Undecalcified العظام لإعداد الأنسجة ، وتحليل Histomorphometry ملون تألقي

Summary

Undecalcified الأنسجة العظام يوفر معلومات هامة لمجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. فإنه يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها.

Abstract

Undecalcified الأنسجة العظمية يوضح الهيكل الصغير للعظم. ويعرض كل من المكونات المعدنية للعظم والخلوية ، التي توفر معلومات حيوية عن دوران العظم أو تكوين العظام وارتشاف. هذا له أهمية كبيرة في مجموعة متنوعة من التطبيقات السريرية والبحوث. أنها تعود الصور الجميلة ⁽¹⁾ ويسمح لتقنيات مثل تقييم ملون تألقي وhistomorphometry ^2. ملون تألقي التحليل هو تقنية حيث يتم حقن الأصباغ الفلورية التي تربط إلى الكالسيوم في نقطة زمنية معينة ، والذي يسمح لتقدير حجم كمية تمعدن في ذلك الوقت بعينه. Histomorphometry هو عملية تقدير العظام على المستوى المجهري.

أداء undecalcified الأنسجة العظمية يمثل تحديا تقنيا ، لا سيما مع عينات كبيرة الحجم. فهي تتطلب تغييرات في أسلوب من تلك المستخدمة في البارافين القياسية جزءا لا يتجزأ من الأنسجة. هذا الفيديو يوضح عملية إنتاج المقاطع ذات نوعية جيدة ويدل على الصعوبات التقنية والأساليب التي للتغلب عليها. وتتحقق إعداد العينات ، وتجهيز مع تثبيت بطريقة مماثلة لغيرها من الأنسجة اللينة ، ولكن نظرا لكثافة وأقل نفاذية للعظم كبير تعد مطلوبة تثبيت وتجهيز مرات ، مع الأخذ في كثير من الأحيان عدة أسابيع. ويتم تحقيق دمج باستخدام وسيلة دعم مماثل مع صلابة وكثافة أو يساوي حتى العظم مثل ميتاكريليت مقرها راتنجات ، ولكن خلافا تسلل البارافين والتضمين ، وهذا هو خطوة لا رجعة فيها. لا يمكن أن يتحقق عن طريق طحن Sectioning التي تنتج أكثر سمكا المقطع ، الذي هو الأمثل لمثل هذه الدراسات والتحليل ملون تألقي. هو أفضل طريقة لتحقيق ذلك باستخدام شفرة الماس على macrotome. بدلا من ذلك ، يمكن أن تنتج أرق أقسام للالمجهر الضوئي ويتحقق هذا باستخدام مشراح تمزلج بشفرة حادة جدا. ومشراح تمزلج يوفر قوة إضافية والاستقرار المطلوبة لكتل ​​كبيرة وصعبة. يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ من المقاطع ملون الراتنج مع مجموعة متنوعة من البقع ، والتي أظهرت.

