الحمض النووي القائم على تحديد الأنواع السمكية البروتوكول

Summary

هذا المنشور يصف كيفية استخدام الأنواع السمكية اجيلنت نظام تحديد الهوية لتحديد الأنواع من السمك عن طريق استخراج الحمض النووي وتنفيذ وتحليل PCR RFLP.

Abstract

قمنا بتطوير سريع ، وبسيط ، ودقيق طريقة الفرز المعتمدة على الحمض النووي للتعرف على أنواع الأسماك الموجودة في عينات من المأكولات البحرية الطازجة والمصنعة. هذا الأسلوب تنوعا توظف PCR التضخيم من الحمض النووي المستخرج من عينات الجينومية الأسماك ، يليها تحليل تقييد طول القطعة (RFLP) تعدد الأشكال لتوليد أنماط جزء لا يمكن حلها على Bioanalyzer 2100 اجيلنت ومطابقة لهذا النوع الصحيح باستخدام البرمجيات RFLP نمط مطابقة.

تحديد أسلوب يستخدم الأسماك وموثوق بها بسيطة ، وتدور العمود القائم على بروتوكول لعزل الحمض النووي من عينات الأسماك. تعامل مع عينات K بروتيناز للافراج عن الأحماض النووية في الحل. ثم يتم عزل الحمض النووي من خلال تعليق العينة في المخزن ملزمة وتحميلها على فنجان تدور الصغيرة المحتوية على الألياف مصفوفة السيليكا مقرا لها. والأحماض النووية في ربط نموذج لمصفوفة من الألياف. تغسل الأحماض النووية يجمد لإزالة الملوثات ، ويتم استرداد مجموع الحمض النووي في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر. عزل الحمض النووي مستعدة لتضخيم PCR مع الاشعال شريطة ربط تسلسل الجينوم وجدت في جميع الأسماك. يتم هضمها ثم المنتجات PCR مع ثلاثة انزيمات تقييد مختلفة وحلها على Bioanalyzer اجيلنت 2100. ويمكن استخدام جزء أطوال المنتجة في التفاعلات الهضم لتحديد الأنواع من الأسماك التي أعدت عينة من الحمض النووي ، وذلك باستخدام برامج التصفح نمط RFLP قاعدة بيانات تحتوي على أنماط RFLP تجريبيا المستمدة من أنواع الأسماك ذات الصلة تجاريا.

Protocol

1 : تحضير عينات من الأسماك لاستخراج الحمض النووي

1. لكل عينة لفحصها الأسماك ، ضع قطعة من نسيج السمكة التي تزن ما بين 10 ملغ و 1 غرام (الخام أو المطبوخ) ، في أنبوب واحد microcentrifuge 1.5 مل. استخدام الشكل أدناه كمبدأ توجيهي لتقدير وزن عينة الأسماك الخام على أساس حجم العينة.
   
   
   الشكل 1. وتشير التقديرات الشامل للعينات الأسماك واستنادا إلى حجم العينة.
   
   
2. قبل دافئة الهضم K بروتيناز الاحتياطي إلى 65 درجة مئوية لمدة 5 دقائق في حمام الحاضنة أو الماء.
3. يعد حل عمل بروتين كاف من خلال الجمع بين 200 ميكرولتر من الاحتياطي بروتين الهضم K و 20 K ميكرولتر من بروتين في العينة.
   ملاحظة : إعداد حل الطازجة عمل بروتين كاف قبل كل استخدام.
4. إضافة 220 ميكرولتر من الحل K بروتين يعمل على كل أنبوب 1.5 مل من عينة الأسماك. احتضان الأنابيب عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حمام الحاضنة أو الماء.
5. تدور الأنابيب في microcentrifuge لمدة 5 دقائق 3 في 14000 XG إلى الأنسجة أي عسر الهضم بيليه.
6. نقل 150 ميكرولتر من كل طاف في أنبوب 1.5 مل الطازجة ، وتجنب عسر الهضم نقل أي مواد من الجزء السفلي من أنبوب أو أي مواد الدهنية التي قد تكون موجودة في الجزء العلوي من الأنبوب ، وهذه الأنابيب من طاف هي عينات منها الجينومية سيتم استخراج الحمض النووي.

