Name: sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate
Uploaded: 2008-09-17T09:14:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

לפני תחילת assay, אנחנו צריכים לוודא כי ריאגנטים הבאים מוכנים כראוי: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוספט 50 מ&quot;מ הצפת אשלגן, pH 7.5. הכן באמצעות 11.4 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​phospate dibasic אשלגן, הידראט של מים מטוהרים והתאמת pH עם 1M HCl. פתרון זה ממוקם ב 37 מעלות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.65% משקל / נפח פתרון קזאין, שהוכן על ידי ערבוב של 6.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של קזאין ב חיץ 50 mM אשלגן זרחתי. בהדרגה הגדילו את הטמפרטורה פתרון עם ערבוב עדין 80-85 מעלות צלזיוס למשך כ -10 דקות עד פיזור אחיד מושגת. חשוב מאוד לא להרתיח את הפתרון. PH הוא מותאם אז אם יש צורך עם NaOH ו HCl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 110 חומצה Trichloroacetic פתרון מ&quot;מ, שהוכן על ידי דילול המניות 1:55 6.1N עם מים מטוהרים. חומצה Trichloroacetic היא חומצה חזקה יש לנהוג בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.5 mM Folin &amp;, או מגיב Ciolcaltea של פנול של Folin, המהווה את הפתרון יגיב עם טירוזין לחולל שינוי צבע למדידה יהיה קשור ישירות לפעילות של פרוטאזות. מגיב פנול של Folin היא חומצה וצריך לטפל בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתרן 500 mM פתרון קרבונט, שהוכן באמצעות 53 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​של סודיום קרבונט anyhydrous של מים מטוהרים. פתרון diluent האנזים, אשר מורכב של 10 הצפת נתרן אצטט מ&quot;מ עם Acetate סידן 5mm, pH 7.5, בשעה 37 ° C. פתרון זה מה שאנו משתמשים בו כדי להמיס דגימות פרוטאז מוצק או לדלל פתרונות האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המניה 1.1 mM L-tyrosine תקן פתרון. הוכן באמצעות 0.2 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​L-tyrosine ב מטוהרים מים מחוממים בעדינות עד טירוזין נמס. כמו קזאין, אינם להרתיח את הפתרון הזה. אפשר תקן L-tyrosine כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. פתרון זה יהיה מדולל יותר כדי להפוך עקומת הרגילה שלנו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פרוטאז פתרון. מיד לפני השימוש, לפזר פרוטאז בפתרון diluent אנזים מוכן בשלב 6. </li></ol> במידת הצורך, להשתמש במדגם פרוטאז מוצק של פעילות קבועה מראש, אשר מומס באמצעות diluent האנזים 0.1-0.2 יחידות / מ&quot;ל. פתרון זה משמש כביקורת חיובית assay בקרת איכות כמו אימות עבור החישובים נבצע לקביעת פעילות האנזים. הגדרת Assay פרוטאז ועקומות רגילה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להתחיל את זה assay, למצוא בקבוקוני מתאים אשר יחזיקו כ - 15 MLS. במשך כל אנזים זה תיבחן, 4 צלוחיות נדרשים. בקבוקון אחד ישמש ריק, ושלושה אחרים ישמשו לפעילות assay של שלושה דילולים של פרוטאז. שלושה דילולים שימושיים בעת בדיקת חישובים הסופית אחד נגד השני. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר כל אחד של ארבעה בקבוקונים, להוסיף 5mls של הפתרון שלנו 0.65% קזאין. תנו להם לאזן באמבט המים 37 מעלות צלזיוס למשך כ -5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף שונות כרכים של פתרון אנזים ייבדקו שלוש צלוחיות של מדגם הבדיקה, אך לא ריקה. מערבבים על ידי מתערבלים דגירה של 37 מעלות בדיוק עשר דקות. פעילות הפרוטאז והשחרור תוצאתי של טירוזין במהלך תקופה זו הדגירה היא מה יהיה נמדד בהשוואה בין דגימות הבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה זה 10 דקות, מוסיפים את 5 ה-MLS של מגיב TCA על צינור אחד כדי לעצור את התגובה. לאחר מכן, להוסיף נפח מתאים של תמיסת האנזים צינור אחד, אפילו ריק, כך נפח הסופי של פתרון האנזים במבחנה כל 1 מ&quot;ל. הדבר נעשה על חשבון הערך ספיגת של האנזים עצמו כדי להבטיח את הנפח הסופי במבחנה כל שווה. דגירה הפתרונות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. במהלך הדגירה זה 30 דקות, ייתכן שתרצה להגדיר דילולים תקן טירוזין שלך. השתמש ב-DRAM 6 צלוחיות (צלוחיות DRAM ניתן להחליף עם צינורות פוליפרופילן) אשר יכול בקלות להחזיק 8 MLS. כדי שש צלוחיות, להוסיף את הפתרונות 1.1 mM טירוזין מניות רגיל עם הכרכים הבאים MLS: 0.05, 0.10, 0.20, 0.40, 0.50. אין להוסיף שום תקן טירוזין על ריק. סטנדרטים התחתון עשוי להיות נחוץ עבור דגימות מבחן טמא שיניבו שינוי צבע קטנה. לאחר פתרון סטנדרטי טירוזין נוספה, להוסיף נפח מתאים של מים מטוהרים לכל הסטנדרטים להביא את נפח 2-MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה של 30 דקות, לסנן כל הפתרונות מבחן ריק באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק הסינון. סינון נדרשת להסיר כל insolubles מן הדגימות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את הסינון 2 MLS של דגימות בדיקה תסנין ריק 4 צלוחיות DRAM שיכול להכיל לפחות 8 MLS. אותו סוג של הבקבוקון שבו הסטנדרטים היו מוכנים ניתן להשתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל בקבוקונים המכילים את הסטנדרטים ריק רגיל, להוסיף 5mls של סודיום קרבונט. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, מוסיפים 1 מ&quot;ל של ריאגנט של Folin מייד לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט להסדיר כל טיפה pH נוצר על ידי תוספת של מגיב של Folin. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סודיום קרבונט על דגימות הבדיקה TESריק לא. פתרונות אלה הופכים מעונן לאחר תוספת של סודיום קרבונט. הוספת ריאגנט של Folin, אשר יגיב בעיקר עם טירוזין חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את בקבוקוני ה-DRAM ידי מתערבלים לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. </li></ol> לאחר דגירה זה, אתה צריך לשים לב שהסטנדרטים יש הדרגתיות של צבע correlating עם כמות של טירוזין הוסיף, הריכוזים הגבוהים ביותר של טירוזין המופיעים האפלים ביותר. ניתן גם לשים לב לשינוי צבע ניכר דגימות הבדיקה שלנו. 2mls של פתרונות אלה מסוננים באמצעות 0.45 אממ polyethersulfone מזרק לתוך cuvettes מסנן מתאים. כעת, assay מתבצע, אתה יכול להמשיך ספקטרופוטומטר כדי להקליט ספיגת הערכים שלנו. </li></ol> מדידת ספיגת ואת חישוב פעילות האנזים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספיגת של דגימות נמדד על ידי ספקטרופוטומטר באמצעות אורך גל של 660nm. נתיב האור מוגדר 1cm. הקלט את ספיגת ערכים של תקנים, תקן ריק, דגימות מבחן אחר, מבחן ריק. לאחר שכל הנתונים נאספו, עקומת סטנדרט ניתן ליצור. על מנת ליצור את עקומת, ההבדל בין ספיגת ריק תקן תקן חייב להיות מחושב. זהו ערך ספיגת לייחס סכום של טירוזין של פתרונות סטנדרטיים. לאחר החישוב הפשוט הזה, ליצור את עקומת סטנדרט באמצעות תוכנית גרפים לעלילה שינוי ספיגת הסטנדרטים שלנו על ציר Y, ​​לעומת הסכום micromoles עבור כל הסטנדרטים שלנו 5 על ציר ה-X. <table style="width: 416px; height: 118px;;text-align:right;direction:rtl" border="0"><tbody><tr><th style="text-align:center"> נפח תקן טירוזין </th><th style="text-align:center"> uMoles טירוזין </th></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.05 </td><td style="text-align:center"> 0.055 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.10 </td><td style="text-align:center"> 0.111 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.20 </td><td style="text-align:center"> 0.221 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.40 </td><td style="text-align:center"> 0.442 </td></tr><tr><td style="text-align:center"> 0.50 </td><td style="text-align:center"> 0.553 </td></tr></tbody></table></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי נקודות הנתונים הוזנו, ליצור קו בכושר הטוב ביותר ואת המשוואה מדרון המקביל. מצא את השינוי ספיגת בדגימות בדיקה על ידי חישוב ההפרש בין ספיגת במבחן מדגם ואת ספיגת ריק הבדיקה. הכנסת ערך ספיגת אחד של דגימות בדיקה למשוואה מדרון ופתרון תגרום micromoles של שחרור טירוזין במהלך התגובה הזאת proteolytic בפרט. כדי לקבל את הפעילות של האנזים יחידות מ&quot;ל /, לבצע את החישוב הבא: (ושווי טירוזין umole שוחרר) x (11) יחידות / מ&quot;ל אנזים = __________________________________________ (1) x (10) x (2) 11 = סה&quot;כ נפח (ב מיליליטר) של assay 10 = שעה של assay (בדקות) לפי ההגדרה היחידה 1 = נפח האנזים (ב מיליליטר) של האנזים המשמש Volume 2 = (ב מיליליטר) המשמשים קביעת Colorimetric קח את מספר ושווי micromoles טירוזין שוחרר המתקבל המשוואה המדרון הכפל אותו ב מהנפח הכולל של assay ב-MLS, שבמקרה שלנו הוא 11mls. מחלקים ערך זה על ידי שלושה כמויות אחרות: הזמן של assay, אשר רצנו 10 דקות, נפח של אנזים המשמש assay, שהיה מגוונות (בואו להשתמש 1ml), נפח מ&quot;ל המשמש לגילוי colorimetric, אשר עשוי שונים המבוססים על קובט שלך. השתמשנו 2 MLS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Micromoles של טירוזין מחולק זמן מדידת התשואות דקות של פעילות הפרוטאז שנקרא &quot;יחידות&quot;. אנחנו יכולים לבטל את יחידות למדידת נפח במונה וגם במכנה, משאיר מדידה של פעילות האנזים במונחים של יחידות / מ&quot;ל. על מנת לקבוע את הפעילות מדגם פרוטאז מוצק מדולל diluent האנזים, אנו מחלקים את הפעילות שלנו ביחידות / ml ידי ריכוז מוצק המשמש assay זה במקור מ&quot;ג / מ&quot;ל. והותיר אותנו עם פעילות במונחים של יחידות / מ&quot;ג . יחידות / מ&quot;ל אנזים יחידות / מוצק מ&quot;ג = _____________________ מ&quot;ג מוצק / מ&quot;ל אנזים </li></ol>

<ol>
	<li>Anson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Gen. Physiol. 22, 79-89 (1938).</li><li>Folin, O., Ciocalteau, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> J. Biol. Chem. 73, 627 (1929).</li></ol>

הוכחנו רק אותך איך לנתח פעילות הפרוטאז באמצעות פעילות assay אוניברסלי של סיגמא פרוטאז. בנוסף, assay זו שימושית כדי להבטיח פרוטאזות שלנו קבעו דווקא פעילות לפני שתקבל אותם עבור הניסויים שלך. כפי שראיתם, בעת ביצוע הליך זה, זה בעל חשיבות עליונה לזכור חום הן קזאין ופתרונות טירוזין לאט, לא להרתיח אותם. כמו כן, זה קריטי כדי להכין את החסר שונה עבור שני תקני שלך למדגם כל מבחן שיש לך.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Protease</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P4630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Phosphate, Dibasic, Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C7078</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trichloroacetic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T0699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Folin &#38; Ciocalteu&#39;s Phenol Reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Carbonate, Anhydrous</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Acetate, Trihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Acetate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Tyrosine, Free Base</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3754</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Profiler Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PP0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Fluorescent Detection Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>PF0100</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sigma's non-specific protease activity assay - casein as a substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות, וזה מה שאנחנו עושים במהלך הליכי בקרת האיכות שלנו. ב assay זו, קזאין משמש מצע. כאשר אנו בודקים פרוטאז מעכל קזאין, טירוזין חומצה אמינית משוחרר יחד עם חומצות אמינו אחרות ושברי פפטיד. מגיב Folin ו Ciocalteus פנול, או של Folin בעיקר מגיב עם טירוזין חינם לייצר chromophore בצבע כחול, אשר לכימות ומדד כערך ספיגת על ספקטרופוטומטר. טירוזין יותר כי הוא שוחרר מבית קזאין, יותר chromophores נוצרים חזקה יותר פעילות של פרוטאז. ספיגת ערכים שנוצר על ידי פעילות של פרוטאז הם לעומת עקומת רגיל, אשר מופק על ידי מגיבים בכמויות ידוע של טירוזין עם מגיב FC לתאם שינויים ספיגת עם כמות של טירוזין ב micromoles. מתוך עקומת סטנדרט הפעילות של דגימות פרוטאז ניתן לקבוע במונחים של יחידות, המהווה את הסכום micromoles ושווי טירוזין שוחרר מבית קזאין לדקה. כדי להציג את המאמר הזה בסינית, <a href="http://jove.com/index/details.stp?ID=910">לחץ כאן</a>

Watch this Scientific Journal Video about Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate at JoVE.com

Sigma's Non-specific Protease Activity Assay - Casein as a Substrate

פרוטאזות לשבור אג&quot;ח הפפטיד. במעבדה, היא לעתים קרובות צורך למדוד ו / או להשוות את הפעילות של פרוטאזות. הלא ספציפית של סיגמא פעילות assay פרוטאז יכולים לשמש בהליך סטנדרטי כדי לקבוע את הפעילות של פרוטאזות.

סיגמא של Non-ספציפיים פעילות Assay פרוטאז - קזאין כמו מצע

Proteases break peptide bonds. In the lab, it is often necessary to measure and/or compare the activity of proteases.  Sigma's non-specific protease ...

<a class="grey_button" href="/video/910">
ChineseVersion
</a>

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Organic Chemistry

Biology

Unit 1

Alcohols and Phenols

SCIENTISTS IN ACTION

Rapid Genotyping of Mouse Tissue Using Sigma's Extract-N-Amp Tissue PCR Kit

Genotyping מהיר של רקמות באמצעות עכבר חלץ-N-Amp רקמות סיגמא של ערכת ה-PCR

Genomic detection of DNA via PCR amplification and detection on an electrophoretic gel is a standard way that the genotype of a tissue sample is ...

Use of the Protease Fluorescent Detection Kit to Determine Protease Activity

שימוש בערכת איתור פלורסנט פרוטאז לקבוע פעילות פרוטאז

The Protease Fluorescent Detection Kit provides ready-to-use reagents for detecting the presence of protease activity. This simple assay to detect ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

Assay למדידת פעילות Escherichia coli ועין מתנהלת ליזין Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

A Matrigel-Based Tube Formation Assay to Assess the Vasculogenic Activity of Tumor Cells

Matrigel מבוסס גיבוש Tube Assay להעריך את פעילות Vasculogenic של תאים סרטניים

Over the past several decades, a tube formation assay using growth factor-reduced Matrigel has been typically employed to demonstrate the angiogenic ...

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

Protease- and Acid-catalyzed Labeling Workflows Employing 18O-enriched Water

פרוטאז וחומצת קטליזאטור זרימות עבודת תיוג המעסיק<sup&gt; 18</supמים&gt; O-מועשר

Stable isotopes are essential tools in biological mass spectrometry. Historically, 18O-stable isotopes have been extensively used to study the catalytic ...

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

העכבר איילט בידוד נגרהנס באמצעות שילוב של collagenase המטוהר ופרוטאז הניטראלי

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection (FPP)

Determining Membrane Protein Topology Using Fluorescence Protease Protection FPP

קביעת טופולוגיה חלבון ממברנה באמצעות הקרינה הגנת פרוטאז (FPP)

The correct topology and orientation of integral membrane proteins are essential for their proper function, yet such information has not been established ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

זיהוי של זוגות קינאז-מצע שימוש הקרנת תפוקה גבוהה


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

In Vitro Assay to Measure Phosphatidylethanolamine Methyltransferase Activity

במבחנה Assay למדוד Phosphatidylethanolamine Methyltransferase פעילות

Phosphatidylethanolamine methyltransferases are biosynthetic enzymes that catalyze the transfer of one or more methyl group(s) from ...