Name: selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes
Uploaded: 2008-11-26T00:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

<p> Vi tackar professor Dontscho Kerjaschki, Corina Mayrhofer och Sigurd Krieger vid institutionen för klinisk patologi, universitetet i Wien, Österrike för deras samarbete. </p>

<p class="jove_title"> Cellodling </p><ol><li> Väx kinesiska hamsteräggceller (CHO-K1) med hjälp av standardprocedurer cellodling i F-12 Skinka medium med GlutaMAX jag innehållande 10% fetalt kalvserum, 50 U / ml penicillin, och 50 mikrogram / ml streptomycin sulfat (Invitrogen). </li><li> Börsen odlingsmediet till serum-fria medier. Märk cellytan proteiner var vid olika tidpunkter med CyDye Dige Fluor Cy3 eller Cy5 minimala färgämnen (se avsnitt <em>märkning cellytan,</em> nedan). </li><li> Pool lika många celler från varje tidpunkt...

<ol>
	<li>Jang, J. H., Hanash, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Profiling+of+the+cell+surface+proteome.">Profiling of the cell surface proteome.</a> <em style='font-style: italic'>Proteomics</em>. <b>3</b>, 1947-1954 (2003).</li><li>Shin, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+profiling+of+the+cell+surface+proteome+of+cancer+cells+uncovers+an+abundance+of+proteins+with+chaperone+function.">Global profiling of the cell surface proteome of cancer cells uncovers an abundance of proteins with chaperone function.</a> <em style='font-style: italic'>J Biol Chem</em>. <b>9</b>, 7607-7616 (2003).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ettan+DIGE+System+User+Manual.">Ettan DIGE System User Manual.</a> <em style='font-style: italic'>GE Healthcare user manual 18-1164-40</em>. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DeCyder+2-D+Differential+Analysis+Software+v+6.0.+GE+Healthcare+data+file+11-0011-98+Edition+AA.">DeCyder 2-D Differential Analysis Software v 6.0. GE Healthcare data file 11-0011-98 Edition AA.</a> , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2-D+Electrophoresis+using+immobilized+pH+gradients,+principles+and+methods.">2-D Electrophoresis using immobilized pH gradients, principles and methods.</a> <em style='font-style: italic'>GE Healthcare handbook 80-6429-60 Edition AB</em>. , (2002).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CyDye+DIGE+fluors+and+labeling+kits.+GE+Healthcare+data+file+18-1164-84+Edition+AB.">CyDye DIGE fluors and labeling kits. GE Healthcare data file 18-1164-84 Edition AB.</a> , (2003).</li><li>Mayrhofer, C., Krieger, S., Allmaier, G., Kerjaschki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DIGE+compatible+labeling+of+surface+proteins+on+vital+cells+in+vitro+and+in+vivo.">DIGE compatible labeling of surface proteins on vital cells in vitro and in vivo.</a> <em style='font-style: italic'>Proteomics</em>. <b>2</b>, 579-5785 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+labeling+of+cell-surface+proteins+using+CyDye+DIGE+Fluor+minimal+dyes.+GE+Healthcare+Application+Note+11-0033-92+Edition+AB.">Selective labeling of cell-surface proteins using CyDye DIGE Fluor minimal dyes. GE Healthcare Application Note 11-0033-92 Edition AB.</a> , (2005).</li></ol>

<p class="jove_title"> Proteinkoncentration </p><p class="jove_content"> En översikt av de två märkning arbetsflöden visas i figur 1. Eftersom cellerna är fortfarande intakt när märkas enligt cellytan protein märkning protokoll, bara cellytan proteiner som utsätts för färgen. I standard Ettan Dige protokollet, de celler lyseras före märkning och proteiner såväl inom som utanför cellen är märkta (Fig. 1). Den relativa mängden färgämne till protein i cellen-ytprotein märkning-protokollet är inte känt, eftersom proteiner p?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>CyDye DIGE Kit, 2 nmol</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9345-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Quant Kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6484-51</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPG Buffer pH 3-11NL</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Heallthcare</td>
<td>17-6004-40</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip pH 3-11NL, 24 cm</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-77</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-65</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>IPGbox kit</td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9334-92</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeStreak Rehydration solution</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-6003-19</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Immobiline DryStrip Cover Fluid</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1335-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor 3 IEF Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>11-0033-64</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan IPGphor Manifold</td>
<td>Instrument component</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6498-38</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Gel Caster </td>
<td>Tool</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6467-22</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan DALTtwelve Separation Unit and Power Supply/Control Unit</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>80-6466-46</td>
<td>230 V unit: 80-6466-27</td>
</tr>
<tr>
<td>Typhoon 9410 Variable Mode Imager</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>63-0055-81</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spot Picker</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1145-28</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Digester</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-68</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan Spotter</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-67</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ettan MALDI-TOF</td>
<td>Instrument</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>18-1142-33</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>DeCyder 2-D Differential Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-4012-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>ImageQuant Analysis Software</td>
<td>Other</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>28-9236-62</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Urea</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1319-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>CHAPS</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1314-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Dithiothreitol (DTT)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1318-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Bromophenol Blue</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1329-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Tris</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1321-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sodium Dodecylsulfate (SDS)</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1313-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycerol 87%</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1325-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne ReadySol IEF 40% T, 3% C</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1310-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne TEMED</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1312-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Ammonium Persulfate</td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1311-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>PlusOne Glycine </td>
<td>Reagent</td>
<td>GE Healthcare</td>
<td>17-1323-01</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>2-D Sample Prep for membrane proteins</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce</td>
<td>89864</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Streptomycin sulphate</td>
<td>Reagent</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15140-122</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

selective labelling of cell-surface proteins using cydye dige fluor minimal dyes

<p class="jove_content">Ytproteiner är centrala för cellens förmåga att reagera på sin omgivning och att samverka med angränsande celler. De är kända för att vara inducerare av nästan alla intracellulär signalering. Dessutom spelar de en viktig roll i miljöanpassning och missbruksbehandling, och deltar ofta i sjukdomens patogenes och patologi (1). Protein-protein interaktioner är inneboende signalvägar, och för att få mer insikt i dessa komplexa biologiska processer, är känsliga och tillförlitliga metoder som behövs för att studera proteiner på cellens yta. Tvådimensionella (2-D) elektrofores används i stor utsträckning för detektion av biomarkörer och andra mål i komplexa protein prover för att studera differentiella förändringar. Cellytan proteiner, delvis på grund av deras låga förekomst (1 2% av cellulära proteiner), är svåra att upptäcka i en 2-D gel utan fraktionering eller någon annan typ av berikning. De är också ofta dåligt representerade i 2-D-geler på grund av sin hydrofoba natur och höga molekylvikten (2). I denna studie presenterar vi ett nytt protokoll för intakta celler med CyDye Dige Fluor minimal färgämnen för särskild märkning och upptäckt av denna viktiga grupp av proteiner. Resultaten visade särskild märkning av ett stort antal proteiner på cellens yta med minimal märkning av intracellulära proteiner. Detta protokoll är snabb, enkel att använda, och alla tre CyDye Dige Fluor minimal färgämnen (Cy 2, Cy 3 och Cy 5) kan användas för att märka proteiner på cellernas ytor. Dessa funktioner möjliggör multiplexing med 2-D Fluorescens Elektrofores Skillnad Gel (2-D Dige) med Ettan Dige teknik och analys av förändringar proteinuttryck med DeCyder 2-D Differential analysprogram. Graden av proteiner på cellernas ytor följdes under serum svält i CHO celler för olika lång tid (se tabell 1). Små förändringar i överflöd upptäcktes med hög noggrannhet, och resultaten stöds av definierade statistiska metoder.</p>

Watch this Scientific Journal Video about Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes at JoVE.com

