 태그를 부담합니다 그럼. 그들이 정상적인 SDS - PAGE를위한 것입니다 같은 Lysates는 일반적으로 두 가지 중요한 차이점으로 준비하실 수 있습니다. 첫째, proteolysis에 의해 저하를 방지하기 위해 증가주의 이동합니다. 여기에 사용되는 부분 denaturing 조건은 프로 테아제를 inactivate에 충분하지 않은, 또한 proteolysis에 타겟 단백질이 더 취약 할 수 있습니다. 적어도 두 배 권장 농도에서 전체 테아제 억제제 칵테일을 사용합니다. 둘째, 샘플을 피해야한다 가열. 모든 단량체 음성 컨트롤이 필요한 경우, 예를 들어 높은 분자 - 중량 종은 monomeric 단백질 가장 amyloids를 복원하는 것입니다 공유 결합 수정, 95에서 10 분 배양 ° C를 사용할 수로 인해하지 않는지 확인합니다.

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		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
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<tr>
<td>zymolyase 100T</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Seikagaku America</td>
<td>120493-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>78429</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Hybond-C extra nitrocellulose</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Amersham</td>
<td>RPN303E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB004 blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>10427926</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GB002 (3MM Chr) blotting paper</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Whatman</td>
<td>3030-917</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Agarose (UltraPure)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15510-027</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
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screening for amyloid aggregation by semi-denaturing detergent-agarose gel electrophoresis

아밀로이드 집계는 conformationally 아르 다수의 단백질의 misfolding pathologies과 underlies prions의 전염성 속성 자체 템플릿 낮은 생물에 유익한 역할을 할 생각되고 있습니다 단백질을.과 관련된 Amyloids들은 불용성 및 구조 이질에 의한 연구에 악명 어려운되었습니다. 그러나, 크기 및 세제 불용성을 바탕으로 아밀로이드 고분자의 해상도에 의해 가능하게되었습니다 세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 겔 전기 영동을 (SDD - AGE). 이 기술은 아밀로이드 conformational 변종의 검출 및 특성에 대한 광범위한 사용을 찾는 것입니다. 여기, 우리는 소설 prions 및 기타 amyloidogenic 단백질에 대한 화면으로 대규모 애플 리케이션에서의 사용을 용이하게이 기술의 적응을 보여줍니다. 새로운 SDD - AGE 방법은 더 큰 안정성을 위해 모세 전송을 사용하고 사용의 용이성, 그리고 모든 크기의 겔이 수용 수 있습니다. 따라서, 세포 또는 정제된 단백질에서 준비한 샘플 많은가, 태그 단백질의 SDS - 불용성 conformers의 존재를 동시에 처리할 수 있습니다.

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Screening for Amyloid Aggregation by Semi-Denaturing Detergent-Agarose Gel Electrophoresis

SDD - 나이가 세포에서 고분자와 같은 아밀로이드의 감지 및 특성화를위한 유용한 기법입니다. 여기 우리는 대규모 응용 프로그램에이 기술을 의무하게 적응을 보여줍니다.

세미 Denaturing 세제 - 아가로 오스 젤 전기 영동에 의해 아밀로이드 집계에 대한 심사

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