تنسيق كا 2 + الكشف العابر في العضلات الملساء

Summary

تفاصيل أساليب عالية الدقة كا ^{2 +} التصوير من العضلات الملساء داخل أجهزة معزولة ، ومنها : التحضير لاكتساب صورة من الأنسجة ، وتحليل البيانات.

Abstract

كاليفورنيا ^{2 +} التصوير من العضلات الملساء ، رؤية ثاقبة الآليات الخلوية التي قد لا تسفر عن تغييرات محتملة في الغشاء ، مثل الافراج عن كا ^{2 +} من مخازن الداخلية ، ويسمح لخلايا متعددة في وقت واحد يمكن رصدها لتقييم ، على سبيل المثال ، في اقتران المخلوي الأنسجة. التحت خلوية كا ^{2 +} العابرين شائعة في العضلات الملساء ، ولكن يصعب قياسها بدقة بسبب المشاكل الناجمة عن وقوعها العشوائية ، أكثر من حقل واسع في كثير من الأحيان من العرض ، في الجهاز الذي يجعله عرضة للتعاقد. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا بتطوير سلسلة من البروتوكولات والتصوير الروتينية للحصول على تحليل ومن ثم تحليلها ، وبطريقة آلية ، والتردد ، والموقع والسعة من مثل هذه الأحداث. بينما يمكن تطبيق هذا النهج في سياقات أخرى ، عملنا يشمل الكشف عن purinergic كا ^{2 +} العابرين المحلية لتحديد مواقع اطلاق سراح الارسال مع القرار submicron.

ATP يتم تحريرها باعتبارها cotransmitter من الأعصاب اللاإرادية ، حيث يربط P2X1 المستقبلات في العضلات الملساء للالنافصة والأسهر. كاليفورنيا ^{2 +} يدخل العضلات الملساء ، مما أدى إلى purinergic neuroeffector العابرين كا ^{+ 2} (NCTs). الاتصال كا ^{2 +} العابرين تسمح برصد البصرية الإفراج العصبي بطريقة العديد من المزايا أكثر من الكهربية. وبصرف النظر عن القرار المكانية تحسنت كثيرا ، وتسجيل البصرية لديه ميزة إضافية تتمثل في السماح للتسجيل من مواقع الارسال الافراج مميزة كثيرة في وقت واحد. وعلاوة على ذلك ، فإن الطائرة الضوئية التركيز هو أسهل للحفاظ على أو تصحيح خلال سلسلة طويلة من تسجيل هو ضعيتها microelectrode an حادة داخل الخلايا.

باختصار ، هو وضع الخطوط العريضة لطريقة التصوير من كا ^{2 +} مضان الذي تفاصيل إعداد الأنسجة ، واقتناء وتحليل البيانات. نحن مخطط استخدام البرامج النصية عدة لتحليل مثل الكالسيوم ^{2 +} العابرين.

Protocol

الجزء 1 : إعداد كا ^{2 +} المؤشر (اوريغون الأخضر 488 - BAPTA 01:00)

1. أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 يأتي في 500 قارورة AM ميكرولتر وكمية صغيرة (50 ميكروغرام) من مسحوق. إضافة Pluronic 40 ميكرولتر F - 127 حل لمسحوق ، والهز برفق لمدة 30 ثانية ، ثم يضاف 460 PSS ميكرولتر ، ويهز بلطف لمدة 30 ثانية. الحل النهائي ، و 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 صباحا ، ويوفر 4 × 125 aliquots ميكرولتر. تجنب التعرض للضوء وتخزينها على سي -20

