Ca focale 2 + Détection de transitoires dans le muscle lisse

Résumé

Détails des méthodes à haute résolution Ca ^{2 + des muscles lisses au sein des organes isolés, notamment: la préparation des tissus, d'acquisition d'images et l'analyse des données.}

Résumé

Ca ^{2 +} imagerie des cellules musculaires lisses permet de mieux comprendre les mécanismes cellulaires qui peuvent ne pas entraîner des modifications du potentiel de membrane, comme la libération de Ca ^{2 +} dans les magasins internes, et permet de multiples cellules d'être surveillés simultanément afin d'évaluer, par exemple, de couplage en tissus syncytial. Subcellulaire Ca ^{2 +} transitoires sont fréquentes dans le muscle lisse, mais sont difficiles à mesurer avec précision en raison des problèmes causés par leur occurrence stochastiques, sur un champ souvent de vue large, dans un organe qui le prédispose à se contracter. Pour surmonter ce problème, nous avons développé une série de protocoles d'imagerie et des routines d'analyse d'acquérir, puis d'analyser, de façon automatisée, la fréquence, la localisation et l'amplitude de ces événements. Bien que cette approche peut être appliquée dans d'autres contextes, notre propre travail implique la détection des locaux purinergiques Ca ^{2 +} transitoires pour localiser la libération du transmetteur avec une résolution inférieure au micron.

ATP est libéré comme un cotransmitter de nerfs autonomes, où il se lie à des récepteurs P2X1 sur le muscle lisse du détrusor et le canal déférent. Ca ^{2 +} entre dans le muscle lisse, résultant en purinergiques neuroeffecteurs Ca ^{2 +} transitoires (NSTI). La focale de Ca ^{2 +} transitoires permettent le suivi optique de la libération du neurotransmetteur d'une manière qui a de nombreux avantages sur l'électrophysiologie. En dehors de la résolution spatiale améliorée grandement, enregistrement optique a l'avantage supplémentaire de permettre l'enregistrement de la libération du transmetteur de nombreux sites distincts simultanément. Par ailleurs, le plan optique de focalisation est plus facile de maintenir ou de corriger lors de la série enregistrement long que ce qui est le repositionnement d'une microélectrode intracellulaire forte.

En résumé, une méthode pour l'imagerie de Ca ^{2 +} fluorescence est décrite qui détaille la préparation des tissus, et l'acquisition et l'analyse des données. Nous décrivons l'utilisation de plusieurs scripts pour l'analyse de ces Ca ^{2 +} transitoires.

Protocole

Partie 1: Préparation de l'indicateur de Ca ^{2 +} (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM)

1. Oregon Green 488 BAPTA-1 est livré dans les AM 500 flacons ul comme une petite quantité (50 g) de poudre. Ajouter 40 ul Pluronic F-127 solution à la poudre, en agitant doucement pendant 30 s, puis ajouter 460 ul PSS, et agiter doucement pendant 30 s. La solution finale, 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-une heures, fournit 4 x 125 aliquotes. Eviter l'exposition à la lumière et conserver à -20 ° C.

Partie 2: Ca ^{2 +} de chargement

1. Retirer l'indicateur de Ca ^{2 +} (Oregon Green 488 BAPTA-1 AM) du congélateur (-20 ° C) et laisser décongeler à température ambiante.
2. Prélever 1 ml de PSS dans une éprouvette et placer dans un bain-marie. Bubble avec 95% ₂ / 5% CO ₂ à un taux d'environ 1 bulle apparaissant par seconde O. Le bulleur doit être garanti dans le tube à essai, par exemple avec un bouchon ou avec du parafilm.
3. Disséquer les tissus de l'animal et, dans un plat Sylgard bordées de Petri, retirez soigneusement le tissu conjonctif. Indépendamment du type de muscle lisse d'orgue, PSS doit être remplacée toutes les 10 minutes et les tissus doivent être bien lavés (par exemple en remplaçant les trois PSS fois) la dissection suivante. Pour le canal déférent: envisager de couper l'organe longueur des façons de produire une feuille de tissu. Pour la vessie: ouvert longitudinalement du col de la vessie (postérieure) au sommet de la coupole (antérieure). Préparez quatre bandes, 6 - 8 mm de long et 1 - 2 mm de large, le long de la surface dorsale du détrusor, la coupe dans le sens des faisceaux musculaires dominante.
4. Placer le tissu disséqué dans le «pré-chauffée et buller" PSS.
5. Ajouter 125 ul de 10 uM Oregon Green 488 BAPTA-1 h à l'éprouvette et de donner une petite secousse, à la main, à se mélanger.
6. Reprendre bouillonnant et des congés, recouverts d'une feuille. Le temps est nécessaire pour un tissu suffisante pour relever le Ca ^{2 +} indicateur varie avec la taille du tissu et de l'épaisseur de la couche musculaire lisse. Par exemple: 70 minutes (souris détrusor, anococcygeus rat) à 120 minutes (détrusor chez le rat, la souris vas déférent).