Protocol

1. يوضع النسيج في حاوية مغلقة تحتوي على الفوسفات بنسبة 10 ٪ مخزنة حل الفورمالين ^3. ضمان الحد الأدنى من التعرض للضوء ، وإذا كان التحليل هو ملون تألقي التي يتعين القيام بها ، كما fluorochromes خفيفة حساسة.
2. تحديد أي اتجاه من النسيج ستكون مطلوبة.
3. تقليم لحجم العينة ، في الاتجاه الصحيح ، وذلك باستخدام الموجات رأى. وانضمت لضمان اجراءات السلامة. ثم يتم وضع العينة في وعاء غير شفاف ، يجب أن يكون حجم منها ما يقرب من عشرة أضعاف حجم العينة الكافي لتحقيق التثبيت. وينبغي أن العينة البقاء في حل ما مجموعه الفورمالين بين واحد وأسبوعين اعتمادا على حجمها. يقترح استخدام أنسجة السيطرة لأغراض الاختبار والتحسين.
4. فحص الأنسجة يصب في قالب دمج ومكان النسيج في وعاء غير شفاف مختومة تحتوي على الايثانول 70 ٪.
5. عملية النسيج في الصعود تركيزات الإيثانول ، التدريع من الضوء وتحت تحريض مستمر.
   1. 70 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع
   2. 80 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع
   3. 90 ٪ من الإيثانول 1 أسبوع
   4. 100 ٪ الايثانول 1 أسبوع
6. ثم يتم مسح النسيج في لبيوتانول 1 أسبوع ، التدريع مرة أخرى من الضوء وتحت تحريض مستمر.
7. يجب أن تكون كثافة العظم الراتنج والمتطابقة عن كثب ، ويمكن تغيير كثافة الراتنج (راجع الخطوة 8) ونحن نوصي تضمين عينة الاختبار الأول لضمان كثافة الصحيح. نستخدم Technovit 7100 (هيراوس Kulzer) للفحص المجهري والتحليل ضوء ملون تألقي. يجب إذا كان مطلوبا المناعية يمكن استخدام الراتنج بديلة مثل Technovit 9100 (هيراوس Kulzer).
8. قد تكون مختلطة الحل Technovit 7100 مع إعداد aliquots صغير من الحل تليين المتوفرة مع هذه المجموعة ، إذا كان ذلك مطلوبا ، ولكن بما لا يزيد عن 5 ٪ من حجم الحل الإعداد ؛ في تجربتنا هو مطلوب نادرا ما الحل تلين. تختلط أجزاء متساوية من الإيثانول المطلق وقاعدة Technovit السائل 7100 وتطبيقه على أنسجة كحل قبل التسلل لمدة 24 ساعة والحد من التعرض للضوء مع الانفعالات.
9. ومن ثم أدلى به حتى حل تسلل 1 تصليب ز الأول (= 1 كيس) وهو يذوب في 100 مل السائل القاعدة. يستبدل هذا الحل قبل التسلل ، ويسمح للتسلل ل1 أسبوع تحت التحريض المستمر.
10. مكان النسيج في القالب ، مع خفض سطح الوجه. ضمان وجود هامش (من الناحية المثالية لا يقل عن 5 ملليمترات) حول الأنسجة لالراتنج ، وهذا يضمن قوة الكتلة. مزيج من محلول 15mls Technovit إعداد 7100 مع 1 مل من الثانية تصليب وتصب حول العينة في القالب ، وتغطي ما لا يقل عن 5 millimietres. وسوف تبدأ المعالجة في غضون 2 ساعة ، ولكن سوف يكون كاملا بين عشية وضحاها.
11. ثم يتم تنفيذ متصاعدة من جانب تشكيل كتلة دعم استخدام Technovit 3040 (هيراوس Kulzer). مزيج Technovit 3040 في نسبة حجم 2 أجزاء مسحوق السائل إلى الجزء 1 للحصول على السائل اللزج. صب Technovit 3040 في عطلة في الجزء الخلفي من كتلة الى مستوى لا يقل عن 2 مم فوق قاعدة الكتلة. ويمكن بعد حوالي 10 دقائق يكون مقشر العفن بعيدا وكتلة جاهزة.
12. كثافة وبالتالي خصائص القطع من راتنج ميتاكريليت عرضة للرطوبة الجو المحيط في الغرفة. ولذلك ينبغي أن تكون القطع المخزنة في dessicator.
13. sectioning الأرض تنتج أكبر أقسام بين 20-50 ميكرومتر في السمك. ومن المفيد للتحليل ملون تألقي (أنظر أدناه) ، وتنتج أكثر إشراقا أقسام سمكا مضان. تأمين شفرة الماس لmacrotome. إضافة مواد التشحيم ، مثل روح النفط الى الخزان على macrotome. تأمين كتلة في المشبك وتوجيه إلى النصل. السماح لطحن تحدث ببطء (حوالي 20-30 دقيقة لكل قسم) ضمان تزييت كاف. القسم الأول يعرض وجه القطع ويرشد المقطع يجب أن يكون التخلص منها.
14. ثم يتم وضع المقطع التالي على شريحة Superfrost بلس. المقطع لديه ميل لحليقة لذا ننصح بوضع جزء من كيس ساندويتش وعقد أكثر من ذلك ثم انها مسطحة مع شريحة أخرى علقت في المكان. ثم يوضع في حاضنة بين 60-80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. هذا يخفف من ميتاكريليت ويساعد القسم التمسك الشريحة بطريقة مسطحة.
