المستضد CD4 + تصور معين باستخدام خلايا T MHC الدرجة الثانية Tetramers

Summary

هذا الإجراء يدل على تنقية والتوسع في المختبر من خلايا CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية من الدم المحيطي كله والتصور وذلك باستخدام MHC tetramers الطبقة الثانية Tetramers تسمح التصور المباشر للخلايا T مع خصوصية واحدة ومحددة مستضد MHC تقييد الدرجة الثانية.

Abstract

معقد التوافق النسيجي الكبير (MHC) من الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لمستضد معين CD4 + الخلايا التائية التي التدفق الخلوي. هذا الأسلوب يعتمد على التفاعل بين الببتيد محددة للغاية ومحملة MHC المقابلة مستقبلات الخلايا تي. في حين أن تقارب من جزيء MHC / الببتيد واحدة منخفضة ، عبر ربط مجمعات MHC / الببتيد مع streptavidin يزيد الطمع من التفاعل ، مما يتيح استخدامها في تلوين الكواشف. بسبب الترددات المنخفضة نسبيا من خلايا CD4 + T (~ 1 في 300000 لخصوصية واحدة) هذا الاختبار يستخدم لتضخيم المختبر في خطوة لزيادة عتبة الخمسين من الكشف. وتنقيته من الخلايا الدموية المحيطية وحيدات النوى التي تقوم عليها Ficoll. ثم يتم فصل خلايا CD4 + عن طريق الانتقاء السلبي باستخدام biotinylated كوكتيل الأجسام المضادة والمعادية للالبيوتين المسمى الخرز المغناطيسي. استخدام خلايا ملتصق من الكسر خلايا CD4 كما مستضد تقديم الخلايا ، CD4 + T يتم توسيع الخلايا في وسائل الإعلام عن طريق إضافة الببتيد مستضدي وايل - 2. هي ملطخة الخلايا موسعة مع tetramer الدرجة الثانية المقابلة التي يحتضنها عند 37 مئوية لمدة ساعة واحدة وملون في وقت لاحق باستخدام الأجسام المضادة السطحية مثل CD4 المضادة ، ومكافحة CD3 ، ومكافحة CD25. بعد وضع العلامات ، ويمكن تحليل الخلايا مباشرة من التدفق الخلوي. الخلايا tetramer شكل إيجابي عادة سكانية متميزة بين CD4 + توسيع الخلايا. خلايا Tetramer ايجابية وعادة ما تكون CD25 + CD4 ، وارتفاع في أغلب الأحيان. لأن مستوى تلطيخ tetramer الخلفية يمكن أن تختلف ، ينبغي دائما أن تكون النتائج ايجابية تلطيخ مقارنة تلطيخ الخلايا نفسها مع tetramer غير ذي صلة. اختلافات متعددة من هذا الاختبار الأساسية ممكنة. ويمكن فرز الخلايا Tetramer إيجابية لمزيد من التحليل المظهري ، أو إدراجها في ELISPOT المقايسات انتشار الأسلحة النووية ، أو فحوصات ثانوية أخرى. وقد أثبتت عدة مجموعات كما شارك في تلطيخ tetramers به ​​وإما لمكافحة خلوى أو أضداد FoxP3.