2 : استخراج الحمض النووي الجينوم

1. في وعاء معقم (أنبوب البولي بروبلين أو زجاجة) ، يعد حل مؤقت عمل حمض sulfolane الأحماض النووية وربط من خلال الجمع بين 320 ميكرولتر من sulfolane 90 ٪ و 170 ميكرولتر من الأحماض النووية الاحتياطي ملزم لكل عينة.
   قد تحتاج إلى إعداد وجود كمية كافية من هذا الخليط لمعالجة عينات من أكبر عدد ممكن من خطة لفحص في غضون الأسابيع القادمة 4. ويمكن تخزين هذا الخليط لمدة تصل إلى 30 يوما في درجة حرارة الغرفة. تجنب تعريض الخليط للضوء أثناء التخزين.
2. إضافة 490 ميكرولتر من الخليط الاحتياطي sulfolane / تجليد (المعد في الخطوة 1 أعلاه) إلى كل عينة الأسماك. دوامة أو الماصة العينة بشكل متكرر حتى المتجانس. سيتم إضافة هذا الخليط جعل إجمالي حجم كل عينة إلى 640 ميكرولتر.
3. نقل كل عينة إلى سبين كأس ملزم الحمض النووي التي تم جالسا داخل الوعاء أنبوب 2 مل (المقدمة) والمفاجئة الغطاء من الأنبوب على الجزء العلوي من الكوب زيادة ونقصان.
4. تدور العينات في microcentrifuge لمدة 1 دقيقة في XG 14000 لتحميل الحمض النووي على مصفوفة تدور الكأس.
5. إزالة والإبقاء على دوران الكؤوس وتجاهل الرواشح. لكل عينة ، استبدال الكأس تدور في أنبوب وعاء ، ثم يضاف 500 ميكرولتر من 1X السامية سولت الاحتياطي اغسل وغطاء الأنبوب.
6. تدور العينات في microcentrifuge في XG 14000 ل 1 دقيقة.
7. إزالة والإبقاء على دوران الكؤوس وتجاهل الرواشح. لكل عينة ، استبدال الكأس تدور في أنبوب وعاء ، ثم يضاف 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 80 ٪ وغطاء الأنبوب.
8. تدور العينات في microcentrifuge في XG 14000 ل 1 دقيقة.
9. كرر الخطوات 7 و 8 مرتين أخريين ليصبح المجموع 3 يغسل مع 500 ميكرولتر من الايثانول 80 ٪.
10. بعد غسل الثالث في الايثانول 80 ٪ ، لإزالة والإبقاء على دوران الكؤوس وتجاهل الرواشح. استبدال أنابيب الكؤوس تدور في وعاء ، وتدور في microcentrifuge لمدة 2 دقيقة على 14000 XG لتجفيف الألياف مصفوفة.
11. نقل الكؤوس تدور في أنابيب جمع 1.5 - M1. إضافة 100 ميكرولتر من الاحتياطي لشطف كل كوب تدور مباشرة على مصفوفة من الألياف داخل الكأس. المفاجئة في مباراة دولية للأنابيب على جمع الكؤوس تدور ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 دقيقة.
12. تدور العينات في microcentrifuge في أقصى سرعة لمدة 1 دقيقة.
13. الحمض النووي المنقى في الاحتياطي شطف في أنبوب microcentrifuge. تجاهل الكأس تدور وقبعة الأنابيب. قد تكون مخزنة في ال DNA 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. للتخزين الطويل الأجل ، وتخزين الحمض النووي عند 20 درجة مئوية أو 80 درجة مئوية.
14. إذا رغبت في ذلك ، قد تقوم بقياس تركيز عينات من الحمض النووي في معمل.

استخراج الحمض النووي الجيني بروتوكول الغلة العينات عادة مع تركيز تتراوح ما بين 5 نانوغرام / ميكرولتر إلى 500 نانوغرام / ميكرولتر. بروتوكول PCR - RFLP يعمل الآبار مع عينات من الحمض النووي التي تتراوح في أي مكان من 0.05 نانوغرام / ميكرولتر إلى 2000 نانوغرام / ميكرولتر.