Partie 3: Préparation du "Ca ^{2 +} chargés 'de tissus pour la microscopie

Attention épinglant des tissus est nécessaire afin de minimiser le mouvement spontané des tissus (une propriété de l'imagerie des cellules musculaires lisses du tissu relativement intacte) et de faciliter la localisation d'un site approprié pour l'imagerie (comme un morceau plat de tissu peut être interrogés en deux dimensions, plutôt que trois).

1. Rincez le tissu dans PSS buller pendant au moins 5 minutes.
2. Mont préparation dans un plat Sylgard-alignés, étirement des tissus (un peu) pour former une feuille plate. Évitez d'utiliser des longues "broches" qui peuvent rayer l'objectif, utiliser des longueurs courtes au lieu de 25-50 um de diamètre du fil d'argent comme «broches» et d'insérer à un angle.
3. Placez le plat de préparation sur la platine du microscope, en prenant soin de s'assurer que le PSS ne s'échappe pas de la zone de Sylgard-alignés de l'antenne (comme cela peut conduire à une grande surface étant couverte de PSS, lorsque la surfusion commence).
4. Mettez la pompe en vue de la préparation avec superfuse PSS. Un taux de 100 ml par heure est souvent employé.
5. Allumez l'unité de chauffage.
6. Placer les tubes entrées et de sorties et de la sonde de température sur le plat de préparation (apposition chacun à la bande de métal par l'aimant sur sa base). La hauteur de la pointe du tube d'écoulement va déterminer la profondeur de la PSS. Soyez attentif à ce que la sortie est en fait enlever PSS (comme il le fait parfois pas initialement).
7. Réglez la température sur l'unité de chauffage pour atteindre la température désirée, par exemple de 33 à 35 C.
8. Autoriser le tissu à s'équilibrer pendant au moins 10 minutes.

Partie 4: Choix du site à l'image

L'exposition à l'éclairage d'excitation sera photobleach l'indicateur, afin d'éviter en utilisant plus de quelques secondes à la fois.

1. Avec un objectif de faible puissance (10x ou 20x) utilisent épifluorescence, excitant avec une lumière bleue, pour voir les muscles lisses et d'identifier une région appropriée pour surveiller. Essayez de choisir un site basé sur: le mouvement (qui devrait être minime) et le nombre de cellules musculaires lisses dans le domaine. «Structures» lumineux peuvent provoquer un nombre élevé de «faux positifs» dans l'algorithme de détection d'images, afin d'éviter les sites avec un grand nombre de (ex) entrecoupées cellules épithéliales ou des fibroblastes.
2. Basculer vers un objectif de puissance plus élevée (40x).
3. Tourner la scène ou de l'axe optique afin de la cellule musculaire lisse (s) se trouve horizontale (c'est à dire parallèle à l'axe de balayage rapide).

Partie 5: La microscopie confocale

Les détails de la façon dont le microscope confocal est "mis en place» sont spécifiques à chaque type de microscope, maisles principales considérations sont les suivantes: vitesse (minimum de 5 Hz est requis pour la plupart de Ca ^{2 +} transitoires), la résolution et la taille du terrain (qui sont tous deux négociés-off avec la vitesse). Certains le protocole suivant est spécifique à un Leica SP2 microscope confocal debout. Un protocole typique est le suivant: série 100 châssis, acquise à 5 Hz (256 x 256 pixels; environ 100 x 100 um.) Ou 13,5 Hz (256 x 64 pixels; environ 100 x 25 um.). La tête de balayage mis à déplacer bi-directionnelle (pour maximiser la vitesse d'acquisition) et d'acquérir à 1000 Hz par ligne.

1. Fermer le sténopé à un «disque d'Airy.
2. Réglez le laser (488 nm) de puissance entre 25 et 35% sur la AOTF; cette valeur est un compromis entre luminosité et photoblanchiment. (Ce dernier étant un problème particulier lors de longs enregistrements.)
3. L'acquisition de six séries par site, et de quatre à six sites par «traitement». Il est commun de viser à surveiller les six mêmes sites pré-drogue («contrôle» par exemple) et post-drogue, bien photoblanchiment importantes peut causer l'expérimentateur de s'écarter de cette.
4. Il est essentiel de Ca ^{2 +} imagerie que «les contrôles de temps" sont effectuées.