Protocol

1. الدم الطرفية وحيدة النواة الخلية (PBMC) العزلة

1. الحصول على عينة من الدم -- وينبغي جمع الدم في المحاقن أو أنابيب الدم والمضادة للمتخثر مع الهيبارين (1:50 نسبة) لمنع تخثر الدم. توقع محصول بلغ نحو 1 × 10 ⁶ PBMC لكل مليلتر من الدم -- حوالي 40 ٪ منها ستكون إيجابية CD4 (CD4 +) الخلايا التائية.
2. قسامة الدم في أنابيب مخروطية 50 مل و 25 مل في أنبوب. إذا انفصل الدم ، مزيج بلطف قبل aliquoting لتوزيع البلازما
3. إضافة برنامج تلفزيوني ، ليصل إجمالي حجم إلى 40 مل والأساس الذي تقوم عليه من خلال وضع 11 مل من Ficoll ، إدخالها في أنابيب الدم ، وإزالة بعناية من المعونة الماصة ماصة. سوف ficoll استنزاف ببطء إلى قاع الأنبوب. مرة واحدة في مستوى له هدف التعادل ، وإزالة ببطء ماصة من أنبوب الدم وتجاهل.
4. غطاء أنابيب الدم وتنتقل إلى قنابل Aerosolve. إغلاق اسطوانات وبقوة الطرد المركزي في 900 × ز لمدة 20 دقيقة -- لا الفرامل. فمن الأهمية بمكان أن يتم تطبيق أي الفرامل في نهاية هذا الدوران لأن قوة الكبح ويشوش على طبقة من الخلايا.
5. بعد زيادة ونقصان ، ينبغي أن PBMCs تشكل طبقة متميزة البيضاء بين الأصفر البلازما (أعلاه) وficoll شفاف (أدناه). المقشود برفق طبقة خلايا الدم البيضاء باستخدام ماصة نقل ونقل إلى أنبوب جديد. ويمكن استخلاص بعض البلازما وFicoll حتى مع PBMCs ، ولكن تجنب وضع أي من طبقة الخلايا الحمراء. ويمكن أن تقترن عادة أنابيب الدم اثنين الى واحد في خلية أنبوب هذه الخطوة لزيادة حجم بيليه.
6. إضافة برنامج تلفزيوني ، ليصل إجمالي حجم 50 مل والطرد المركزي في 500 × ز لمدة 15 دقيقة -- منخفضة في اسطوانات الفرامل aerosolve.
7. نضح السائلة باستخدام ماصة باستور ، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه
8. علاج مع العازلة الانحلالي بإضافة 5-6 مل لكل أنبوب ، ومزج برفق لإزالة كتل. احتضان لمدة لا تزيد عن 5 دقائق.
9. إضافة برنامج تلفزيوني ، ليصل إجمالي حجم 50 مل و 230 جهاز طرد مركزي في × ز لمدة 10 دقائق -- الفرامل منخفضة. لم تعد هناك حاجة لهذه اسطوانات Aerosolve يدور أبطأ.
10. تغسل مرتين : نضح السائل باستخدام ماصة باستور ، وملء الأنبوب مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في ز × 230 لمدة 10 دقيقة.
11. قبل الخطوة النهائية غسل ، إزالة قسامة إعادة علقت الخلايا ، تمييع مع الأزرق التريبان ، والعد باستخدام عدادة الكريات. وهذا العدد حجم الخلية تملي كاشف المستخدمة في فصل T خطوة الخلية.

2. CD4 + T ^* فصل الخلايا

1. نضح السوائل العازلة تشغيل وإضافة لجلب إجمالي حجم ما يصل الى 40 ماي لكل 10 مليون خلية. وهذا يتطلب عادة من 30 UL العازلة بالاضافة الى حجم بيليه المتبقية.
2. نقل هذا الحجم إلى أنبوب مخروطي 15 مل.
3. إضافة كوكتيل الضد من عدة العزلة CD4 -- 10 UL بنسبة 10 مليون خلية ، أنبوب كأب ، ومكان على الجليد لمدة 10 دقيقة
4. إزالة أنبوب من الجليد ، وإزالة الغطاء ، وإضافة 30 ماي من تشغيل المخزن المؤقت لكل 10 مليون خلية
5. إضافة حبات المغناطيسي من عدة العزلة CD4 -- 20 UL بنسبة 10 مليون خلية ، أنبوب كأب ، ومكان على الجليد لمدة 15 دقيقة
6. إضافة عشرة مجلدات من تشغيل المخزن المؤقت لغسل والطرد المركزي في ز × 230 لمدة 10 دقيقة.
7. أثناء الدوران ، وإعداد المغناطيس و 5 مل أنبوب بولي بروبيلين في منطقة العمل الخاصة بك
8. نضح السوائل من بيليه الخلية ، إضافة 2 مل العازلة تشغيل وإزالة كتل باستخدام ماصة نقل
9. باستخدام ماصة نقل ذاته ، نقل الخلايا في الانبوب 5 مل واحتضان في المغناطيس لمدة 15 دقيقة
10. صب بعناية CD4 ملحوظ في أنبوب 15 مل + جزء الخلية بواسطة المغناطيس وتفريغ قلب جميع ولكن آخر قطرة
11. إضافة آخر مل 2 من تشغيل المخزن المؤقت للأنبوب وإزالة 5 مل من المغناطيس
12. الشطف بلطف خلايا CD4 قبالة وجهي ونقل أنبوب إلى أنبوب علامة 15 مليلتر
13. إضافة 2 مل من الخلايا التائية المتوسطة لكل أنبوب ، لإزالة aliquots الفرز والطرد المركزي في الخلية ز × 230 لمدة 10 دقيقة.
14. تمييع aliquots زنزانة مع التريبان الأزرق والعد باستخدام عدادة الكريات. وهذه التهم الخلية تملي عدد من الآبار المستخدمة للتوسع الخطوة الثقافة.

* وبدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأعمدة MACS والخرز (Miltenyi بيوتيك) ، وفاصل الخلايا AutoMACS (Miltenyi بيوتيك) ، أو Robosep فاصل الخلية (تقنيات الخلايا الجذعية) وفقا لتعليمات تصنع في مكان من الخطوات 2،2-2،11.

3. في الثقافة توسيع المختبر

1. نضح السوائل من CD4 + وCD4 خلايا الكريات ، واستنادا على عدد الخلايا ، إضافة وسائط الثقافة (عادة 3000000 خلايا CD4 + لكل مل و 10 مليون CD4 خلايا لكل مل يعمل بشكل جيد لإقامة ثقافة). ثقافة التوسع يتطلب 3-5000000 خلايا CD4 لكل بئر و2-3000000 خلايا CD4 + لكل بئر في الحجم الكلي للثقافة وسائل الإعلام 1 مل 48 لوحة في الثقافة أيضا. عادة خلايا CD4 + هي الحد من عدد السكان
2. إذا رغبت في ذلك ، أشرق على خلايا CD4 (5000 راد ق). قسامة خلايا CD4 في العدد المناسب من الآبار على طبق من ذهب 48 كذلك من خلال إضافة إلى كل ميكرولتر 300-500. وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. سوف ملتصقة خلايا CD4 خلايا بمثابة مقدمة للمستضد في الثقافة التوسع.
3. إزالة لوحة من الحاضنة.
4. غسل الآبار وذلك بإضافة 500 UL من وسائل الإعلام الجديدة وpipetting بلطف صعودا ونزولا 12-20 مرات باستخدام الماصة نقل وإزالة جميع السائل. هذا وسوف تترك وراءها غسل طبقة من الخلايا الملتصقة تقديم المستضد.
5. عند اكتمال الغسيل ، إضافة إلى وسائل الإعلام ما يكفي من الرطب الجزء السفلي من كل جانب (ما يقرب من 100 UL) -- على خلاف ذلك الخلايا الملتصقة سوف تجف
6. إضافة 2-3000000 خلايا CD4 + إلى كل بئر. إذا لزم الأمر ، إضافة الوسائط إضافية لتحقيق الحجم الكلي في كل ما يصل إلى 1 مل أيضا.
7. إضافة إلى كل المطلوب الببتيد جيدا. تركيز نموذجي لتحفيز هو 10 ميكروغرام / مل النهائي.
8. لوحة مكان في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
9. بعد 7 أيام ، إضافة UL 50 من Hemogen IL - 2 (أو ما يعادلها ، مثل المؤتلف وحدة دولية / مل IL - 2 ، 10) على كل بئر.
10. في كل يوم لاحق ، ورصد نمو الخلايا باستخدام المجهر. تغذية الآبار التي لم تصبح بعد متموجة من خلال إزالة نصف وسائل الإعلام ، إضافة جديدة وسائل الاعلام و 50 ماي من IL - 2. تقسيم الآبار متموجة عن طريق إعادة التعليق على الخلايا ، والانتقال من نصف الخلايا لبئر فارغة ، مضيفا الإعلام الطازجة و 50 ماي من IL - 2. عودة إلى الخلايا الحاضنة.
11. سيتم توسيع الخلايا تكون جاهزة للtetramer بعد 13-15 يوما من الثقافة.

4. تصور الخلايا التائية التي تلطيخ tetramer

1. شراء أو التجمع لمباراة tetramers تركيبات الببتيد / MHC التي تطابق CD4 + تحفيز خلايا تي (انظر المناقشة عن مصادر الكواشف tetramer). وينبغي أن يكون Tetramers ~ 0.5 ملغ / مل حل.
2. إزالة لوحة من الحاضنة
3. رسم بعناية قبالة نصف وسائل الإعلام من كل بئر
4. نقل مجموعة من الخلايا قسامة من كل جانب -- عادة 75 ميكرولتر أو حول الخلايا 50،000 -- في أنبوب 5 مل FACS البوليسترين
5. إضافة tetramer -- 1 ميكرولتر عادة في الحجم الكلي 50 ميكرولتر -- وضعها في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1-2 ساعات. ومن المستحسن أيضا لصبغ a قسامة الثاني من الخلايا من كل بئر غير متطابقة مع tetramer كعنصر تحكم سلبية.
6. تسمية الخلايا المضادة للCD3 CD4 المضادة ، وأضداد CD25 بإضافة 30-10 ميكرولتر من كل الأجسام المضادة. ويمكن استخدام الأجسام المضادة علامات إضافية أو بديلة. ومع ذلك ، لا تستخدم الأجسام المضادة PE المسمى حيث يجب أن تكون محفوظة لهذه القناة tetramers. في هذا الوقت ، وأيضا تسمية واحدة أو اللون أو isotype ضوابط استخدام خلايا إضافية.
7. خلايا الجسم المضاد لاحتضان المسمى 15-30 دقيقة على الجليد أو على 4 درجات مئوية.
8. يغسل كل أنبوب مع 0،5-2 مل العازلة وتشغيل أجهزة الطرد المركزي في ز × 230 لمدة 10 دقيقة.
9. صب السائل بعناية من أنابيب FACS. تخزين جميع الأنابيب في وعاء مغطى (ويفضل على الجليد) للتحليل FACS اللاحقة.

5. تدفق عداد الكريات اقتناء وتحليل

1. معايرة عداد الكريات تدفق باستخدام الخرز المرجعية.
2. التحقق من ضبط الصك :
   1. باستخدام خلايا غير ملوثين أو ضوابط تحكم isotype ، وضبط في موقع بوابة لمفاوية قابلة للحياة (FSC مقابل SSC). إزالة السيارات ومضان من جميع القنوات التي تركز السكان (عن طريق تغيير إعدادات مكسب) أدناه العقد الأول على كل محور.
   2. باستخدام واحد أنابيب التحكم في الألوان ، والأحداث داخل مركز الأرباع الصحيح لكل لون واحد (من خلال تغيير إعدادات التعويض).
   3. لا تسوية غرامة ضبط الصك باستخدام أنبوب ملون مع tetramer غير ذي صلة. ربما في أماكن خاصة لقناة بي تحتاج الى تعديل بسبب وصمة عار في كثير من الأحيان tetramers أكثر إشراقا من السيطرة الأضداد. يجب أن لا صلة لها بالموضوع وصمة عار tetramer <0.5 ٪ من خلايا CD4 +.
3. الحصول على بيانات عن كل أنبوب
   1. جمع الأحداث لكل أنبوب عينة والسلبية أنبوب التحكم
   2. اكتساب وحفظ ما لا يقل عن 20000 فعاليات لأناليسيس
4. تحليل البيانات
   1. استيراد ملفات البيانات في برامج التحليل FACS (مثل CellQuest البرمجيات ، WinMDI ، أو FlowJo). بدء التحليل الخاص باستخدام الملون باستخدام أنبوب tetramer غير ذي صلة.
   2. FSC مؤامرة ضد أمن الدولة ورسم بوابة حول الخلايا الليمفاوية حي (الشكل 1 ، لوحة أعلى اليسار).
   3. مؤامرة ضد CD3 CD4 (بوابات لإظهار الخلايا الليمفاوية العيش فقط) وتعادل بوابات حول + CD3 CD4 + والسكان (الشكل 1 اللوحة اليمنى أعلى).
   4. CD4 مؤامرة ضد Tetramer (بوابات لإظهار الخلايا اللمفية + CD3 فقط) وتعيين حدود رباعي بحيث CD4 + + Tetramer السكان أقل من 0.5 ٪ (لوحة أسفل الشكل 1 اليسار).
   5. مؤامرة ضد CD25 Tetramer (بوابات لإظهار الخلايا اللمفاوية CD4 + فقط) وتعيين حدود رباعي بحيث CD25 + + Tetramer السكان أقل من 0.5 ٪ (لوحة أسفل الشكل 1 يمين).
   6. تحليل كل من أنابيب عينة من دون تغيير على البوابات.

1167/JOVE ٪ 20FIGURE ٪ 201.png "بديل =" الشكل 1 "العرض =" 600 "ذروة =" 342 "/>

الشكل 1. الممثل tetramer نتائج الرقابة تلطيخ السلبية. لوحة العلوي الأيسر إلى الأمام مبعثر مبعثر يظهر الجانب الآيات والبوابة حجم الخلايا اللمفاوية (R1). لوحة اليمنى هي بوابات للR1 ويظهر النمل مقابل CD3 CD4 المضادة للطائرات والبوابات CD3 + (R2) وCD4 + (R3). اللوحة السفلى اليسرى لبوابات R2 ويظهر المضادة للCD4 مقابل tetramer. لوحة أسفل اليمين هي بوابات للR3 ويظهر المضادة للCD25 مقابل tetramer. تم تعيين كل من الأرباع لمؤامرات tetramer إلى 0.5 ٪.

6. ممثل النتائج

1. وينبغي أن الخلايا tetramer إيجابية تكون متميزة بين السكان CD4 + توسيع الخلايا (الشكل 2).
2. خلايا Tetramer ايجابية وعادة ما تكون CD25 + CD4 ، وارتفاع في أغلب الأحيان.
3. في بعض الحالات ، يمكن الجمع بين MHC / الببتيد تعطي تلوين الخلفية (التي غالبا ما تسبب الببتيد الذوبان مع الفقراء). يمكن أن تكون متباينة مثل تلوين الخلفية من إيجابية حقيقية ، لأن "إيجابية كاذبة" خلايا ليست واحدة واضحة على السكان CD4 إما مقابل Tetramer أو CD25 في مقابل المؤامرات Tetramer (الشكل 3).

الشكل 2. الممثل تلطيخ tetramer نتائج إيجابية. لوحة تخطيط واستراتيجية مماثلة لتبوب الشكل 1. الخلايا tetramer الايجابية تبدو وكأنها السكان CD4 متميزة عالية في مكافحة CD4 مقابل لوحة مميزة tetramer والسكان + CD25 CD25 على مكافحة مقابل لوحة tetramer.

الشكل 3. الممثل "إيجابية كاذبة" تلطيخ tetramer النتائج. لوحة تخطيط واستراتيجية مماثلة لتبوب الشكل 1. CD4 في مكافحة مقابل لوحة tetramer يظهر "mounded" غير واضحة تلطيخ. المناهضة للCD25 مقابل tetramer يظهر أيضا "mounded" تلطيخ ، مع عدم وجود اتجاه واضح نحو يجري CD25 +.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

فهم دور خلايا CD4 + T في الحصانة من المهم بشكل أساسي. ومع ذلك ، يمكن CD4 + محددة مستضد الخلايا التائية يكون من الصعب اكتشاف وعزل باستخدام الطرق التقليدية. في المقابل ، MHC الدرجة الثانية tetramers سماح التصور المباشر لخلايا CD4 + T مع خصوصية المستضد المطلوب. هذا الفيديو يدل على العز...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR international	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	Hyclone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond Scientific	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman Coulter Inc.	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR international	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma-Aldrich	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR international	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR international	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon BD	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalge Nunc international	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon BD	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD Biosciences	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent