Name: sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

قبل البدء في عملية الفحص ، ونحن بحاجة للتأكد من أن يتم إعداد بشكل صحيح الكواشف التالية : <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وفوسفات البوتاسيوم 50 ملي العازلة ، ودرجة الحموضة 7.5. يعد استخدام 11.4 ملغ / مل من ثنائي القاعدة phospate البوتاسيوم ، هيدرات في تنقية المياه وتعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك 1M. يتم وضع هذا الحل في 37 درجة مئوية قبل الاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 0.65 ٪ حل الكازين الوزن / الحجم ، التي أعدها خلط 6،5 ملغ / مل من الكازين في المنطقة العازلة 50 مم فوسفات البوتاسيوم. زيادة درجة الحرارة تدريجيا مع التحريك حل لطيف 80-85 درجة مئوية لمدة 10 دقائق تقريبا حتى يتم التوصل إلى تشتت متجانسة. فمن المهم جدا ألا يغلي الحل. ثم يتم تعديل درجة الحموضة إذا لزم الأمر مع هيدروكسيد الصوديوم وحمض الهيدروكلوريك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A 110 ملي حل حمض حمض التريكلوروسيتيك ، التي أعدها تمييع a 1:55 الأسهم 6.1N مع تنقية المياه. حمض التريكلوروسيتيك حمض هو حمض قوي ، وينبغي التعامل معها بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 مم و فولين Ciolcaltea ، أو الكاشف فولين الفينول ، والذي هو الحل الذي سوف تتفاعل مع التيروزين لتوليد تغيير لون قياسها التي من شأنها أن تكون ذات صلة مباشرة الى نشاط البروتياز. الكاشف فولين هو حمض الفينول ، وينبغي التعامل معها بحذر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> والصوديوم 500 مم حل كربونات ، أعدت باستخدام 53 ملغم / لتر من كربونات الصوديوم في المياه النقية anyhydrous. حلا مخفف الانزيم الذي يتكون من 10 ملي خلات الصوديوم العازلة مع خلات الكالسيوم 5mm ، و 7.5 درجة الحموضة ، في 37 درجة مئوية. هذا الحل هو ما نستخدمه لإذابة العينات البروتيني صلبة أو تمييع حلول الانزيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> L - 1.1 ملم التيروزين محلول المخزون قياسي. أعدت باستخدام 0.2 ملغ / مل L - التيروزين في تنقية المياه وتسخينها برفق حتى يذوب التيروزين. كما هو الحال مع الكازين ، لا تغلي هذا الحل. يسمح المعيار L - التيروزين لتبرد إلى درجة حرارة الغرفة. وسوف تضعف هذا الحل أخرى لجعل منحنى لدينا القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البروتيني الحل. على الفور قبل استخدامه ، ويحل في محلول مخفف البروتيني الانزيم أعد في الخطوة 6. </li></ol> إذا كان ذلك ضروريا ، واستخدام عينة صلبة من نشاط الأنزيم البروتيني محددة سلفا ، والتي حلت به مخفف لانزيم 0،1-0،2 وحدة / مل. هذا الحل بمثابة مراقبة إيجابية على جودة الفحص والرقابة والتحقق من صحة الحسابات ونحن سوف تؤدي إلى تحديد نشاط انزيم. إعداد الفحص البروتياز والمنحنيات القياسية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لنبدأ هذا الاختبار ، والعثور على قنينة المناسبة التي ستعقد حوالي 15 مليليتر. لكل الانزيم الذي سيتم اختباره ، وهناك حاجة إلى 4 قوارير. وسيتم استخدام قارورة واحدة باعتبارها فارغة ، وسيتم استخدام ثلاثة آخرين لفحص النشاط ثلاثة من التخفيفات البروتيني. التخفيفات ثلاثة مفيدة عند فحص الحسابات النهائية ضد بعضها البعض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على كل مجموعة من أربع قوارير ، إضافة 5mls من حلنا الكازين 0.65 ٪. دعوهم توازن في حمام مائي عند 37 لمدة 5 دقائق درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة أحجام متفاوتة حل الانزيم الذي سيتم اختبار لثلاث من قوارير عينة الاختبار ، ولكن ليس فارغا. مزيج من قبل دوامات واحتضان لمدة 37 درجة مئوية لمدة عشر دقائق بالضبط. نشاط الأنزيم البروتيني والتحرر من التبعية التيروزين خلال هذه الفترة الحضانة هو ما سيتم قياس ومقارنة بين عينات الاختبار. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد هذا الاحتضان 10 دقيقة ، إضافة ملل 5 من كاشف TCA إلى كل أنبوب لمنع رد الفعل. ثم ، إضافة حجم مناسب لانزيم حل لكل أنبوب ، حتى فارغة ، بحيث الحجم النهائي من الحل الانزيم في كل أنبوب 1 مل. يتم ذلك لحساب قيمة الامتصاصية للانزيم نفسها ، لضمان أن حجم النهائي في كل أنبوب هو على قدم المساواة. احتضان الحلول في 37 دقيقة لمدة 30 درجة مئوية. خلال هذه الحضانة لمدة 30 دقيقة ، قد تحتاج لإعداد المعيار الخاص التخفيفات التيروزين. 6 الدرام استخدام قوارير (يمكن استبداله قارورة الدرام مع أنابيب البولي بروبلين) التي يمكن أن تعقد بسهولة 8 ملل. الى قارورة ستة إضافة 1.1 ملم التيروزين الحلول الأسهم القياسية مع وحدات التخزين التالية في ملل : 0.05 ، 0.10 ، 0.20 ، 0.40 ، 0.50. لا تضف أي معيار التيروزين إلى فارغة. قد تكون هناك حاجة لخفض معايير اختبار عينات من النجاسة التي سوف تسفر قليلا تغيير اللون. مرة واحدة تم إضافة حل التيروزين القياسية ، إضافة حجم مناسب من الماء النقي الى كل من معايير لتحقيق وحدة التخزين إلى 2 ملل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد حضانة لمدة 30 دقيقة ، كل مرشح للحلول اختبار فارغة وباستخدام حقنة 0.45 ميكرون polyethersulfone التصفية. مطلوب الترشيح لإزالة أي insolubles من العينات. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ترشيح 2 ملل من عينات الاختبار والترشيح للقوارير فارغة الدرام 4 التي يمكن أن تعقد ما لا يقل عن 8 ملل. ويمكن استخدام نفس النوع من القنينة التي أعدت المعايير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إلى كل من قوارير تحتوي على المعايير القياسية ، وفارغة ، إضافة 5mls من كربونات الصوديوم. للحصول على أفضل النتائج ، إضافة 1 مل من كاشف فولين بعد ذلك على الفور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم لتنظيم أي انخفاض الرقم الهيدروجيني إنشاؤها بواسطة إضافة كاشف للفولين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كربونات الصوديوم للعينات الاختبار والاحصائيينر فارغة. هذه الحلول يصبح غائما بعد إضافة كربونات الصوديوم. إضافة كاشف للفولين ، والتي سترد في المقام الأول مع التيروزين الحرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج قارورة الدرام التي تدور في احتضان و37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. </li></ol> بعد هذه الحضانة ، يجب أن تلاحظ أن معايير لها تدرج اللون رابطا مع مبلغ من التيروزين المضافة ؛ أعلى تركيزات التيروزين أحلك الظهور. يمكنك تلاحظ أيضا تغيير لون ملموس في عينات الاختبار. 2mls يتم تصفيتها من هذه الحلول باستخدام حقنة 0.45 polyethersulfone أم تصفية في cuvettes مناسبة. والآن بعد أن يتم تنفيذ الفحص ، يمكنك الشروع في معمل لتسجيل القيم الامتصاصية لدينا. </li></ol> قياس وحساب امتصاص نشاط انزيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم قياس الامتصاصية للعينات من قبل معمل باستخدام الطول الموجي 660nm. يتم تعيين مسار الضوء ل1cm. سجل القيم الامتصاصية للمعايير وفارغ القياسية ، واختبار عينات مختلفة ، واختبار فارغة. مرة واحدة وقد تم جمع كافة البيانات ، يمكن إنشاء منحنى القياسية. يجب أن تكون محسوبة من أجل توليد المنحنى ، الاختلاف في الامتصاصية بين فارغة القياسية والمعايير. هذه هي القيمة التي تعزى إلى امتصاص كمية التيروزين في الحلول القياسية. بعد هذه العملية الحسابية البسيطة ، وخلق منحنى قياسي باستخدام برنامج الرسوم البيانية لرسم التغير في الامتصاصية من معاييرنا على المحور Y ، مقابل المبلغ المذكور في micromoles لكل من المعايير لدينا 5 على المحور X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> حجم قياسي التيروسين </th><th style="text-align:center"> uMoles التيروسين </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0،055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0،111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0،221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0،442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0،553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد أن تم إدخال نقاط البيانات ، إنشاء خط لأفضل لائقا والمناظرة المعادلة المنحدر. العثور على التغير في الامتصاصية في اختبار العينات عن طريق حساب الفرق بين عينة اختبار الامتصاصية والامتصاصية لاختبار فارغة. وإدراج قيمة الامتصاصية لأحد عينات اختبار في المعادلة المنحدر وحل النتيجة في micromoles المحررة من خلال هذا التفاعل التيروزين بروتين معين. للحصول على نشاط انزيم في وحدة في / مل ، وإجراء العملية الحسابية التالية : (المعادل التيروزين umole أفرج) × (11) وحدة / مل = أنزيم _________________________ (1) × (10) × (2) 11 = الحجم الكلي (في مل) من مقايسة 10 = وقت مقايسة (بالدقائق) وفقا لتعريف وحدة 1 = حجم استخدام انزيم (في مل) من أنزيم 2 = المجلد (في ملليلتر) المستخدمة في تحديد اللونية اتخاذ عدد من مكافئات micromoles التيروزين سراح الحصول عليها من معادلة الانحدار واضربها في الحجم الكلي للمقايسة في ملل ، والذي هو في حالتنا 11mls. تقسيم هذه القيمة من قبل ثلاثة كميات أخرى : الوقت للمقايسة ، والتي ركضنا لمدة 10 دقيقة ، وحجم انزيم المستخدمة في فحص ، الذي كان المتنوعة (دعونا نستخدم 1ml) ، وحجم ملليلتر المستخدمة في الكشف عن اللونية ، والتي قد تختلف استنادا كفيت الخاص. كنا 2 ملل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles من التيروزين مقسوما الوقت في قياس عوائد دقيقة من النشاط البروتيني يسمى &quot;الوحدات الخاصة&quot;. يمكننا أن يلغي وحدة لقياس الحجم في البسط والمقام ، وترك قيس من نشاط انزيم من حيث وحدة / مل. من أجل تحديد نشاط الأنزيم البروتيني في عينة صلبة مخففة في انزيم مخفف ، نقسم نشاطنا في وحدة / مل من تركيز المواد الصلبة المستخدمة في هذا الاختبار في الأصل ملغ / مل. ، وترك لنا مع النشاط من حيث وحدة / ملغ . وحدة / مل انزيم الوحدات / الصلبة ملغ = _____________________ ملغ الصلبة / انزيم مل </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