Selective Labelling of Cell-surface Proteins using CyDye DIGE Fluor Minimal Dyes

<p class="jove_content">En enkel och specifik metod visades för lysrör märkning och förbättrad detektering av proteiner cellens yta utan en fraktionering steg. Differential överflöd i proteiner på cellens yta analyserades med hjälp av tvådimensionella (2-D) elektrofores och Ettan ™ Dige teknik.</p>

Selektiv Märkning av proteiner på cellernas ytor med hjälp av CyDye Dige Fluor Minimal Färgämnen

Surface  proteins are central to the cell's ability to react to its environment and to interact with neighboring cells. They are known to be inducers of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Recording of Electrical Activity in Guinea-pig Enteric Networks using Voltage-sensitive Dyes

Optisk Registrering av elektrisk aktivitet i marsvin Enteric Nätverk som använder spänningskänsliga Färgämnen

The enteric nervous system (ENS) is a self-contained network with identified functions, capable of performing complex behaviors in isolation. Its neurons ...

Avidity-based Extracellular Interaction Screening (AVEXIS) for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Avidity-based Extracellular Interaction Screening AVEXIS for the Scalable Detection of Low-affinity Extracellular Receptor-Ligand Interactions

Aviditet-baserad Extracellulär Interaktion Screening (AVEXIS) för den skalbara Detektion av låg-affinitets extracellulär receptor-ligand-interaktioner

Extracellular protein:protein interactions between secreted or membrane-tethered proteins are critical for both initiating intercellular communication and ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Selective Capture of 5-hydroxymethylcytosine from Genomic DNA

Selektiv fångst av 5-hydroxymethylcytosine från genomisk DNA

5-methylcytosine (5-mC) constitutes ~2-8% of the total cytosines in human genomic DNA and impacts a broad range of biological functions, including gene ...

Enrichment and Purging of Human Embryonic Stem Cells by Detection of Cell Surface Antigens Using the Monoclonal Antibodies TG30 and GCTM-2

Berikning och rening av mänskliga embryonala stamceller genom detektion av cellytans antigener med hjälp av monoklonala antikroppar TG30 och GCTM-2

Human embryonic stem cells (hESC) can self-renew indefinitely in vitro, and with the appropriate cues can be induced to differentiate into potentially all ...

Glycopeptide Capture for Cell Surface Proteomics

Glykopeptider Capture för cellytan Proteomics

Cell surface proteins, including extracellular matrix proteins, participate in all major cellular processes and functions, such as growth, ...

Measurement of Extracellular Ion Fluxes Using the Ion-selective Self-referencing Microelectrode Technique

Mätning av extracellulärt jonflöden Använda Jonselektiv självrefererande mikroelektrod Teknik

Cells from animals, plants and single cells are enclosed by a barrier called the cell membrane that separates the cytoplasm from the outside. Cell layers ...

Synthesis of Wavelength-shifting DNA Hybridization Probes by Using Photostable Cyanine Dyes

Syntes av våglängds skiftande DNA hybridiseringsprober med hjälp fotostabila cyaninfärgämnen

In this protocol, we demonstrate a method for the synthesis of 2&#39;-alkyne modified deoxyribonucleic acid (DNA) strands by automated solid phase ...

Determination of the Relative Cell Surface and Total Expression of Recombinant Ion Channels Using Flow Cytometry

Fastställande av den relativa cellytan och Total Expression av rekombinant jonkanaler med flödescytometri

Inherited or de novo mutations in cation-selective channels may lead to sudden cardiac death. Alteration in the plasma membrane trafficking of these ...

Analyzing Cell Surface Adhesion Remodeling in Response to Mechanical Tension Using Magnetic Beads

Analysera cellytan Adhesion Remodeling som svar på mekaniska spänningar med användning av magnetiska pärlor

Mechanosensitive cell surface adhesion complexes allow cells to sense the mechanical properties of their surroundings. Recent studies have identified both ...