الجزء 2 : كا ^{2 +} التحميل

1. إزالة المؤشر ⁺ كا ² (ولاية أوريغون الأخضر 488 - BAPTA 1:00) من التجميد (-20 م) والسماح لذوبان الجليد في درجة حرارة الغرفة.
2. أخذ 1 مل من جهاز الأمن الوقائي في أنبوب اختبار وضعها في حمام ماء. يا فقاعة مع 95 ٪ _05/02 ٪ CO ₂ بمعدل حوالي 1 فقاعة الظهور في الثانية الواحدة. عوامات ويجب أن يكون المضمون في أنبوب اختبار ، وعلى سبيل المثال مع كدر أو مع Parafilm.
3. تشريح الأنسجة من الحيوانات ، وطبق بيتري Sylgard مبطنة ، وإزالة بعناية النسيج الضام. بغض النظر عن نوع الجهاز العضلات الملساء ، ينبغي الاستعاضة عن كل PSS دقائق (10) ويجب غسلها جيدا الأنسجة (على سبيل المثال عن طريق استبدال جهاز الأمن الوقائي ثلاث مرات) تشريح التالية. لالأسهر : النظر في قطع الجهاز طول الطرق لإنتاج ورقة من الأنسجة. لالمثانة البولية : فتح طوليا من عنق المثانة (الخلفي) على الجزء العلوي من القبة (الأمامية). إعداد أربعة شرائط ، 6 -- 8 مم طويلة و 1 -- 2 ملم واسعة ، على طول السطح الظهري للالنافصة ، وقطع في اتجاه الحزم العضلات المهيمنة.
4. مكان تشريح الأنسجة في جهاز الأمن الوقائي "ما قبل تحسنت وانفجر".
5. إضافة 125 ميكرولتر من 10 ميكرومتر أوريغون الخضراء BAPTA - 488 1:00 إلى أنبوب اختبار ويعطي يهز قليلا ، من جهة ، وإلى مزيج.
6. استئناف محتدما ويترك ، مع تغطية احباط. الوقت المستغرق لأنسجة كافية لتناول الكالسيوم ^{2 +} مؤشر يتفاوت مع حجم الأنسجة وسماكة طبقة العضلات الملساء. على سبيل المثال : 70 دقيقة (الماوس النافصة ، anococcygeus الجرذان) إلى 120 دقيقة (النافصة الجرذ ، الفأر الأسهر).

الجزء 3 : إعداد "كا ^{2 +} تحميل' الأنسجة للفحص المجهري

حذرا من النسيج تعلق أمر ضروري من أجل تقليل حركة عفوية من النسيج (خاصية التصوير من خلايا العضلات الملساء من الأنسجة سليمة نسبيا) ، وتيسير موقع موقع مناسب للتصوير (كما شقة قطعة من النسيج قد يكون الاستطلاع في بعدين ، بدلا من ثلاثة).

1. شطف الأنسجة في PSS انفجر ما لا يقل عن 5 دقائق.
2. جبل في إعداد طبق Sylgard مبطنة ، وتمتد إلى الأنسجة (قليلا) لتشكيل ورقة مسطحة. تجنب استخدام الطويل "دبابيس" التي قد تخدش الهدف ، واستخدام أطوال قصيرة بدلا من 25-50 ميكرون قطر الأسلاك الفضية ب "دبابيس" وتدرج في زاوية.
3. موقف إعداد طبق على المسرح المجهر ، والحرص على التأكد من أن PSS لا الهروب من منطقة Sylgard مبطنة للطبق (لأن هذا قد يؤدي إلى تغطية منطقة كبيرة يجري في جهاز الأمن الوقائي ، وعندما يبدأ superfusion).
4. التبديل على مضخة من أجل إعداد superfuse مع PSS. غالبا ما يتم توظيف نسبة 100 مل للساعة الواحدة.
5. التبديل في وحدة تدفئة.
6. وضع أنابيب تدفق وتدفق ، والتحقيق في درجة الحرارة على طبق التحضير (لصق كل لقطاع المعادن بواسطة المغناطيس على قاعدتها). فإن ارتفاع غيض من أنبوب تدفق تحديد عمق PSS. توخي الحذر لضمان تدفق هو في الواقع إزالة PSS (كما هو الحال في بعض الأحيان ليس في البداية).
7. ضبط درجة الحرارة في وحدة سخان للوصول إلى درجة الحرارة المطلوبة ، على سبيل المثال 33-35 C.
8. السماح للتوازن الأنسجة لا يقل عن 10 دقيقة.

الجزء 4 : اختيار موقع لصورة

التعرض للإضاءة والإثارة photobleach المؤشر ، وبالتالي تجنب استخدام أكثر من بضع ثوان في كل مرة.

