Preparación ósea descalcificados para histología, histomorfometría y Análisis Fluorocromo

Resumen

Histología ósea descalcificados proporciona información importante para una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Es un desafío técnico, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos.

Resumen

Histología ósea descalcificados demuestra la microarquitectura del hueso. Muestra tanto los componentes mineralizados y celular del hueso, que proporciona información vital sobre el recambio óseo o formación y resorción ósea. Esto tiene una importancia enorme en una variedad de aplicaciones clínicas y de investigación. Se produce bellas imágenes ¹ y permite técnicas tales como la evaluación y el fluorocromo histomorfometría ^2. Análisis fluorocromo es una técnica donde los tintes fluorescentes que se unen al calcio se inyectan en un momento determinado punto, lo que permite la cuantificación de la cantidad de mineralización en ese momento dado. Histomorfometría es un proceso de cuantificación de hueso a nivel microscópico.

Realización de la histología del hueso descalcificados es técnicamente difícil, sobre todo con ejemplares de gran tamaño. Se requiere de variaciones en la técnica de los utilizados en parafina estándar integrado histología. Este vídeo muestra el proceso de producción de las secciones de buena calidad y demuestra las dificultades técnicas y métodos con los que para superarlos. La preparación de muestras, fijación y el procesamiento se obtienen con una forma similar a otros tejidos blandos, sin embargo debido a la densidad y baja permeabilidad de los huesos mucho más tiempo de fijación y los tiempos de procesamiento se requieren, a menudo tomando durante varias semanas. Incrustación se logra utilizando un medio de soporte con una dureza similar o igual y la densidad de los huesos, tales como resinas basadas en metacrilato, pero a diferencia de la infiltración de parafina y la inclusión, este es un paso irreversible. Seccionamiento se puede lograr mediante molienda que produce una sección más gruesa, lo cual es óptimo para los estudios como el análisis de fluorocromo. Esto se logra mejor usando una cuchilla de diamante en una macrotome. Por otra parte, las secciones más finas pueden ser producidos por microscopía de luz y esto se logra utilizando un micrótomo de trineo con una cuchilla muy afilada. El microtomo trineo ofrece la mayor resistencia y estabilidad necesaria para los bloques grandes y duras. Resina incrustada secciones se pueden teñir con una variedad de manchas, que se demuestran.

Protocolo

1. El tejido se coloca en un recipiente sellado que contiene un 10% de tampón fosfato solución de formalina al ^3. Garantizar una mínima exposición a la luz, si el análisis fluorocromo se va a realizar, como los fluorocromos son sensibles a la luz.
2. Establecer que la orientación de los tejidos será necesario.
3. Desbastar la muestra con el tamaño, la orientación correcta, usando una sierra de cinta. Garantizar las medidas de seguridad se cumplen. La muestra se coloca en un recipiente opaco, el volumen de lo que debe ser de aproximadamente diez veces el tamaño de la muestra para lograr una adecuada fijación. El espécimen debe permanecer en la solución de formalina un total de entre una y dos semanas dependiendo de su tamaño. Se sugiere el uso de tejido de control para fines de prueba y optimización.
4. Compruebe que el tejido se ajusta al molde y coloque la incorporación de tejido en un recipiente sellado opaco que contiene 70% de etanol.
5. Proceso de tejido en forma ascendente las concentraciones de etanol, protección de la luz y con agitación constante.
   1. Etanol al 70% una semana
   2. Etanol al 80% una semana
   3. 90% de etanol 1 semana
   4. Etanol al 100% una semana
6. El tejido se borra en butanol durante 1 semana, de nuevo blindaje de la luz y con agitación constante.
7. La densidad de la resina y el hueso debe ser muy igualados. La densidad de la resina se puede modificar (consulte el paso 8) y se recomienda incorporar un primera muestra de análisis para asegurar la densidad correcta. Usamos Technovit 7100 (Heraeus Kulzer) para microscopía óptica y análisis fluorocromo. Si inmunohistoquímica se requiere una resina de alternativas debe ser utilizado como Technovit 9100 (Heraeus Kulzer).
8. La preparación de la solución Technovit 7100 puede ser mezclado con pequeñas partes alícuotas de la solución de ablandamiento suministrado con el kit, si es necesario, pero a no más de 5% el volumen de la preparación de la solución, en nuestra experiencia, la solución de ablandamiento es requerido en raras ocasiones. Partes iguales de etanol absoluto y Technovit base líquida de 7100 se mezclan y se aplica a los tejidos como una solución pre-infiltración durante 24 horas, se minimiza la exposición de luz y con agitación.
9. La solución de infiltración se hace entonces usando un endurecedor g I (= 1 bolsa) que se disuelve en 100 ml de líquido de base. Esto reemplaza la solución pre-infiltración y se le permite infiltrarse durante 1 semana en agitación constante.
10. Coloque el tejido en el molde, con la cara de superficie de corte hacia abajo. Asegurarse de que existe un margen (lo ideal es al menos 5 milímetros) en todo el tejido de la resina, lo que garantiza la fuerza del bloque. Mix 15mls de solución Technovit preparación 7100 con 1 ml de endurecedor II y verter alrededor de espécimen en el molde y se cubre por lo menos 5 millimietres. El curado se iniciará a las 2 horas, pero será completa durante la noche.
11. A continuación se realiza el montaje de configuración de un bloque de apoyo con Technovit 3040 (Heraeus Kulzer). Mix Technovit 3040 en una proporción de volumen de 2 partes de polvo por parte de líquido 1 para obtener un líquido viscoso. Vierta Technovit 3040 en el hueco en la parte posterior del bloque a un nivel de al menos 2 mm por encima de la base del bloque. Después de 10 minutos el molde puede ser desprendido y el bloque está listo.
12. La densidad y por lo tanto las propiedades de corte de resina de metacrilato son susceptibles a la humedad del ambiente en la habitación. Por lo tanto, los bloques deben ser almacenados en un desecador.
13. Seccionamiento del suelo produce grandes secciones de 20-50 micrómetros de espesor. Es útil para el análisis de fluorocromo (véase la sección siguiente) como las secciones más gruesas producen fluorescencia más brillante. Asegure la cuchilla de diamante para macrotome. Agregue lubricante, como el espíritu de petróleo a la reserva en el macrotome. Asegure el bloque de la pinza y orientar a la hoja. Permiten moler a ocurrir lentamente (aproximadamente 20-30 minutos por sección) asegurar una lubricación adecuada. La primera sección expone la cara de corte y orienta la sección-que debe ser desechada.
14. La siguiente sección se coloca en un portaobjetos Superfrost Plus. El tramo tiene una tendencia a enrollarse por lo que recomendamos colocar una porción de una bolsa de más de ella y luego mantenerla plana con otra diapositiva sujeta en su lugar. Luego se coloca en una incubadora de entre 60-80 grados Celsius durante 1 hora. Esto ablanda el metacrilato y ayuda a la sección de adherirse a la diapositiva de una manera plana.
15. La sección de la tierra puede ser limpiado y pulido de materiales mediante lija de grano fino de una manera suave.
16. El microtomo trineo cortes de secciones delgadas, que ofrece las mejores secciones de microsocopy luz. Use un microtomo trineo, ya que ha añadido la rigidez, lo que se requiere para el corte de los bloques duros. Alternativamente, un micrótomo rotatorio alimentado puede ser utilizado. Utilizar una cuchilla de acero inoxidable. Es preferible tener dos hojas a disposición como puede ser afiladas como el otro se usa. La hoja debe hacer un ángulo de 45 grados con el bloque. Suablandamiento rface se puede lograr mediante la aplicación de un papel mojado en el bloque si es necesario. Puede tomar varias secciones para lograr las condiciones de corte deseado para obtener una sección de calidad. La sección se presentó en ese entonces en un baño de agua y se coloca en una diapositiva como en el 16.
17. Reactivos de tinción se enumeran en los materiales a continuación. Protocolos se basan en ⁴ Bancroft et al. Debido a las variaciones de espesor se recomienda optimizar las manchas en los portaobjetos. Tinción bastidor puede causar que el tejido de flotar fuera de la diapositiva así que la adición de las manchas directamente a una compuerta plana puede ser requerida. Un protocolo idéntico o manchas bastidor es necesario para obtener resultados consistentes tinción necesarios para histomorfometría.
    1. Hematoxilina y eosina
       1. Mancha con Haematoxyilin 5-10 minutos
       2. Lavar bien con agua del grifo de Scott s
       3. Se tiñen con eosina 5 minutos
       4. Lavar con agua corriente
       5. Aclarar en xileno
       6. Montar
       7. Resultados
          1. Osteoide = rosa
          2. Hueso calcificado = marrón morado
          3. Núcleos = azul
    2. Von Kossa
       1. Lugar en la solución de nitrato de plata y exponer a la luz fuerte hasta que el hueso mineralizado se vuelve negro (aprox. 10 minutos)
       2. Lave con agua destilada tres veces
       3. Amenaza con tiosulfato de sodio durante 5 minutos
       4. Lave con agua destilada
       5. De contraste con Safrinin O
       6. Aclarar en xileno
       7. Montar
       8. Resultados
          1. Hueso mineralizado = negro
          2. Osteoide = rojo / rosado
    3. Masson Goldner s tricrómica
       1. Lavar con alcohol alcalina (90mls de etanol al 80% y 10ml de 25% de amoníaco durante 20 minutos)
       2. Enjuague con agua
       3. Enjuague con agua destilada
       4. Tinción con hematoxilina de Weigert s durante 10 minutos
       5. Enjuague con agua destilada
       6. Tinción con Ponceau-fucsina solución últimos 5 minutos
       7. Enjuague con 1% de ácido acético 15 segundos
       8. Mancha en fosfomolíbdico ácido-naranja solución G 5 minutos
       9. Enjuague con 1% de ácido acético 15 segundos
       10. Mancha con la luz verde 5 minutos
       11. Enjuague con 1% de ácido acético al 3 cambios
       12. Enjuague con agua destilada
       13. Montar
       14. Resultados
           1. Hueso mineralizado = verde
           2. Osteoide = rojo / naranja
           3. Núcleos = azul gris
           4. Cartílago = púrpura
18. Preparaciones fluorocromo:
19. Estos se administran por inyección intravenosa lenta, por lo menos dos semanas de diferencia.
20. Dosis
    1. Calceína Verde 10 mg / kg IV
    2. Oxitetraciclina 50 mg / kg IV
    3. Alizarina complexona 30 mg / kg IV
21. Preparación de calceína Verde
    1. Un gramo de calceína Verde se titula con NaOH 1 M hasta que se disuelva.
    2. pH se ajusta con un 1% NaOH hasta pH = 7.1-7.2.
    3. Filtro y mantener a salvo de la luz
22. Preparación de alizarina complexona
    1. Tres gramos de alizarina complexona se titula con NaOH 1 M hasta que se disuelva.
    2. pH se ajusta con un 1% HCl o NaOH hasta pH = 7.1-7.2.
    3. Filtro y mantener a salvo de la luz
23. Preparación de oxitetraciclina
    1. Oxitetraciclina está disponible como fuera de la plataforma anti-microbiana de drogas. No requiere preparación.

Materiales

a) hematoxilina solución
Hematoxilina	1g
El alcohol absoluto	100 ml
b) Solución de Hierro
30% de cloruro férrico acuoso	4 ml
El ácido clorhídrico (concentrado)	1 ml
agua destilada	95mL

a) Ponceau xilidina de solución
Ponceau de xilidina	0,75 g
ácido fuchsion	0,25 g
El ácido acético	1 ml
mezclar y añadir agua destilada (100 ml)
b) azophloxin solución
Azophloxin	0,5 g
El ácido acético	0,6 ml
mezclar y añadir agua destilada (100 ml)
c) Solución de trabajo de final de la mancha
Ponceau-fucsina solución	5-10mL
Azophloxin	2 ml
0,2% de solución de ácido acético	88mL

Luz verde	1g
ácido acético	1 ml
Mezclar y añadir agua destilada (500 ml)

Fosfomolíbdico ácido	3g
Orange G	2g
Se disuelven en 500 ml de agua destilada y añadir timol cristal.

1% de nitrato de plata acuoso

2,5% de tiosulfato de sodio

1% safranina O

Alcian blue 8GX	1g
3% de solución de ácido acético	100 ml

a) hematoxilina de Harris
Hematoxilina	2.5g
Alcohol absoluto	25 ml
Alumbre de potasio	50g
agua destilada	500 ml
óxido de mercurio	1,25 g O
El yodato de sodio	0,5 g
Ácido acético glacial	20 ml
b) Eosina solución
Eosina producidos comercialmente se utilizó.

Fabricante	Fluorocromo	Número de catálogo
Sigma-Aldrich, Sydney	Calceína Verde	C0875
Sigma-Aldrich, Sydney	Alizarina complexona	A3882
Intervet Australia, Victoria	Oxitetraciclina (De la droga útil a los antimicrobianos)	Nombre comercial; Engemycin 100