3 : إعداد ردود الفعل PCR

1. إعداد 50 نانوغرام / ميكرولتر التخفيف من الحمض النووي السيطرة السلمون ايجابية من خلال الجمع بين 8 ميكرولتر من المخزون الحمض النووي مع 32 ميكرولتر من المياه المعقمة الدناز خالية. الدوامة إلى المزيج.
   قد يتم تخزين العينة المخففة عند 4 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
2. إعداد ردود الفعل عن طريق الجمع بين العناصر في الجدول أدناه في النظام. تحضير خليط كاشف واحد لجميع ردود الفعل PCR التي سيتم تشغيلها في وقت واحد من خلال زيادة الكميات الواردة فيالجدول. بالإضافة إلى اختبار عينات من الحمض النووي ، وتشمل مراقبة رد فعل رد فعل إيجابي وعدم السيطرة القالب. فمن المستحسن إعداد مكررة تفاعلات PCR لكل اختبار عينة من الحمض النووي. إعداد ما يكفي من خليط كاشف لتفاعلات كل ما تبذلونه من فائض زائد واحد حجم رد الفعل.
   على سبيل المثال ، إذا كان لديك 5 اختبار عينات من الحمض النووي ، وإعداد ما يكفي من خليط كاشف للتفاعلات 8 إما (اختبار ردود الفعل 5 ، 1 مراقبة إيجابية ، 1 قالب عدم السيطرة ، والفائض 1) أو 13 ردود الفعل إذا كنت بما في ذلك نسخ من اختبار ردود الفعل (10 مكرر اختبار ردود الفعل ، 1 السيطرة الايجابية (1) ، عدم التحكم قالب والفائض 1).
   PCR الكاشف الخلطات

   مكون	حجم رد الفعل 1	حجم ردود الفعل 5
   DH 2 O ، معقمة	9 ميكرولتر	45 ميكرولتر
   2X PCR ماجستير ميكس	12.5 ميكرولتر	62.5 ميكرولتر
   التمهيدي ميكس	2.5 ميكرولتر	12.5 ميكرولتر
   اجمالى حجم	24 ميكرولتر	120 ميكرولتر

3. دوامة خليط كاشف جيدا ، ثم توزيع 24 ميكرولتر لكل فرد رقيقة الجدران أنبوب تفاعل PCR.
4. إضافة 1 ميكرولتر من ال DNA مراقبة إيجابية المخففة لأنبوب السيطرة على رد فعل إيجابي. للأنابيب اختبار عينة ، إضافة 1 ميكرولتر من اختبار عينة من الحمض النووي. للتفاعل عدم السيطرة القالب ، إضافة 1 ميكرولتر من الدناز خالية من الماء بدلا من الحمض النووي.
   من أجل تجنب انتقال التلوث ، واستخدام غيض الماصة جديدة لكل عينة من الحمض النووي. بعد إضافة العينة ، خلط رد فعل من جانب pipetting بسرعة محتويات أنبوب صعودا وهبوطا.
5. غطاء الأنابيب التفاعل ، دوامة الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي لخلط الأنابيب لفترة وجيزة.

4 : تشغيل بروتوكول PCR

1. مكان ردود الفعل في cycler الحرارية وتشغيل البرنامج PCR هو مبين أدناه.
   PCR الدراجات البروتوكول

   قطعة	عدد الدورات	درجة الحرارة	مدة
   1	1	95 درجة مئوية	5 دقائق
   2	40	95 درجة مئوية 50 درجة مئوية 72 ° C	30 ثانية 30 ثانية 30 ثانية
   3	1	72 ° C	7 دقائق

5 : منتجات دايجست PCR مع إنزيمات تقييد

1. تسمية أنابيب 0.5 مل أو 0.2 مل الشريط الأنابيب التي سيتم استخدامها لتقييد تفاعلات الهضم. وسيتم استيعاب كل ردود الفعل PCR مع ثلاثة انزيمات تقييد مختلفة : DdeI ، وHaeIII NlaIII. ولذلك ، لكل فعل PCR ، تسمية ثلاثة أنابيب منفصلة مع اسم العينة PCR واسم انزيم التقييد.
2. تحضير خليط كاشف للDdeI الهضم من خلال الجمع بين المكونات أدناه بالترتيب. تحضير خليط كاشف واحد لجميع ردود الفعل الهضم DdeI (زائد واحد على الأقل يزيد حجم رد الفعل) باستخدام مضاعفات لكل مكون. بمجرد اكتمال الاسترداد ، يتم التعامل مع ردود الفعل PCR مع تقييد للتحليل انزيمات تقييد طول القطعة (RFLP) تعدد الأشكال.
   DdeI الخلطات الهضم الكاشف

   مكون	حجم
   DH 2 O ، معقمة	1.5 ميكرولتر
   10X DdeI العازلة	0.5 ميكرولتر
   10X DdeI انزيم	0.5 ميكرولتر

3. دوامة خليط كاشف جيدا ، ثم توزيع 2.5 ميكرولتر للأنابيب رد الفعل الفردية التي وصفت لDdeI.
4. تحضير خليط كاشف للHaeIII الهضم من خلال الجمع بين المكونات أدناه بالترتيب. تحضير خليط كاشف واحد لجميع ردود الفعل الهضم HaeIII (زائد واحد على الأقل يزيد حجم رد الفعل) باستخدام مضاعفات لكل مكون.
   HaeIII الخلطات الهضم الكاشف

   مكون	حجم
   DH 2 O ، معقمة	1.5 ميكرولتر
   10X HaeIII العازلة	0.5 ميكرولتر
   10X HaeIII انزيم	0.5 ميكرولتر

5. دوامة خليط كاشف جيدا ، ثم توزيع 2.5 ميكرولتر للأنابيب رد الفعل الفردية التي وصفت لHaeIII.
6. تحضير خليط كاشف للNlaIII الهضم من خلال الجمع بين المكونات أدناه بالترتيب. تحضير خليط كاشف واحد لجميع ردود الفعل الهضم NlaIII (زائد واحد على الأقل يزيد حجم رد الفعل) باستخدام مضاعفات لكل مكون.
   NlaIII الخلطات الهضم الكاشف

   مكون	حجم
   DH 2 O ، معقمة	1.5 ميكرولتر
   10X NlaIII العازلة	0.5 ميكرولتر
   10X NlaIII انزيم	0.5 ميكرولتر

7. دوامة خليط كاشف جيدا ، ثم توزيع 2.5 ميكرولتر للأنابيب رد الفعل الفردية التي وصفت لNlaIII.
8. لكل فعل الهضم ، وإضافة 2.5 ميكرولتر للمنتج PCR المناسبة للأنابيب وصفت. كل ردود الفعل اختبار PCR وكذلك رد فعل السيطرة الايجابية ينبغي أن يتفاعل مع جميع انزيمات تقييد الثلاثة.
9. دوامة ردود الفعل على عملية الهضم ومن ثم الطرد المركزي لفترة وجيزة الأنابيب.
10. احتضان جميع ردود الفعل الهضم عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. ويمكن تنفيذ هذه الحضانة في cycler الحرارية. إذا رغبت في ذلك ، قد يتم ترك ردود الفعل عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
11. نقل ردود الفعل على 65 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. يمكن تنفيذ هذه الخطوة في cycler الحرارية.
12. إضافة 1 ميكرولتر من EDTA 60 ملم (بشرط مع عدة) لكل فعل ودوامة جيدا.

6 : تحليل أنماط القيود هضم

1. تحضير مزيج هلام صباغة ، وضع رقاقة الحمض النووي في محطة رقاقة فتيلة ، وتحميل هذا المزيج على رقاقة الحمض النووي.
2. الماصة 5 ميكرولتر من الحمض النووي في علامة تميز جيدا مع رمز وسلم في كل من الآبار 12 عينة على رقاقة.
   وتقدم علامة الحمض النووي في الحمض النووي كيت الكاشف 1000 في أنبوب الخضراء المغطاة.
3. الماصة 1 ميكرولتر من سلم ال DNA إلى تميز جيدا مع رمز السلم.
   وتقدم في سلم DNA الحمض النووي كيت الكاشف 1000 في أنبوب الصفراء المغطاة.
4. لكل من عينات الحمض النووي ، والماصة 1 ميكرولتر من كل تقييد هضم رد فعل في واحدة من 12 عينة من الآبار على شرائح وفقا لمبادئ توجيهية في الشكل أدناه. باستخدام هذا النهج ، والآبار هي 1-3 لردود الفعل الهضم 3 لعينة مراقبة إيجابية ، والآبار هي 4-6 لردود الفعل الهضم 3 لعينة اختبار 1 ، 7-9 الآبار هي للتفاعلات الهضم 3 لعينة اختبار 2 ، والآبار هي 10-12 لردود الفعل الهضم 3 لعينة اختبار ردود الفعل 3.Analyze هضم تقييد Bioanalyzer 2100 اجيلنت لتحديد أطوال القطعة التي تنتج أثناء عملية الهضم. الحمض النووي اجيلنت 1000 طقم دليل وإرشادات كاملة لتشغيل المختبر على رقائق Bioanalyzer. ويرد أدناه موجز بروتوكول لراحتك.
   
   
   الشكل 2. تنظيم العينات على الرقاقة.
   
   إذا كان لديك عينات من الحمض النووي أقل من 4 ، 1 الماصة ميكرولتر من الماء في الآبار غير المستخدمة. إذا كان لديك أكثر من 4 عينات من الحمض النووي ، وسوف تحتاج إلى تشغيل أكثر من رقاقة واحدة. علما أنه ليس من الضروري تشغيل العينة إيجابية السيطرة على كل رقاقة.
5. مكان الشريحة أفقيا في محول للIKA دوامة خلاط ودوامة لمدة 60 ثانية في 2400 دورة في الدقيقة.
6. إدراج شريحة في Bioanalyzer 2100 اجيلنت وبدء تشغيل الشريحة. يتم عرض الإشارات الواردة الخام في سياق الصك.
   بعد انتهاء تشغيل ، ويتم تحديد الحدود القصوى لجميع العينات باستخدام الإعدادات للقمة تجد الخوارزمية. إذا كنت تعتقد أن الخوارزمية قد أخفق في الكشف عن ذروة حقيقية ، قد خفض عتبة setpoint الارتفاع إلى قيمة تسمح خوارزمية لتحديد الذروة.
7. انتقل إلى سياق الفحص وحدد علامة التبويب ملخص تشيب. في نموذج حقل الاسم ، أدخل اسم نموذج لجميع الآبار 12 على رقاقة كما هو مبين في الشكل أدناه.
   
   
   الشكل 3. نموذج إدخال الاسم في التبويب ملخص تشيب.

7 : تحديد الأنواع عينة الاختبار باستخدام RFLP المنظر

ويمكن استخدام البرنامج اجيلنت تطبيق فك RFLP لتحديد الأنواع السمكية لاختبار عينات من الحمض النووي على أساس أطوال القطعة التي تنتج في ردود الفعل على الهضم. الجدول 7 قطعة DNA مقاسات المتوقعة في تقييد حجم التحكم الإيجابية المتوقعة الإنزيم المنتج (بي بي) 117 DdeI ، 332 ، 340 HaeIII 40 ، 105 ، 333 459 NlaIII الإرشادات المقدمة هنا استخدام الإعدادات الافتراضية في تحليل المنظر RFLP. الرجوع إلى نظام مساعدة برنامج ليالي للحصول على معلومات مفصلة عن برنامج التشغيل وتفسير التاريخ.

1. اطلاق برنامج فك RFLP.
2. انقر فوق ملف> فتح> XAD ملف.
   في مربع الحوار فتح فيلل فتح.
3. حدد الملف XAD لرقاقة الحمض النووي التي شملت ردود الفعل هضم قيود. انقر فوق فتح.
   سوف يظهر مربع الحوار فتح قائمة العينات التي تم تحميلها على الرقاقة.
4. حدد تفاعلات الهضم three المقابلة لعينة من الحمض النووي واحد وتحديد إنزيم تقييد المناسبة لكل عينة باستخدام القوائم المنسدلة تحت العمود الانزيم. في الشكل أدناه ، قد تم شغلها العمود أنزيم الحمض النووي خارج العينة 1.
   
   
   الشكل 4. تحديد الإنزيم تقييد لكل نموذج.
   
   
5. في الحقل المسمى دقيقة ذروة الارتفاع كنسبة مئوية من أقل علامة "، والقيمة الافتراضية هي 10.0 ٪ ، وإذا لزم الأمر ، ويمكن خفض هذه القيمة لتحديد القمم الصغيرة التي كانت ضائعة ، أو رفعها إلى تجاهل القمم الناتجة عن الضوضاء غير محددة في انقر فوق مخطط رحلاني. إعادة إدماج بعد إجراء أي تعديلات على ارتفاع قيمة الذروة دقيقة.
   
   
   الشكل 5. تعيين الحد الأدنى لارتفاع الذروة.
   
   
6. احسب فوق في الجزء السفلي من مربع الحوار.
   فإن البيانات التي تم الحصول عليها من طول جزء على المدى Bioanalyzer ملء الحقول البرمجيات.
7. في القائمة المنسدلة يسجل في أعلى الزاوية اليسرى من الشاشة ، حدد الخوارزمية المناسبة لتحليل البيانات. إذا كانت عينة الأسماك التي يجري تحليلها وتتألف من أنواع الأسماك واحد ، حدد النرد (لي ني) في درجة القائمة المنسدلة. إذا كانت العينات قد تتكون من خليط من الأنواع ، وتحديد الخليط.
   تسمية الجدول في الجزء السفلي من الشاشة درجة مجمعة قوائم أفضل الأنواع مباريات استنادا إلى نتائج جميع ردود الفعل الهضم الثلاثة. يتم سرد اسم الأنواع وكذلك اسم شائع في الجدول (أنظر أدناه). وتبرز مباراة مثالية (تلك بنتيجة 1) باللون الأخضر. وتعتبر مباريات أبرزها الأصفر بالقرب من المباريات. قد كنت على اسم الأنواع نقرا مزدوجا فوق لإظهار صفحة ويب شركة FishBase لهذا النوع.
   
   
   الشكل 6. تحديد الأنواع استنادا الهضم.
   
   
8. في الطبقة السفلى من الحقول التسامح وقطع المباراة في أعلى الشاشة ، يمكنك ضبط الإعدادات الافتراضية لتحسين النتيجة في المباراة أفضل الأنواع. يتم استخدام قيمة أقل قطع لتجاهل أي شظايا أقصر من طول المعينة في هذا المجال. قيمة التسامح مباراة تحديد كيفية إغلاق في طول جزء يجب ان تكون في جزء وتوقع أن تعتبر المباراة.
9. كرر الخطوات من 4 إلى 8 لعينات من الحمض النووي الباقية التي كانت مدرجة على هذه الشريحة نفسها.

8 : نتائج الممثل :

ويظهر صورة لهلام Bioanlyzer مع عينات من خلاصة القيد 4 أنواع الأسماك المختلفة في الشكل أدناه. وتتلخص النتائج المتوقعة لعينة من الحمض النووي ايجابية في الجدول أدناه.


الشكل 7. Bioanalyzer هلام صورة عينات تقييد تفاعل الهضم. يسمى كل حارة هلام مع انزيم التقييد المستخدمة في هذا التفاعل.

يتوقع مقاسات قطعة من الحمض النووي في التحكم سالمون ايجابي

الشكل 8. يتوقع مقاسات قطعة من الحمض النووي في التحكم سالمون ايجابي.

Discussion

نظهر بسيطة وسريعة ودقيقة طريقة الفرز المعتمدة على الحمض النووي لتحديد الأنواع السمكية في منتجات المأكولات البحرية. يوفر هذا الأسلوب قوية استنساخه ، ونتائج دقيقة في أقل من يوم عمل واحد ، ويمكن تطبيقه في مرافق الاختبار بسبب البروتوكولات التجارية وتبسيط الإعداد بسيطة. ويتميز هذا الجيل من المعطيات الموضوعية التي يتم تحليلها باستخدام برامج فك RFLP مع قاعدة بيانات قابلة للتوسيع التجربة المستمدة من التشكيلات أنواع الأسماك.

مع تنفيذ روتينية ، وهذه الطريقة اختبار لديه القدرة على منع mislabeling من منتجات المأكولات البحرية ، والمساعدة في الحفاظ على سجلات دقيقة مناسبة للامتثال للوائح الحكومية.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various