1. مع هدف منخفضة الطاقة (10X أو 20X) استخدام epifluorescence ومثيرة مع ضوء أزرق ، لعرض العضلات الملساء ، وتحديد منطقة مناسبة لمراقبته. محاولة لاختيار الموقع على أساس : الحركة (التي يجب أن يكون الحد الأدنى) ، وعدد خلايا العضلات الملساء في هذا المجال. "هياكل" مشرق قد يسبب عددا كبيرا من "ايجابيات كاذبة" في صورة خوارزمية الكشف ، وبالتالي تجنب المواقع التي تحتوي على أعداد كبيرة من الخلايا (على سبيل المثال) أو الظهارية يتخلل الليفية.
2. التحول إلى هدف أكبر من الطاقة (40X).
3. تدوير مرحلة أو المحور البصري حتى الخلية العضلات الملساء (ق) وتقع الأفقية (الموازية للمحور أي مسح سريع).

الجزء 5 : متحد البؤر المجهري

تفاصيل عن كيفية "إعداد" المجهر مبائر محددة لكل نوع المجهر ، ولكنالاعتبارات الرئيسية هي : السرعة (هو الحد الأدنى المطلوب من 5 هرتز لمعظم العابرين كا ^{+ 2)} ، والقرار وحجم الحقل (وكلاهما يتاجر حالا مع السرعة). بعض بروتوكول التالية محددة إلى مجهر لايكا SP2 مبائر تستقيم. بروتوكول نموذجي هو : 100 سلسلة الإطار ، حصلت على 5 هرتز (256 × 256 بكسل ، حوالي 100 × 100 ميكرون) أو 13.5 هرتز (256 × 64 بكسل ؛ حوالي 100 × 25 ميكرون). رئيس مجموعة مسح للتحرك ثنائي إتجاهي (لتحقيق أقصى قدر من السرعة الاستحواذ) والحصول على 1000 هرتز في كل سطر.

1. إغلاق الثقب إلى "القرص مهواة' واحد.
2. مجموعة ليزر (488 نانومتر) على السلطة بين 25 و 35 ٪ على AOTF ؛ هذه القيمة هي مفاضلة بين السطوع وphotobleaching. (وهذا الأخير هو مشكلة خاصة خلال تسجيلات طويلة.)
3. الحصول على ست مجموعات في كل موقع ، و4-6 في مواقع "المعاملة". انها لهدف مشترك لمراقبة نفسه قبل ستة مواقع للمخدرات ("السيطرة" على سبيل المثال) وآخر من المخدرات ، على الرغم من photobleaching كبيرة قد يسبب المجرب لتحيد عن ذلك.
4. فمن الضروري مع كا ^{2 +} التصوير التي يتم تنفيذها "ضوابط الوقت".

الجزء 6 : إعداد لتحليل

1. تحميل وتثبيت صورة من J : http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. تحميل النسخة منصة محددة ، ومن ثم التحديث إلى أحدث إصدار عن طريق تحميل أحدث ملف imageJ.jar من http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar ، ليحل محل الملف القديم. التفاح مستخدمي ماك : إذا كان يعمل ببطء ، تأكد من أنك تستخدم أحدث إصدار من الجهاز الظاهري جافا (JVM) متوفرة من Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. تحميل Excel_writer.jar من : http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html وتثبيت الإضافات في [الدليل] جرة> الدليل.
3. نسخ الملفات التالية إلى الدليل الإضافات : Leica_SP2_Stacker.class ؛ JNCT0.08Release.ijm. تثبيت كل من هذه البرامج النصية باستخدام الإضافات [القائمة]> وحدات الماكرو تثبيت <... ImageJ ظيفة.
4. نستخدم المجهر لايكا مبائر SP2 ، البرنامج (لايكا LCS) الذي يولد كل سلسلة ك "فيلم" واحد للعرض داخل البرنامج ، ولكن كما يوفر الأطر الفردية. لإعادة بناء الأطر في سلسلة : (ط) تأكد من أن كل "إطارات" من أجل إعادة بنائها في مجلد واحد (مثل 'DataFolder> المشاجرات'). (ثانيا) حدد الإضافات [القائمة]> وحدات الماكرو> Leica_SP2_Stacker. حدد الدليل الجذر (على سبيل المثال 'DataFolder'). حدد المجلد المطلوب من القائمة المنسدلة ('المشاجرات /' مثلا). حدد الدليل الإخراج أو إنشاء واحدة جديدة ('DataFolder> الأكوام" مثلا). البرنامج النصي ثم إعادة بناء سلسلة من الأطر الفردية.

الجزء 7 : تصحيح للحركة

رغم أنه قد يكون مصغرا الحركة من موقع تصوير مع يعلقون جيدة والأنسجة بالتساوي طاقتها ، وبعض الأجهزة تقلصات العضلات الملساء المعرض العفوية التي لا يمكن إلغاؤها من جانب الحذر تعلق وحدها. نحن هنا وصف استخدام خوارزمية متاحة بحرية أن تؤيد أو إطارات مباريات ضمن سلسلة.

1. تنزيل "StackReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) و "TurboReg' (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. تثبيت كل الإضافات إلى الدليل باستخدام الإضافات> وحدات الماكرو تثبيت <...
3. تحميل كدسة بحيث تتم معالجتها (ملف> فتح...) ونقل بعد ذلك إلى الإطار الذي يظهر بوضوح في مجال الاهتمام. وسوف تكون محاذاة الإطارات الأخرى في هذا الإطار المرجعي.
4. الإضافات> مداخن> StackReg. حاول كل من "التحولات" مختلفة (أي الترجمة ، هيئة جامدة ، تناوب مقيس ، أفيني) لتحديد ما هو الأكثر فعالية. (مزيد من التفاصيل : http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

الجزء 8 : الجسيمات خوارزمية الكشف

لكل "موقع" المصورة ، وسوف تختلف العوامل التي تؤثر على الكشف عن كا ^{2 +} العابرين. من خلال قياس بعض خصائص كل موقع ('المعلمات الجسيمات' -- مفصلة أدناه) ، مما يسهل عملية الكشف. وهكذا في كل موقع ، واحد يحسب 'عتبة طرح' ، 'الحد الأدنى لنسبة" و "عتبة حافة الخلية.

1. الإضافات [القائمة]> وحدات الماكرو> تثبيت... ثم اختر "JNCT0.08Release.ijm.
2. الإضافات [القائمة] تحميل>> وحدات الماكرو المكدس (اختصار : لتر). حدد سلسلة وحساب المعلمات الجسيمات :
   1. أ. عتبة لطرح (= الخلفية)
3. تحديد عائد الاستثمار مستطيلة على ما كنت تعتقد أن 'خلفية'.
4. قياس (اختصار : م). يدون يعني.
   1. ب. حساب الحد الأدنى لنسبة
5. حدد مستطيلالعائد على الاستثمار في جميع أنحاء منطقة مسطحة بصريا من الخلية (ق).
6. قياس (اختصار : م). علما الانحراف إلى أسفل وقياسية.
7. مزيد من تكرار مرتين أو يمكنك رسم ثلاثة صناديق في آن واحد عن طريق الضغط على "التحول".
8. حساب ويدون عتبة نسبة = (1 + SD / الوسط) × 32 ، بمتوسط ​​القيم من ثلاثة مكررات / المواقع.
   1. ج. خلية حافة عتبة
9. صورة> مداخن> Z المشروع... اختيار نوع الإسقاط : "كثافة متوسط'
10. صورة> ضبط> العتبة.
11. حدد الأبيض والأسود.
12. تعريف "ضمن" (التمرير العلوي) والحد من انخفاض قيمة علما المقابلة (على يمين شريط التمرير). وسيتم احتساب فقط الأحداث التي تحدث في مناطق السود.
13. انقر على "إعادة".
14. تحليل المداخن (اختصار : 2)
15. ما عليك سوى اختيار سلسلة واحدة في هذه المرحلة ، أي "الملف الأول" و "الملف الأخير" يجب أن تكون هي نفسها.
16. أدخل قيم "عتبة طرح' 'عتبة نسبة' ، و 'عتبة حافة الخلية. ترك الإعدادات الأخرى في قيمها الافتراضية.
17. وسوف تنتج الخوارزمية إطار ثنائي في الجزء الذي يظهر في سلسلة معالجتها على اليسار وعلى اليمين الأصلي. من خلال هذا الانتقال بعناية لتقييم عدد من ايجابيات كاذبة والمناسبات التي لم تكن الأحداث ، مرئية بالعين ، تم الكشف عنها. للحصول على كشف أدق من كا ^{2 +} العابرين قد يكون من الضروري تعديل طفيف على بعض من 'المعلمات الجسيمات. في حين أن العملية قد تبدو "ضرب وتفوت" قليلا في المحاولة الأولى ، واحد يحصل بسرعة على ما يشعر المعلمات الرئيسية.
18. لكل سلسلة ، الخوارزمية ينتج ملف Excel الذي تفاصيل خصائص الحدث الكشف (مثل المنطقة ، وموقف السعة). "ايجابيات كاذبة" -- التي تم تحديدها من خلال مراجعة ملفات الصور التي النواتج الخوارزمية (مثل الخطوة 8.17) -- يمكن إزالتها ، من جهة ، وهذا من ملف Excel.

Discussion

اختيار الفلورسنت كا ^{2 +} مؤشر

أوريغون الخضراء BAPTA 488 - 1 حيث تم اختيار AM كا ^{2 +} المؤشر لأنه (ط) هو مشرق مقارنة بالمؤشرات الأخرى (مثل Fluo - 4 والأخضر الكالسيوم) ¹ ؛ تركيز ⁺ (ب) هو حساسية للتغيرات فسيولوجية في كا ² مع _د K حجم مماثل من ¹ إلى داخل الخلايا كا ^{2 +} تركيز [كا ^{2 +]} ط (مثلا الأسهر ²⁾ ، (الثالث) يحمل الكثير من خلايا العضلات الملساء ، مما السلس اقتران الخلايا العضلية ليتم رصدها. ومع ذلك ، ولاية أوريغون الخضراء BAPTA - 488 01:00 هو غير ratioable كا ^{2 +} المؤشر ، ولا يمكن بسهولة مثل استخدامها لتحديد المطلق [كا ^{2 +]} _ط. وعلاوة على ذلك ، فإنه قد العازلة أيضا كا ^{2 +} اذا كان حاضرا في تركيزات عالية وتصبح مشبعة مع التغيرات في السعة العالية [كا ^{2 +]} _ط.

تثبيط انقباض عفوية

قد يكون خفض انقباض عفوية الأجهزة العضلات الملساء عقاقيري ، مثل حظر حركة كا ^{2 +} من خلال نوع L - كا ^{2 +} قنوات (مثلا : النيفيديبين ³ ؛ ديلتيازيم ^4). علما أن هذه الأدوية سوف يقلل كثيرا من سعة كامل الخلية كا ^{2 +} ومضات / العابرين.

تقلص الأسهر النتائج من مزيج من النقل العصبي في المقام الأول وpurinergic noradrenergic. تنسيق كا ^{2 +} العابرين في هذه الأنسجة ، ولكن ، حساسة للحصار مستقبلات noradrenergic (مثلا α ₁ الأدرينية ، التي برازوسين ⁵⁾ حتى يمكن تقليل الحركة دون أن يؤثر ذلك التنسيق كا ^{2 +} العابرين.

بدلا من ذلك ، قد يتم منع الانكماش 'المصب' عن طريق تثبيط ضوء سلسلة الميوسين مثل كيناز بواسطة wortmannin ^6.

الاستنتاجات

رصد كا ^{2 +} مضان في القرار submicron هي تقنية قوية لدراسة آثار ما بعد الإفراج صلي ^5،7 العصبي ، والإفراج عن كا ^{2 +} من مخازن الداخلية (مثل "الشرارات" ^8). تحليل كا ^{2 +} العابرين باستخدام المنهجية المذكورة هنا هي فعالة من حيث التكلفة مقارنة المتاحة تجاريا حزم ويسمح تحليل الصور مصممة خصيصا من خلال تحليل الإضافات جافا مخصصة لكتابة ImageJ.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning