Name: selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

<p> Wij danken Professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer en Sigurd Krieger aan het Instituut voor Klinische Pathologie van de Universiteit van Wenen, Oostenrijk voor hun samenwerking. </p>

<p class="jove_title"> Celcultuur </p><ol><li> Groei Chinese hamster ovarium cellen (CHO-K1) met behulp van standaard celkweek procedures in F-12 Ham medium met Glutamax ik ​​dat 10% foetaal kalf serum, 50 U / ml penicilline, en 50 ug / ml streptomycine sulfaat (Invitrogen). </li><li> Exchange het kweekmedium aan serum-vrije media. Label de cel oppervlakte-eiwitten werden op verschillende tijdstippen met CyDye DIGE Fluor Cy3 of Cy5 minimale kleurstoffen (zie rubriek <em>celoppervlak Labeling,</em> hieronder). </li><li> Pool gelijke aantalle...

<ol>
	<li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+the+cell+surface+proteome.">Profiling of the cell surface proteome.</a> <em style='font-style: italic'>Proteomics</em>. <b>3</b>, 1947-1954 (2003).</li><li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function.">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> <em style='font-style: italic'>J Biol Chem</em>. <b>9</b>, 7607-7616 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ettan+DIGE+System+User+Manual.">Ettan DIGE System User Manual.</a> <em style='font-style: italic'>GE Healthcare user manual 18-1164-40</em>. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA.">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients,+principles+and+methods.">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> <em style='font-style: italic'>GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB</em>. , (2002).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB.">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li><li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo.">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proteomics</em>. <b>2</b>, 579-5785 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB.">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li></ol>

<p class="jove_title"> Eiwitconcentratie </p><p class="jove_content"> Een overzicht van de twee etikettering workflows is weergegeven in figuur 1. Omdat de cellen zijn nog steeds intact wanneer geëtiketteerd volgens de cel-oppervlakte-eiwit labeling-protocol, worden alleen de cel oppervlakte-eiwitten worden blootgesteld aan de kleurstof. In de standaard Ettan DIGE protocol, worden de cellen gelyseerd voor de etikettering en de eiwitten zowel binnen als buiten de cel zijn gelabeld (Fig 1). De relatieve hoeveelheid kleurstof aan eiwit in de cel-...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9345-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Quant Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6484-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPG Buffer pH 3-11NL</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Heallthcare</td>
<td>17-6004-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-65</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox kit</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-92</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeStreak Rehydration solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip Cover Fluid</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1335-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor 3 IEF Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>11-0033-64</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor Manifold</td>
<td>Instrument component</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6498-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Gel Caster </td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6467-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6466-46</td>
<td>230 V unit: 80-6466-27</td>
</tr>
<tr>
<td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>63-0055-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spot Picker</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1145-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Digester</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-68</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spotter</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan MALDI-TOF</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeCyder 2-D Differential Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-4012-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageQuant Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9236-62</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1319-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CHAPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1314-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Dithiothreitol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1318-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol Blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1329-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1321-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecylsulfate (SDS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1313-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycerol 87%</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1310-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne TEMED</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1312-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Ammonium Persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1311-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycine </td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1323-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Sample Prep for membrane proteins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce</td>
<td>89864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin sulphate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes

<p class="jove_content">Oppervlakte-eiwitten staan ​​centraal in het vermogen van de cel om te reageren op zijn omgeving en de interactie met naburige cellen. Ze staan ​​bekend als inductoren van bijna alle intracellulaire signalering. Bovendien spelen ze een belangrijke rol in het milieu aanpassing en behandeling met geneesmiddelen, en zijn vaak betrokken zijn bij de ziekte pathogenese en pathologie (1). Eiwit-eiwit interacties zijn intrinsiek aan signaalwegen, en om meer inzicht te krijgen in deze complexe biologische processen, zijn gevoelige en betrouwbare methoden nodig voor het bestuderen van cel-oppervlakte-eiwitten. Twee-dimensionale (2-D) electroforese wordt op grote schaal gebruikt voor de detectie van biomarkers en andere doelen in complexe eiwit monsters differentiële veranderingen te bestuderen. Cel oppervlakte-eiwitten, mede door hun lage abundantie (1 2% van cellulaire eiwitten), zijn moeilijk te detecteren in een 2-D gel zonder fractionering of een andere vorm van verrijking. Ze zijn ook vaak slecht vertegenwoordigd in 2-D gels vanwege hun hydrofobe karakter en een hoog moleculair gewicht (2). In deze studie presenteren we een nieuw protocol voor het intacte cellen met behulp van CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen voor specifieke etikettering en de opsporing van deze belangrijke groep van eiwitten. De resultaten toonden aan specifieke etikettering van een groot aantal cel-oppervlakte-eiwitten met een minimale etikettering van intracellulaire eiwitten. Dit protocol is een snelle, eenvoudig te gebruiken, en alle drie CyDye DIGE Fluor minimale kleurstoffen (Cy 2, 3 en Cy Cy 5) kan worden gebruikt om cel-oppervlakte-eiwitten label. Deze functies zorgen voor multiplexing het gebruik van de 2-D fluorescentie Verschil gelelektroforese (2-D DIGE) met Ettan DIGE techniek en de analyse van eiwit-expressie veranderingen met behulp van DeCyder 2-D Differentiële analyse software. Het niveau van de cel-oppervlakte-eiwitten werd gevolgd tijdens het serum uithongering van de CHO-cellen voor verschillende lengtes van de tijd (zie tabel 1). Kleine veranderingen in overvloed werden gedetecteerd met hoge nauwkeurigheid, en de resultaten worden ondersteund door omschreven statistische methoden.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

<p class="jove_content">Een eenvoudige en specifieke methode werd aangetoond voor tl-etikettering en de verbeterde detectie van cel-oppervlakte-eiwitten zonder fractionering stap. Differentiële overvloed in cel oppervlakte-eiwitten werd geanalyseerd met behulp van twee-dimensionale (2-D) elektroforese en Ettan ™ DIGE technologie.</p>

Selectieve Etikettering van Cell-oppervlakte-eiwitten met behulp van CyDye DIGE Fluor Minimal Kleurstoffen

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

Optische opnemen van elektrische activiteit in Guinee-pig Enteric Netwerken met behulp van voltage-gevoelige kleurstoffen

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditeit op basis van extracellulaire Interactie Screening (AVEXIS) voor de Scalable detectie van lage-affiniteit extracellulaire receptor-ligand interacties

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Geoptimaliseerd kleuring en proliferatie Modeling Methoden voor de celdeling Monitoring met behulp van Cell Tracking Kleurstoffen

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selectieve vangen van 5-hydroxymethylcytosine van genomisch DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Verrijking en zuivering van menselijke embryonale stamcellen door detectie van celoppervlakantigenen met behulp van de monoklonale antilichamen TG30 en GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glycopeptide Capture voor celoppervlak Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Meting van de extracellulaire Ion Flux gebruik van de Ion-selectieve Zelf referencing micro-elektrode Techniek

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Synthese van golflengteverschuivende DNA hybridisatie sondes met behulp Fotostabiele Cyanine Dyes

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Bepaling van de Relatieve celoppervlak en Total Expressie van recombinant Ion kanalen met flowcytometrie

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Het analyseren van de celoppervlakadhesie remodeling in reactie op mechanische spanning met behulp van Magnetic Beads

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...