Name: selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

<p> Nous remercions le Professeur Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer et Sigurd Krieger à l&#39;Institut de pathologie clinique, Université de Vienne, en Autriche, pour leur collaboration. </p>

<p class="jove_title"> La culture cellulaire </p><ol><li> Cultivez ovariennes de hamster chinois (CHO-K1) en utilisant les procédures standard de culture de cellules dans un milieu de Ham F-12 avec glutamax I contenant 10% sérum de veau foetal, 50 U / ml de pénicilline, et 50 ug / ml de sulfate de streptomycine (Invitrogen). </li><li> Bourse du milieu de culture pour un milieu sans sérum. Marquer les protéines de surface de la cellule ont été à des moments différents avec CyDye DIGE Fluor Cy3 ou Cy5 colorants minime (voir la section <e...

<ol>
	<li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+the+cell+surface+proteome.">Profiling of the cell surface proteome.</a> <em style='font-style: italic'>Proteomics</em>. <b>3</b>, 1947-1954 (2003).</li><li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function.">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> <em style='font-style: italic'>J Biol Chem</em>. <b>9</b>, 7607-7616 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ettan+DIGE+System+User+Manual.">Ettan DIGE System User Manual.</a> <em style='font-style: italic'>GE Healthcare user manual 18-1164-40</em>. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA.">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients,+principles+and+methods.">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> <em style='font-style: italic'>GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB</em>. , (2002).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB.">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li><li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo.">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proteomics</em>. <b>2</b>, 579-5785 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB.">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li></ol>

<p class="jove_title"> La concentration en protéines </p><p class="jove_content"> Un aperçu des deux flux d&#39;étiquetage est montré dans la figure 1. Puisque les cellules sont encore intactes lorsque étiquetés selon le protocole de surface cellulaire de protéines étiquetage, seules les protéines de surface cellulaire sont exposés à la teinture. Dans le protocole standard Ettan DIGE, les cellules sont lysées avant l&#39;étiquetage et les protéines à l&#39;intérieur comme à l&#39;extérieur de la cellule sont étiquetés (Fig 1...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9345-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Quant Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6484-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPG Buffer pH 3-11NL</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Heallthcare</td>
<td>17-6004-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-65</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox kit</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-92</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeStreak Rehydration solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip Cover Fluid</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1335-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor 3 IEF Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>11-0033-64</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor Manifold</td>
<td>Instrument component</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6498-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Gel Caster </td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6467-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6466-46</td>
<td>230 V unit: 80-6466-27</td>
</tr>
<tr>
<td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>63-0055-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spot Picker</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1145-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Digester</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-68</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spotter</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan MALDI-TOF</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeCyder 2-D Differential Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-4012-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageQuant Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9236-62</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1319-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CHAPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1314-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Dithiothreitol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1318-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol Blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1329-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1321-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecylsulfate (SDS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1313-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycerol 87%</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1310-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne TEMED</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1312-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Ammonium Persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1311-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycine </td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1323-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Sample Prep for membrane proteins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce</td>
<td>89864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin sulphate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes

<p class="jove_content">Protéines de surface sont au cœur de la capacité des cellules à réagir à son environnement et d&#39;interagir avec les cellules voisines. Ils sont connus pour être des inducteurs de la quasi-totalité de signalisation intracellulaire. De plus, ils jouent un rôle important dans l&#39;adaptation de l&#39;environnement et le traitement médicamenteux, et sont souvent impliqués dans la pathogenèse de la maladie et de la pathologie (1). Interactions protéine-protéine sont intrinsèques à des voies de signalisation, et de gagner plus de perspicacité dans ces processus biologiques complexes, des méthodes sensibles et fiables sont nécessaires pour étudier les protéines de surface cellulaire. Deux dimensions (2-D) électrophorèse est largement utilisé pour la détection de biomarqueurs et d&#39;autres cibles dans les échantillons de protéines complexes pour étudier l&#39;évolution différentielle. Protéines de surface cellulaire, en partie en raison de leur faible abondance (1 à 2% des protéines cellulaires), sont difficiles à détecter dans un gel 2-D sans fractionnement ou un autre type d&#39;enrichissement. Ils sont aussi souvent mal représentés dans les gels 2-D en raison de leur caractère hydrophobe et de haut poids moléculaire (2). Dans cette étude, nous présentons un nouveau protocole pour les cellules intactes en utilisant des teintures CyDye DIGE Fluor minimale pour un étiquetage spécifique et la détection de cet important groupe de protéines. Les résultats ont montré un étiquetage spécifique d&#39;un grand nombre de protéines de surface cellulaire avec un étiquetage minimum de protéines intracellulaires. Ce protocole est rapide, simple à utiliser, et tous les trois colorants CyDye DIGE Fluor minimes (Cy 2, 3 et Cy Cy 5) peut être utilisé pour étiqueter protéines de surface cellulaire. Ces caractéristiques permettent de multiplexage en utilisant le 2-D électrophorèse de gel de fluorescence Différence (2-D DIGE) avec Ettan DIGE technologie et l&#39;analyse des changements d&#39;expression de protéines en utilisant DeCyder 2-D Logiciel d&#39;analyse différentielle. Le niveau de protéines de surface cellulaire a été suivi pendant la famine de sérum de cellules CHO pour des durées différentes (voir tableau 1). De petits changements dans l&#39;abondance ont été détectés avec une grande précision, et les résultats sont pris en charge par des méthodes statistiques définies.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

<p class="jove_content">Une méthode simple et spécifique a été démontrée pour le marquage fluorescent et une meilleure détection des protéines de surface cellulaire sans une étape de fractionnement. L&#39;abondance différentielle des protéines de surface cellulaire a été analysée par électrophorèse bidimensionnelle (2-D) et Ettan ™ technologie DIGE.</p>

Étiquetage sélective des protéines de surface cellulaire utilisant CyDye DIGE Fluor Colorants Minimal

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

Enregistrement optique de l&#39;activité électrique en Guinée-cochon Réseaux entérique en utilisant la tension colorants sensibles

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Recherche

Biologie

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

L&#39;avidité d&#39;un dépistage interaction extracellulaire (AVEXIS) pour la détection évolutive de faible affinité extracellulaires interactions récepteur-ligand

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimisé méthodes de modélisation de coloration et de prolifération pour la surveillance division cellulaire en utilisant des colorants Suivi cellulaires

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Capture d&#39;sélectif de 5-hydroxyméthylcytosine partir de l&#39;ADN génomique

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Enrichissement et purge de cellules souches embryonnaires humaines par détection d’antigènes de surface cellulaire à l’aide des anticorps monoclonaux TG30 et GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glycopeptides Capture pour protéomique de surface cellulaire

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Mesure de extracellulaire Ion flux Utilisation de l&#39;Ion sélectif microélectrodes Technique d&#39;auto-référencement

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Synthèse de la longueur d&#39;onde de décalage d&#39;ADN à l&#39;aide de sondes d&#39;hybridation cyanine photostable

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Détermination de la surface de la cellule relative et d&#39;expression totale de Recombinant Canaux ioniques par cytométrie en flux

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analyse de surface cellulaire Adhérence remodelage en réponse à la tension mécanique utilisant des billes magnétiques

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...