15. قد يكون تنظيف الأرض المقطع والمصقول على النحو المطلوب باستخدام الصنفرة غرامة الحصباء بأسلوب لطيف.
16. ومشراح تمزلج خفض الشرائح الرقيقة ، والذي يوفر أفضل المقاطع لmicrosocopy الخفيفة. استخدام مشراح تمزلج كما زاد صلابة ، وهو الأمر المطلوب لقطع هذه الكتل الصلبة. بدلا من ذلك يمكن استخدام مشراح بالطاقة الدوارة. استخدام شفرة حادة من الصلب المقاوم للصدأ. فمن الأفضل أن يكون اثنين من ريش متوفرة كما يمكن شحذ واحد كما في غيرها من يستخدم. ينبغي أن تجعل شفرة زاوية 45 درجة مع الكتلة. سولا يمكن أن يتحقق من خلال تطبيق rface تليين ورقة مبللة إلى كتلة إذا لزم الأمر. قد يستغرق عدة أقسام لتحقيق الشروط المطلوبة للحصول على قطع قسم الجودة. ومن ثم طرح الجزء المتعلق حمام ماء وتوضع على شريحة كما في 16 أعلاه.
17. وترد في المواد الكاشفة تلطيخ أدناه. وتستند البروتوكولات المتعلقة بانكروفت ⁴ آخرون. نظرا لاختلاف سماكة فمن المستحسن لتحسين البقع على شرائح الاختبار. قد تسبب تلطيخ رف الأنسجة لتطفو قبالة الشريحة حتى البقع مباشرة إضافة إلى شريحة المسطحة قد تكون مطلوبة. بروتوكول مطابقة أو تلطيخ الرف هو ضروري من أجل تحقيق نتائج متسقة اللازمة لتلطيخ histomorphometry.
    1. وHaematoxylin يوزين
       1. وصمة عار مع 5-10 دقائق Haematoxyilin
       2. يغسل جيدا بماء الصنبور سكوت ق
       3. وصمة عار مع 5 دقائق يوزين
       4. تغسل في ماء الصنبور
       5. واضح في الزيلين
       6. جبل
       7. النتائج
          1. عظماني = الوردي
          2. متكلسة العظم = البني الأرجواني
          3. النوى = زرقاء
    2. فون كوسا
       1. مكان في محلول نترات الفضة وفضح لضوء قوي حتى العظم المعدنية سوداء (حوالي 10 دقيقة)
       2. تغسل في ماء مقطر ثلاث مرات
       3. التهديد مع ثيوسلفات الصوديوم لمدة 5 دقائق
       4. تغسل في ماء مقطر
       5. ملون مباين مع O Safrinin
       6. واضح في الزيلين
       7. جبل
       8. النتائج
          1. عظم Mineralised = أسود
          2. عظماني = أحمر / وردي
    3. ماسون Goldner ق ثلاثي الألوان
       1. يغسل مع الكحول القلوية (90mls من الايثانول 80 ٪ من الأمونيا و10mls 25 ٪ لمدة 20 دقيقة)
       2. شطف في الماء
       3. شطف في الماء المقطر
       4. وصمة عار مع Haematoxylin Weigert ليالي لمدة 10 دقائق
       5. شطف في الماء المقطر
       6. وصمة عار مع الحل النهائي الشقائقية فوكسين - 5 دقائق
       7. التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 15 ثانية
       8. وصمة عار في الفسفومولبديك 5 دقائق حمض البرتقال حل G
       9. التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 15 ثانية
       10. وصمة عار مع الضوء الأخضر 5 دقائق
       11. التشطيف مع حمض الخليك 1 ٪ 3 التغييرات
       12. شطف في الماء المقطر
       13. جبل
       14. النتائج
           1. عظم Mineralised = أخضر
           2. عظماني = أحمر / برتقالي
           3. النوى = الأزرق والرمادي
           4. الغضروف = الأرجواني
18. ملون تألقي التحضير :
19. تدار من قبل هذه الحقن في الوريد ببطء ، على الأقل اسبوعين إربا.
20. جرعات
    1. Calcein الخضراء 10 ملغ / كغ الرابع
    2. أكسي تتراسكلين 50 ملغم / كغم الرابع
    3. الأليزارين Complexone 30 ملغ / كغ الرابع
21. إعداد الأخضر Calcein
    1. ومعاير غرام واحد من الأخضر Calcein مع هيدروكسيد الصوديوم حتى 1 M المنحل.
    2. ويتم تعديل درجة الحموضة مع هيدروكسيد الصوديوم حتى 1 ٪ = 7،1-7،2 درجة الحموضة.
    3. التصفية والحفاظ على محمية من الضوء
22. إعداد Complexone الأليزارين
    1. ومعاير ثلاثة غرامات من هيدروكسيد الصوديوم مع complexone الآليزارين M 1 حتى المنحل.
    2. ثم يتم تعديل درجة الحموضة مع حمض الهيدروكلوريك هيدروكسيد الصوديوم 1 ٪ أو حتى درجة الحموضة = 7،1-7،2.
    3. التصفية والحفاظ على محمية من الضوء
23. إعداد أكسي تتراسكلين
    1. أكسي تتراسكلين يتوفر كما عقار مضاد للميكروبات من على الرف. لا يلزم الإعداد.