لقد أظهرنا لكم فقط كيفية تحليل نشاط الأنزيم البروتيني باستخدام سيغما نشاط الأنزيم البروتيني مقايسة عالمية. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الاختبار هو مفيد للتأكد من أن لدينا البروتياز تحدد بدقة النشاط قبل الحصول عليها عن تجاربك. كما رأيتم ، عند القيام بهذا الإجراء ، فإنه من الأهمية بمكان أن نتذكر أن كلا من الحرارة الكازين والحلول التيروزين ببطء وعدم سلقها. أيضا ، من المهم جدا لإعداد الفراغات المختلفة لكل من المعايير الخاصة بك ولكل عينة الاختبار التي لديك.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin &#38; Ciocalteu&#39;s Phenol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate, Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine, Free Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Profiler Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PP0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Fluorescent Detection Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PF0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز ، وهو ما نقوم به خلال إجراءات مراقبة الجودة لدينا. في هذا الاختبار ، الكازين بمثابة الركيزة. عندما البروتيني نحن اختبار الكازين هضم ، والأحماض الأمينية التيروسين يتحرر جنبا إلى جنب مع غيرها من الأحماض الأمينية وشظايا الببتيد. كاشف فولين وCiocalteus الفينول ، أو في المقام الأول فولين يتفاعل مع التيروزين مجانا لإنتاج حامل اللون الأزرق اللون ، الذي هو قياس الكمي وكقيمة الامتصاصية على معمل. أكثر التيروزين التي يتم تحريرها من الكازين ، وأكثر يتم إنشاء chromophores وأقوى من نشاط الأنزيم البروتيني. تتم مقارنة القيم الامتصاصية التي تم إنشاؤها بواسطة نشاط الأنزيم البروتيني إلى منحنى القياسية ، التي تم إنشاؤها بواسطة تفاعل كميات معروفة من التيروزين مع كاشف FC لربط التغيرات في الامتصاصية مع مبلغ من التيروزين في micromoles. ويمكن من المنحنى القياسي يحدد نشاط الأنزيم البروتيني عينات من حيث الوحدات ، وهو المبلغ الذي micromoles في المعادلة التيروزين أفرج عنه من الكازين في الدقيقة الواحدة. لعرض هذه المادة باللغة الصينية ، <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">انقر هنا</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

البروتياز كسر سندات ببتيد. في المختبر ، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لقياس و / أو مقارنة نشاط البروتياز. ويمكن استخدام سيجما نشاط الأنزيم البروتيني غير محددة مقايسة وإجراءات موحدة لتحديد نشاط البروتياز.

سيجما للنشاط غير محددة البروتياز الفحص -- باعتباره الركيزة الكازين

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

التنميط الجيني السريع من الأنسجة باستخدام الماوس سيغما استخراج - N - PCR الأمبير الأنسجة كيت

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

استخدام أدوات الكشف البروتياز نيون تحديد نشاط الأنزيم البروتيني

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

تشكيل الأنبوبة Matrigel القائم على الفحص لتقييم نشاط الخلايا السرطانية مكون للأوعية

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

مهام سير العمل صفها البروتيني وحمض حفز توظيف-<sup&gt; 18</sup&gt; O-المخصب المياه

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

الماوس جزيرة من العزلة انجرهانز باستخدام مزيج من كولاجيناز تنقية والبروتياز متعادلة

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

تحديد غشاء طوبولوجيا البروتين عن طريق الإسفار البروتياز الحماية (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

تحديد أزواج كيناز الركيزة عن طريق فحص إنتاجية عالية


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

في المختبر الفحص لقياس فسفاتيديل إيثانولامين ناقلة ميثيل آخر

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...