Partie 6: Préparation pour l'analyse

1. Téléchargez et installez Image J à partir de: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html. Télécharger la version spécifique à la plateforme, puis mise à jour de la dernière version en téléchargeant le dernier fichier à partir imageJ.jar http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar, remplacer l'ancien fichier. Utilisateurs d'Apple Mac: si elle tourne lentement, assurez-vous d'utiliser la dernière version de la machine virtuelle Java (JVM) disponibles auprès d'Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/).
2. Télécharger Excel_writer.jar à partir de: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html et installer dans les plugins [répertoire] répertoire jar>.
3. Copiez les fichiers suivants dans le répertoire plugins: Leica_SP2_Stacker.class; JNCT0.08Release.ijm. Installez chacun de ces scripts en utilisant les plugins [Menu]> Macros> Installer ... en fonction de ImageJ.
4. Nous utilisons un Leica SP2 microscope confocal, le logiciel (Leica LCS) pour ce qui génère chaque série comme un seul visible «film» dans le logiciel, mais enregistre en tant que cadres individuels. Pour reconstituer les cadres en série: (i) Assurez-vous que tous les «cadres» pour être reconstruits sont dans un seul dossier (par exemple «DataFolder> Tiffs '). (Ii) Sélectionnez Plugins [Menu]> Macros> Leica_SP2_Stacker. Sélectionnez le répertoire racine (par exemple «DataFolder '). Sélectionnez le dossier désiré dans la liste déroulante ('Tiffs /' par exemple). Sélectionnez un répertoire de sortie ou de générer un nouveau («DataFolder> Stacks», par exemple). Le script va ensuite reconstruire la série d'images individuelles.

Partie 7: Correction pour le mouvement

Bien que le mouvement du site imagées peuvent être minimisés par une bonne épinglage et tissus uniformément tendu, certains organes des muscles lisses présentent des contractions spontanées qui ne peuvent être abolis par une surveillance attentive épinglant seul. Nous décrivons ici l'utilisation d'un algorithme librement disponible qui aligne les cadres ou des allumettes dans une série.

1. Télécharger 'StackReg »(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) et« TurboReg »(http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/).
2. Installez chaque dans le répertoire plugins en utilisant les plugins> Macros> Installer ...
3. Chargez une pile à traiter (Fichier> Ouvrir ...) et ensuite passer à un cadre qui montre clairement le champ d'intérêt. Les autres images seront alignées à ce cadre de référence.
4. Plugins> Piles> StackReg. Essayez chacune des différentes «transformations» (Traduction c'est-à-corps rigide, Rotation Scaled, Affine) afin de déterminer quelle est la plus efficace. (Plus de détails: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)

Partie 8: algorithme de détection de particules

Pour chaque «site» imagées, les facteurs qui affectent varier la détection de Ca ^{2 +} transitoires. En mesurant certaines propriétés de chaque site («paramètres des particules - détaillées ci-dessous), le processus de détection est facilitée. Ainsi, pour chaque site, on calcule «seuil pour soustraire», «le seuil pour le ratio" et "seuil de bord de cellule».

1. Plugins [Menu]> Macros> Installer ... et sélectionner 'JNCT0.08Release.ijm ».
2. Plugins [Menu]> Macros pile de charge> (raccourci: l). Sélectionnez une série de paramètres et de calculer des particules:
   1. a. Seuil pour soustraire (fond =)
3. Sélectionner un ROI rectangulaire sur ce que vous croyez être «de fond».
4. Mesure (raccourci: M). Notez MOYENNE.
   1. b. Calcul du seuil pour le ratio
5. Sélectionnez une forme rectangulaireROI autour d'une zone optiquement plane de la cellule (s).
6. Mesure (raccourci: M). Remarque ÉCART bas moyenne et standard.
7. Répéter encore deux fois ou vous pouvez dessiner trois boîtes à la fois en appuyant sur 'shift'.
8. Calculez et notez le seuil pour le ratio = (1 + SD / moyenne) x 32, avec une moyenne des valeurs de la trois répétitions / sites.
   1. C. Seuil de bord cellulaire
9. Image> Stacks> Z projet ... Choisissez le type de projection: «intensité moyenne"
10. Image> Réglages> Seuil.
11. Sélectionnez noir et blanc.
12. Définir 'sous' (curseur supérieur) limiter et noter la valeur correspondante (à droite du curseur). Seuls les événements survenant dans les régions noires seront comptés.
13. Cliquez sur 'reset'.
14. Analyser les piles (raccourci: 2)
15. Sélectionnez simplement une série à ce stade, à savoir le «premier fichier» et «le dernier fichier" devrait être le même.
16. Entrez les valeurs de «seuil de soustraire», «le seuil pour le ratio" et "seuil de bord de cellule». Laissez les autres paramètres à leurs valeurs par défaut.
17. L'algorithme va produire une fenêtre à double volet, dans lequel la série traitée est indiqué sur la gauche et l'original sur la droite. Soigneusement passer par ce afin d'évaluer le nombre de faux positifs et les occasions où les événements, visibles à l'œil, n'ont pas été détectés. Pour obtenir une détection plus précise de Ca ^{2 +} transitoires, il peut être nécessaire d'ajuster légèrement certains des 'paramètres des particules ». Bien que le processus peut sembler un peu «à l'aveuglette» sur la première tentative, on obtient rapidement une sensation de ce que les paramètres sont essentiels.
18. Pour chaque série, l'algorithme génère un fichier Excel que les caractéristiques des détails sur l'événement détecté (comme l'amplitude, la superficie et position). «Faux positifs» - identifié en examinant les fichiers image que les sorties algorithme (par exemple 8,17 étape) - peuvent être retirés, à la main, à partir de ce fichier Excel.

Discussion

Choix de fluorescence de Ca ^{2 +} indicateur de

Oregon Green 488 BAPTA-1 AM a été choisi comme le Ca ^{2 +} indicateur parce qu'il (i) est lumineux par rapport à d'autres indicateurs (par exemple, Fluo-4 et Green calcium) ^1, (ii) est sensible à des changements physiologiques dans ^{concentration} de Ca2 ⁺ avec un _Kd d'une ampleur similaire à ^l'une intracellulaire de Ca ^{2 +} concentration [Ca ^{2 +]} i (par exemple des canaux déférents ^2), (iii) les charges de nombreuses cellules musculaires lisses, cellules musculaires lisses permettant couplage à être surveillés. Toutefois, Oregon Green 488 BAPTA-1 AM est un non-ratioable Ca ^{2 +} indicateur, et en tant que tels ne peuvent pas facilement être utilisés pour déterminer l'absolu [Ca ^{2 +]} _i. Par ailleurs, il peut également tampon de Ca ^{2 +} s'ils sont présents à des concentrations élevées et devient saturé avec des changements de grande amplitude dans [Ca ^{2 +]} _i.

L'inhibition de la contractilité spontanée

La contractilité spontanée des organes musculaires lisses peut être réduite pharmacologiquement, par exemple en bloquant le déplacement de Ca ^{2 +} par le biais de type L canaux Ca ^{2 +} (par exemple: la nifédipine ^3; diltiazem ^4). Notez que ces médicaments permettra de réduire considérablement l'amplitude de la cellule entière de Ca ^{2 +} flashs / transitoires.

La contraction du canal déférent résulte d'une combinaison de la neurotransmission surtout purinergiques et noradrénergiques. Focale de Ca ^{2 +} transitoires dans ce tissu sont, cependant, insensible aux blocage des récepteurs noradrénergiques (par exemple α ₁ adrénergiques, par la prazosine ⁵⁾ afin circulation peut être réduit sans affecter focale Ca ^{2 +} transitoires.

Alternativement, la contraction peut être empêché «en aval» par l'inhibition de la lumière par exemple la chaîne de myosine kinase par wortmannine ^6.

Conclusions

Surveillance de Ca ^{2 +} de fluorescence à résolution submicronique est une technique puissante pour étudier les effets de post-jonctionnelle libération des neurotransmetteurs ^5,7 et la libération de Ca ^{2 +} dans les magasins internes (par exemple «étincelles» ^8). L'analyse de Ca ^{2 +} transitoires en utilisant la méthodologie décrite ici est rentable par rapport aux paquets disponibles dans le commerce d'analyse d'image et permet l'analyse sur-mesure grâce à des plugins Java personnalisé écrit pour ImageJ.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oregon Green 488 BAPTA-1 AM	Invitrogen	O6807	10 x 50 μg
Pluronic F-127 solution	Invitrogen	P3000MP	20% solution in DMSO
Leica SP2 upright confocal microscope	Leica Microsystems
Air table (‘vibration isolated workstation’)	Newport Corp.	M-VW-3046-OPT-012140
Sylgard 184 elastomer	Dow Corning