Materials

أ) حل Hemotoxylin
Hemotoxylin	1G
الكحول المطلق	100ML
ب) الحديد الحل
30 ٪ كلوريد الحديديك المائي	4mL
حمض الهيدروكلوريك (تركيز)	1mL
الماء المقطر	95mL

أ) حل الشقائقية دي زايليدين
الشقائقية دي زايليدين	0.75g
حمض fuchsion	0.25g
حمض الخليك	1mL
المزيج ، وإضافة الماء المقطر (100ML)
ب) حل azophloxin
Azophloxin	0.5g
حامض الخليك	0.6mL
المزيج ، وإضافة الماء المقطر (100ML)
ج) العمل النهائية حل صمة عار
الشقائقية - فوكسين الحل	5 - 10ML
Azophloxin	2mL
0.2 ٪ محلول حمض الخليك	88mL

الضوء الأخضر	1G
حامض الخليك	1mL
المزيج ، وإضافة الماء المقطر (500mL)

حمض الفسفومولبديك	3G
البرتقالي G	2G
تذوب في الماء المقطر 500ml من الثيمول وإضافة الكريستال.

مائي 1 ٪ نترات الفضة

ثيوسلفات الصوديوم 2.5 ٪

1 ٪ safranin O

زرقة الألسيان 8GX	1G
3 ٪ من محلول حمض الخليك	100ML

أ) هاريس hemotoxylin
Hemotoxylin	2.5G
كحول مطلق	25mL
البوتاسيوم الشب	50G
الماء المقطر	500mL
أكسيد الزئبق	1.25g OR
يودات الصوديوم	0.5g
الجليدية حمض الخليك	20mL
ب) حل يوزين
وقد استخدم يوزين المنتجة تجاريا.

الصانع	ملون تألقي	رقم كتالوج
سيغما الدريخ ، سيدني	Calcein الخضراء	C0875
سيغما الدريخ ، سيدني	الأليزارين Complexone	A3882
إنترفيت استراليا وفيكتوريا	أكسي تتراسكلين (قبالة الجرف المخدرات المضادة للميكروبات)	الاسم التجاري ؛ Engemycin 100