머릿속 항원 특정 CD4 + MHC 클래스 II Tetramers를 사용하여 T 세포

요약

이 절차는 정화를 보여주고 특정 항원 CD4 + 전체 말초혈 및 MHC 클래스 II의 tetramers을 사용하여 시각화에서 T 세포의 체외 확장 인치 Tetramers은 단일 항원 특이성 및 정의 MHC 클래스 II 제한과 T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다.

초록

주요 histocompatibility 복합 (MHC) 클래스 II의 tetramers은 항원 특정 CD4의 직접적인 시각화 + 유동세포계측법에 의해 T 세포 수 있습니다. 이 방법은 펩타이드로드 MHC와 해당 T - 세포 수용체 사이의 매우 구체적인 상호 작용에 의존합니다. 하나 MHC / 펩티드 분자의 친화력이 낮은 반면, 교차 연결 streptavidin과 MHC / 펩타이드 단지하면 ​​시약을 얼룩로서 사용할 수 있도록, 상호 작용의 욕망을 증가시킵니다. 때문에 CD4 + T 세포 (단일 특이성을위한 300,000의 ~ 1)의 상대적으로 낮은 주파수의 분석은 검출 자사의 한계를 높이기 위해 체외 증폭 단계에서을 활용합니다. Mononuclear 전지는 Ficoll의 밑받침에 의해 말초 혈액 정화됩니다. CD4 + 세포는 다음 biotinylated 항체 칵테일 및 안티 - 비오틴 분류 자​​석 구슬을 사용하여 부정적인 선택으로 구분됩니다. 항원은 세포, CD4 + T 세포가 antigenic의 펩타이드와 IL - 2를 추가하여 미디어 확장된다 제시로 CD4 세포 분획에서 자기편 세포를 사용합니다. 확대 세포 한 시간 동안 37 C의 잠복기와 이후 스테인드 같은 안티 - CD4, 안티 인 경우에는 3 번 CD, 및 안티 CD25와 같은 표면 항체를 사용하여 해당 클래스 II tetramer 물들일 수 있습니다. 라벨 후, 세포를 직접 유동세포계측법으로 분석하실 수 있습니다. tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 확장된 CD4 + 세포들 사이에 뚜렷한 인구를 형성합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은. 배경 tetramer의 얼룩의 수준이 다를 수 있기 때문에, 긍정적인 얼룩 결과는 항상없는 tetramer와 같은 세포의 얼룩에 비해해야합니다. 이 기본 분석의 여러 변형이 가능합니다. Tetramer 긍정적인 세포는 더욱 phenotypic 분석, ELISPOT 또는 확산 assays에 포함 또는 기타 보조 assays에 대한 정렬 수 있습니다. 몇몇 그룹은 또한 tetramers 및 안티 시토킨 또는 방지 FoxP3 항체 중 하나를 사용하여 공동 얼룩을 증명하고있다.

프로토콜

1. 주변 혈액 mononuclear 세포 (PBMC) 절연

1. 혈액 샘플을 구합니다 - 피를 주사기 혹은 혈액 튜브의 수집과 염증을 방지하기 위해 헤파린 (1시 50분 비율)과 함께 안티 coagulated해야합니다. 약 1 × 혈액 ML 당 10 ⁶ PBMC의 수율을 기대 - CD4 양성 (CD4 +) T 세포 될 약 40 % 중.
2. 50 ML 원뿔 튜브, 튜브 당 25 ML로 나누어지는 혈액을. 혈액이 분리된 경우, 부드럽게 플라즈마를 배포하기 전에 aliquoting 믹스
3. , 40 ML과 Ficoll 11 ML을 그림으로써 밑받침으로 전체 볼륨을 가져 혈액 튜브에 삽입하고, 조심스럽게 피펫에서 pipet 보조를 제거, PBS를 추가합니다. ficoll 천천히 튜브의 바닥에 배수됩니다. 수준이 같도록되면 서서히 혈액 튜브에서 피펫을 제거하고 폐기.
4. 혈액 튜브를 모자 Aerosolve 용기로 이동합니다. 노 브레이크 - 단단히 900의 용기와 원심 × g 20 분 동안을 닫습니다. 그것은 제동 힘은 세포의 레이어를 방해하므로 아무런 제동이 스핀의 끝에 적용되지 않습니다 것이 중요합니다.
5. 스핀 후 PBMCs는 노란색 플라즈마 (위)와 투명 ficoll (아래) 사이에는 뚜렷한 흰색 레이어를 형성한다. 부드럽게 전송 피펫과 새로운 튜브로 전송을 사용하여 백혈구 층을 우유. 일부 플라즈마와 Ficoll이 PBMCs와 그립지만, 붉은 세포 계층의를 그리기 피할 수 있습니다. 일반적으로 2 혈액 튜브는 펠렛의 크기를 증가하려면이 단계에서 한 셀 관에 조합하여 사용할 수 있습니다.
6. aerosolve 용기에 낮은 브레이크 - 500 50 ML하고 원심 분리기로 전체 볼륨을 데리고 PBS, × 15 분 동안 g을 추가합니다.
7. 펠렛을 방해하지 않도록 돌봐, 파스퇴르 피펫을 사용하여 액체를 기음
8. 각각의 튜브에 5-6 ML를 추가하고 부드럽게 대단히 짧은 시간을 제거하는 혼합에 의해 용혈성 버퍼 처리합니다. 더 이상 5 분 이상의 알을 품다.
9. 10 분 230 50 ML하고 원심 분리기로 전체 볼륨을 데리고 PBS, × g 추가 - 낮은 브레이크. Aerosolve 용기 이러한 느린 놀이를 위해 더 이상 필요하지 않은 있습니다.
10. 두 번 씻으 : 대기음 액체 파스퇴르 피펫을 사용하여 10 분 동안 230 × g에서 PBS와 원심 분리기와 튜브를 입력합니다.
11. 전에 최종 세척 단계로, 다시 정지 세포 나누어지는를 제거 trypan과 청색의 희석과 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 이 셀 개수는 T 세포 분리 단계에서 사용되는 시약 볼륨을 지시합니다.

2. CD4 + T 세포 분리 ^*

1. 액체를 기음과 10000000 세포 40 UL에 전체 볼륨을 가지고 실행 버퍼를 추가합니다. 보통이 30 버퍼 UL 플러스 잔여 펠렛 볼륨이 필요합니다.
2. 15 ML 원뿔 관이 볼륨을 전송합니다.
3. 10 분 얼음 10,000,000 세포 당 10 UL, 캡 튜브, 장소 - CD4 격리 키트에서 항체 칵테일 추가
4. , 얼음 튜브를 제거 뚜껑을 제거하고, 10,000,000 세포마다 버퍼를 실행하는 30 UL을 추가
5. CD4 격리 키트에서 자기 구슬을 추가 - 20 10000000 세포 당 UL, 캡 튜브, 그리고 15 분 동안 얼음에 장소
6. 10 분 230 × g에서 세척하고 원심 분리기로의 버퍼를 실행 십 볼륨을 추가합니다.
7. 스핀 동안, 당신의 작업 공간에있는 자석 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브를 설정
8. , 세포 펠렛에서 액체를 대기음이 ML 실행 버퍼를 추가하고 전송 피펫을 사용하여 대단히 짧은 시간을 제거
9. 동일한 전송 피펫을 사용하여 15 분 자석에 5 ML 튜브 및 부화에 세포를 전송
10. 조심스럽게 반전 자석에 의해 표시 15 ML 튜브에 + 세포 분율을 CD4을 가만히 따르다 모든하지만 마지막 한 방울까지 비우기
11. 5 ML 튜브에 버퍼를 실행하는 또 다른이 ML을 추가하고 자석에서 제거
12. 부드럽게 튜브의 측면과 표시 15 ML 튜브로 전송 해제 CD4 - 세포를 씻어
13. 각 튜브 2 ML T 세포 매체를 추가, 10 분 동안 230 × g에서 셀 카운팅 및 원심 분리기에 대한 aliquots를 제거합니다.
14. trypan과 청색의 세포 aliquots을 희석하고 hemocytometer를 사용하여 계산합니다. 이러한 세포 카운트는 확장 문화 단계에 사용되는 우물의 수를 지시합니다.

2.11 - * 또는 Mac에서 열 및 구슬 (Miltenyi Biotec), AutoMACS 세포 분리기 (Miltenyi Biotec) 또는 Robosep 전지 세퍼레이터 (줄기 세포 기술) 단계 2.2 대신에 지시를 생산에 따라 사용할 수 있습니다.

3. 체외 확장 문화

1. CD4에서 액체를 기음 + 및 셀 카운트에 따라 CD4 세포의 산탄하고, 문화 미디어 (일반적으로 3,000,000 CD4 + ML 당 세포 10000000 ML 당 CD4 - 세포가 문화를 설정하는 잘 동작)을 추가합니다. 확장 문화 3-5000000 CD4 - 세포마다 잘과 2-3000000 CD4 + 48 자 문화 플레이트 1 ML 문화 미디어의 총 볼륨에 잘 따라 세포를 필요로합니다. 일반적으로 CD4 + 세포는 제한 인구 아르
2. 원하는 경우, CD4 - 세포 (5,000 래드 비추다 S). 각각 300-500 μL를 추가하여 48 잘 접시에 우물의 해당 번호로 나누어지는의 CD4 세포. 1 시간 37 ° C 배양기에서 접시를 놓습니다. CD4 세포 자기편은 확장 문화에 항원 제시 세포로 될 것입니다.
3. 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다.
4. 신선한 미디어 500 UL을 추가하고 부드럽게 12-20 시간을 아래 pipetting하고 전송 pipet을 사용하여 액체를 모두 제거하여 우물을 씻으십시오. 이 세차 자기편 항원 제시 세포의 레이어 뒤에 떠날 것입니다.
5. 세탁이 완료되면, 각 우물의 바닥 (약 100 UL)에 서부 유럽 표준시에 충분 미디어를 추가합니다 - 그렇지 않으면 자기편 세포 밖으로 건조합니다
6. 각 잘하는 2-3000000 CD4 + 세포를 추가합니다. 필요한 경우 각 물론 최대 1 ML의 전체 볼륨을 가지고 추가 미디어를 추가할 수 있습니다.
7. 각 잘하기 원하는 펩타이드를 추가합니다. 자극에 대한 전형적인 농도는 10 UG / ML 최종 수 있습니다.
8. 7 일 동안 37 ° C 배양기에 넣어 판.
9. 칠일 후에 Hemogen 50 UL을 추가 IL - 2 (또는 재조합 IL - 2, 10 IU / ML으로 이에 상응하는 금액) 각각 잘 수 있습니다.
10. 이후의 각 날, 현미경을 사용하여 세포 성장을 모니터링합니다. 신선한 미디어와 IL - 2의 50 UL을 추가, 아직 미디어의 절반을 제거하여 합류하지 우물 피드. , 세포를 resuspending 빈 잘하는 세포의 절반을 이동, 신선한 미디어와 IL - 2의 50 UL 추가하여 합류 우물을 분할. 인큐베이터로 세포를 반환합니다.
11. 확대 세포는 문화의 13-15일 후 tetramer 준비가 완료됩니다.

4. tetramer의 얼룩에 의해 T 세포를 떠올리

1. 구입하거나 자극 CD4 + T 세포를 (tetramer 시약의 출처에 대한 논의를 참조)과 일치하는 펩타이드 / MHC 조합에 맞게 tetramers 조립. Tetramers는 ~ 0.5 MG / ML 솔루션해야합니다.
2. 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다
3. 조심스럽게 각 우물에서 미디어의 절반을하다
4. 5 ML의 폴리스티렌 외과 튜브로 - 일반적으로 75 μL 또는 약 50,000 세포 - 각 우물에서 세포의 나누어지는를 전송
5. 50 μL 총 부피 당 일반적으로 1 μL - - 및 37 자리 1~2시간에 대한 ° C 배양기 tetramer를 추가합니다. 대조군으로 일치하지 않는 tetramer 각 우물에서 세포의 두 번째 나누어지는를 얼룩 또한 것이 좋습니다입니다.
6. 각 항체의 3-10 μL를 추가하여 안티 - 인 경우에는 3 번 CD, 안티 - CD4, 및 안티 CD25 항체와 레이블 셀. 추가 또는 대체 항체 마커를 사용할 수 있습니다. 이 채널은 tetramers을 위해 예약되어 있어야합니다 때문에 그러나, PE 라벨이 항체를 사용하지 마십시오. 추가 전지를 사용하는이 시점에서, 또한 라벨 단일 색상이나 isotype 제어합니다.
7. 얼음이나 4 15~30분에 대한 품어 항체 라벨 세포 ° C.
8. 0.5-2 ML 10 분 동안 230 × g에서 버퍼와 원심 분리기를 실행하는 각 튜브를 씻으십시오.
9. 외과 튜브에서 조심스럽게 가만히 따르다 액체. 이후 외과 분석을위한 대상 컨테이너 (선호 얼음) 모든 튜브를 저장합니다.

5. 흐름 Cytometer 수집 및 분석

1. 참조 비즈를 사용하여 흐름 Cytometer를 보정합니다.
2. 악기 설정을 확인합니다 :
   1. 흠없는 제어 셀 또는 isotype 컨트롤을 사용하여 가능한 림프구 게이트 (FSC 대 SSC)의 위치를​​ 조정합니다. 각 축의 첫 번째 decade 아래의 인구 (게인 설정을 변경하여)을 중심으로하여 모든 채널에서 자동 형광을 제거합니다.
   2. 단일 색상 제어 튜브, 각 단일 색상에 대한 올바른 quadrants 내에 센터 이벤트 (보정 설정을 변경하여)를 사용.
   3. 없는 tetramer 물들일 튜브를 사용하여 악기 설정의 미세한 조절을 마십시오. tetramers 자주 항체 컨트롤보다 밝은 얼룩 때문에 PE 채널에 대한 특정 설정에서 조정이 필요할 수 있습니다. 없는 tetramer는 CD4의 <0.5 % + 세포를 얼룩해야합니다.
3. 각각의 튜브에 대한 데이터를 수집
   1. 각 샘플 튜브와 대조군 튜브에 대한 이벤트를 수집
   2. analysys 최소한 20000 이벤트를 수집 및 저장
4. 데이터 분석
   1. 가져오기 데이터 파일 외과 분석 소프트웨어 (예 : CellQuest 소프트웨어, WinMDI 또는 FlowJo)로. 없는 tetramer를 사용하여 튜브 스테인드를 사용하여 분석을 시작합니다.
   2. 플롯 FSC 대 SSC하고 라이브 lymphocytes (그림 1, 왼쪽 상단 패널) 주위에 게이트를 그립니다.
   3. 플롯 CD4 대 인 경우에는 3 번 CD에 들어 있고 인 경우에는 3 번 CD +와 CD4 주변 성문을 그릴 (오직 lymphocytes을 보여 게이 티드) + 인구 (그림 1 오른쪽 상단 패널).
   4. 플롯 CD4 대 Tetramer (단 인 경우에는 3 번 CD +의 lymphocytes을 보여주 게이 티드) 및 사분면의 경계를 설정할 수 있도록 CD4 + Tetramer + 인구는 0.5 % 이하 (그림 1 왼쪽 아래 패널)입니다.
   5. 플롯 CD25 대 Tetramer 및 CD25 + Tetramer + 인구는 0.5 % 이하 (그림 1 오른쪽 하단 패널)가되도록 사분면의 경계를 설정 (CD4 + lymphocytes만을 보여주 게이 티드).
   6. 성문을 변경하지 않고 샘플 튜브를 모두 분석할 수 있습니다.

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그림 1. 대표 대조군의 tetramer의 얼룩 결과. 왼쪽 상단 패널은 앞으로 스캐터 구절 사이드 분산 및 림프구 크기 게이트 (R1)을 보여줍니다. 오른쪽 상단 패널은 R1에 대한 문이 있으며, 안티 인 경우에는 3 번 CD에 들어 있고 인 경우에는 3 번 CD + (R2)와 CD4 + (R3) 게이츠 대 개미 - CD4를 보여줍니다. 왼쪽 하단 패널은 R2에 대한 문이 있으며, tetramer 대 안티 CD4를 보여줍니다. 오른쪽 아래 패널 R3에 대한 문이하고 안티 CD25 대 tetramer를 보여줍니다. 두 tetramer의 플롯에 대한 quadrants은 0.5 %로 설정했다.

6. 대표 결과

1. tetramer 긍정적인 세포는 CD4 + 세포를 확장합니다 (그림 2) 사이에 뚜렷한 인구해야합니다.
2. Tetramer 긍정적인 세포는 일반적으로 CD25 아르 +와 CD4 종종 높은.
3. 어떤 경우에는 MHC / 펩타이드 결합 배경 얼룩을 (종종 가난한 용해도와 펩타이드에 의한) 제공할 수 있습니다. "거짓 긍정적인"세포 Tetramer 또는 CD25 대 Tetramer의 플롯 (그림 3) 대 CD4 중 하나에 하나의 뚜렷한 인구하지 않기 때문에 이러한 배경 얼룩은 진정한 긍정에서 차별화된 수 있습니다.

그림 2. 대표 긍정적인 tetramer의 얼룩 결과. 패널 레이아웃 및 게이팅 전략 1 그림과 동일합니다. tetramer 긍정적인 세포가 백신 CD25 대 tetramer 패널에 tetramer 패널과 별개의 CD25 + 인구 대 안티 - CD4에 뚜렷한 CD4 높은 인구로 표시됩니다.

그림 3. 대표 "거짓 긍정"tetramer의 얼룩 결과. 패널 레이아웃 및 게이팅 전략 1 그림과 동일합니다. tetramer 패널 대 안티 CD4는 뚜렷하지 "mounded"얼룩을 보여줍니다. 안티 CD25 대 tetramer 또한 CD25 +되는 방향으로 알 수없는 추세 "mounded"얼룩을 보여줍니다.

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토론

면역의 CD4의 역할 + T 세포를 이해하는 것이 근본적으로 중요하다. 그러나, 특정 항원 CD4 + T 세포가 감지하고 전통적인 방법을 사용하여 분리하기가 어려울 수 있습니다. 대조적으로, MHC 클래스 II의 tetramers 원하는 항원 특이성과 CD4 + T 세포의 직접적인 시각화를 허용합니다. 이 동영상은 고립, 정화하고, CD4 + T 세포와 tetramers를 사용하여 후속 시각화의 체외 증폭에을 보여줍니다. 클래스 II의 Tetrame...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Class 2 Laminar flow biosafety cabinet	equipment	Thermo Fisher Scientific, Inc.	1200	Or equivalent
50 mL conical Tube	equipment	VWR international	47747-182	Or equivalent
1X PBS (Ca/Mg free)	Reagent	Hyclone	SH30028.02	Or equivalent
Ficoll-paque PLUS	Reagent	GE Healthcare	17-1440-03	foil wrapped to protect from light
Pipet Aid XP	equipment	Drummond Scientific	4-000-101	Or equivalent
10 mL pipet	equipment	Corning	CLS4492	Or equivalent
Aerosolve Canisters	equipment	Beckman Coulter Inc.	359481	with 50 mL inserts
Centrifuge	equipment	Beckman Coulter Inc.	GS-6R	Or equivalent
Transfer pipets	equipment	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	202-20S	Or equivalent
Pasteur pipets	equipment	VWR international	14672-200	Or equivalent
Hemolytic Buffer	Reagent	N/A	N/A	8.3 g/L NH4Cl, 1.0 g/L NaHCO3, 0.04 g/L disodium EDTA
Trypan blue	Reagent	Sigma-Aldrich	T6146	0.2% in PBS
Hemocytometer	equipment	VWR international	15170-208
15 mL conical tube	equipment	VWR international	05-527-90	Or equivalent
Running Buffer	Reagent	N/A	N/A	PBS + 2mM EDTA + 5g/L BSA
MACS CD4+ T Cell Isolation Kit II	Reagent	Miltenyi Biotec	130-091-155	Or equivalent
EasySep® Magnet	equipment	Stem Cell Technologies	18000
5 mL polypropylene tube	equipment	Falcon BD	352063
RPMI 1640	Reagent	Invitrogen	22400-089	with 25 mM HEPES
Pooled human serum	Reagent	N/A	N/A	drawn from healthy donors, heat inactivated and filtered
Pen Strep	Reagent	Invitrogen	1570-063	Or equivalent
500mL 0.22 micron bottle top filter	equipment	Nalge Nunc international	595-3320	Or equivalent
48-well plate	equipment	Costar	3548	Or equivalent
37°C CO2 incubator	equipment	Sanyo	MCO-18AIC	Or equivalent
20 mg/mL synthetic peptide	Reagent	N/A	N/A	Custom synthesis from any peptide vendor
5 mL FACS tube	equipment	Falcon BD	352008	Polystyrene
Peptide loaded class II tetramer (as described)	Reagent	N/A	N/A	Prepared by the BRI tetramer core
Anti-CD3	Reagent	BD Biosciences	347344	Or equivalent
Anti-CD4	Reagent	eBioscience	17-0049-73	Or equivalent
Anti-CD25	Reagent	eBioscience	11-0259-73	Or equivalent
Facs Calibur Flow Cytometer	equipment	BD Biosciences	342975	Or equivalent