以DNA为基础的鱼类物种鉴定协议

摘要

本刊物介绍了如何使用安捷伦鱼类识别系统，以确定提取DNA进行PCR和RFLP分析，鱼的种类。

摘要

我们已经开发出一种快速，简便，准确的DNA为基础的筛查方法来识别存在于新鲜和加工的海产样本的鱼类物种。这种多用途的方法采用PCR扩增从鱼样本中提取的基因组DNA，通过限制性片段长度多态性（RFLP）分析生成的片段，可以解决在Agilent 2100生物分析仪及配套使用RFLP图谱匹配软件的正确物种的模式。

鱼的鉴别方法使用简单，可靠，自旋基于列的协议，从鱼样本中分离出DNA。用蛋白酶K释放到溶液中的核酸样品的处理。然后分离出的DNA结合缓冲液中的悬浮样品和装载含有硅为基础的光纤矩阵的杯子到微观自旋。样品中的核酸结合到纤维基质。固定的核酸洗涤以去除污染物，并在终体积为100μL收回总DNA。分离出DNA的发现在所有的鱼类基因组的序列绑定到所提供的引物进行PCR扩增。 PCR产物，然后与3个不同的限制性内切酶消化，安捷伦2100生物分析仪解决。在消化反应产生的片段长度可用于确定的DNA样本，准备从鱼的品种，使用RFLP图谱匹配软件包含实验衍生RFLP从相关的商业价值的鱼类物种模式的数据库。

研究方案

1：准备鱼样本DNA提取

1. 每条鱼样本进行测试，将一块鱼组织，体重10毫克，1克（生或熟）之间，成一个单一的1.5 ml的离心管。使用下面的数字估算基于样本大小的生鱼片样品的重量的方针。
   
   
   图1。基于对样本大小的鱼类样品的质量评估。
   
   
2. 预温蛋白酶K消化缓冲至65℃，在孵化器或水浴5分钟。
3. 准备工作液200μL蛋白酶K消化缓冲液和20μL蛋白酶K，每样品相结合的蛋白酶K。
   注意：每次使用前准备工作的一个新的蛋白酶K的解决方案 。
4. 加入220μl蛋白酶K工作液每个鱼样品1.5 ml管的。孵育管在65℃的孵化器或水浴10分钟。
5. 自旋为3 5 XG颗粒任何未消化的组织，在14000分钟的离心管。
6. 转移到一个新的1.5 ml管每个上清液150μL。上清这些管子管或任何油性物质，可目前在管的顶部底部，避免传输任何未消化的物质。样品从它的基因组将提取的DNA。

2：提取基因组DNA

1. 在无菌容器（聚丙烯管或玻璃瓶），编制了环丁砜和核酸结合缓冲液中的工作液320μl的90％，环丁砜和每个样品核酸结合缓冲液170μL结合。
   您可能要准备一个足够数量的这种混合过程，还有很多的样品，为你计划，以审查在未来4个星期。 这种混合物可以存储在室温下长达30天。避免暴露在储存过程中的混合物光。
2. 加入490μL的环丁砜/结合缓冲液的混合物（在上述步骤1准备）每条鱼样本。涡或吸管直到均质样品反复。这种混合物的加入将使每个样品的总体积为640μL。
3. 将每个样品2毫升插座管内已就位（已提供），并捕捉到的旋杯的顶部管第一个DNA结合自旋杯。
4. 自旋为1分钟，在14000 XG微量的样品加载到自旋杯矩阵的DNA。
5. 删除和保留的旋转杯和丢弃滤液。对于每个样本，更换插座中的管旋杯1X高盐的洗涤缓冲液，然后加入500μl和盖管。
6. 在1分钟14,000 XG离心旋转样品。
7. 删除和保留的旋转杯和丢弃滤液。对于每个样本，更换插座中的管旋杯，再加入80％乙醇500μl和盖管。
8. 在1分钟14,000 XG离心旋转样品。
9. 重复步骤7和8两个更次，共3洗用500μL80％乙醇。
10. 在80％乙醇的第三洗后，删除和保留的旋转杯和丢弃滤液。更换插座管旋杯和14000 XG自旋为2分钟离心干燥纤维基质。
11. 将1.5 - M1收集管旋杯。直接在杯子里面的纤维基质，加入100μL洗脱缓冲液每次旋转杯。卡上旋杯收集管帽，并在室温下孵育1分钟。
12. 在以最大速度离心1分钟的旋转样品。
13. 纯化的DNA洗脱缓冲液的离心管。丢弃旋转杯和盖管。在4 ° C的DNA可以存储长达一个月。对于长期储存，储存的DNA在20 ° C或80 ° C。
14. 如果需要的话，你可以在分光光度计测量浓度的DNA样本。

基因组DNA提取协议通常收益率与浓度范围从5 ng /μL的500 ng /μL的样品。 的PCR - RFLP协议的工作原理与DNA不等从0.05 ng /μL的2000毫微克/μL的样品井。

3：设置PCR反应

1. 准备用32μL无菌，无DNase的水相结合，8μL的DNA股票的积极控制鲑鱼DNA 50 ng /μL的稀释。涡旋混合。
   稀释后的样品可在4 ° C储存供日后使用。
2. 准备组件相结合，在下面，以表的反应。所有将要运行的同时，通过扩大中列出的卷的PCR反应准备一个单一的试剂混合表。此外测试的DNA样本，包括阳性对照反应和无模板的对照反应。建议准备重复每个测试的DNA样本的PCR反应。准备好你的反应，加上一个反应体积超过足够的试剂混合。
   例如，如果你有5个测试的DNA样本， 准备为8的反应（5测试反应，1个阳性对照，无模板控制， 和 1过剩）或13反应包括足够的试剂混合，如果你的测试反应的重复（10重复试验的反应，1个阳性对照，1无模板控制和1过剩） 。
   PCR试 ​​剂混合

   组件	卷1反应	体积5的反应
   DH 2 O，无菌	9μL	45μL
   2X PCR扩增预混	12.5μL	62.5μL
   引物混合	2.5μL	12.5μL
   总成交量	24μL	120μL

3. 涡试剂混合，然后分发到每一个人的薄壁PCR反应管24μL。
4. 加入1μL稀释的阳性对照DNA阳性对照反应管。为了测试样品管，加入1μL测试的DNA样本。对于没有模板控制反应，加入1μLDNase的自由水的地方的DNA。
   为了避免交叉污染，使用一个新鲜的吸管尖，每个DNA样本。 加入样品后，迅速 ​​移液管的内容向上和向下混合反应。
5. 第反应管，涡旋管简单地混合和离心管。

4：运行PCR议定书“

1. 在热循环仪的反应和运行PCR程序如下所示。
   PCR循环协议

   分部	循环数	温度	时间
   1	1	95℃	5分钟
   2	40	95℃ 50℃ 72℃	30秒 30秒 30秒
   3	1	72℃	7分钟

5：精华PCR产物用限制性内切酶

1. 标签0.5毫升管或0.2毫升地带管，使用限制性内切酶消化反应。每个PCR反应将被消化了三种不同的限制性内切酶DdeI，HaeIII和NlaIII。因此，每个PCR反应，PCR样品的名称和限制性内切酶的名称与标签的三个独立的管。
2. 以下组件相结合，以准备DdeI消化试剂混合。准备所有DdeI消化反应，利用每个组件的倍数（另加至少有一个反应体积过量）单一试剂的混合物。 PCR完成后，PCR反应限制性内切酶限制性片段长度多态性（RFLP）分析处理。
   DdeI消化试剂混合

   组件	卷
   DH 2 O，无菌	1.5μL
   10X DdeI缓冲区	0.5μL
   10X DdeI酶	0.5μL

3. 涡试剂混合，然后分发到个人的反应，为DdeI标记的试管2.5μL。
4. 以下组件相结合，以准备HaeIII消化试剂混合。准备所有HaeIII消化反应，利用每个组件的倍数（另加至少有一个反应体积过量）单一试剂的混合物。
   HaeIII消化试剂混合

   组件	卷
   DH 2 O，无菌	1.5μL
   10X HaeIII缓冲区	0.5μL
   10X HaeIII酶	0.5μL

5. 涡试剂混合，然后分发到个人的反应，为HaeIII标记的试管2.5μL。
6. 准备试剂混合NlaIII消化相结合，以下面的组件。准备为所有NlaIII消化反应，利用每个组件的倍数（另加至少有一个反应体积过量）的单一试剂的混合物。
   NlaIII消化试剂混合

   组件	卷
   DH 2 O，无菌	1.5μL
   10X NlaIII缓冲区	0.5μL
   10X NlaIII酶	0.5μL

7. 涡试剂混合，然后分发到个人的反应，为NlaIII标记的试管2.5μL。
8. 对于每个消化反应，添加适当的PCR产物2.5μL标记的试管。测试PCR反应以及作为阳性对照反应都需要与所有三个限制性内切酶消化。
9. 涡的消化反应，然后短暂离心管。
10. 孵育所有在37 ° C 2小时的消化反应。此潜伏期可进行热循环。如果需要的话，反应可能会留在37 ° C过夜。
11. 转移至65 ° C 15分钟的反应。这一步可以在热循环仪。
12. 添加1μL60 mM的EDTA（套件），以及每个反应和涡。

6：分析限制性内切酶消化模式

1. 准备凝胶染料混合，放置在芯片上的吸站的DNA芯片，并加载的DNA芯片上的混合。
2. 吸取5μLDNA标记与梯形图符号和标记到每个在芯片上的12个样品孔。
   DNA分子标记在DNA 1000试剂盒在绿色覆盖的管。
3. 吸取1μLDNA梯状到梯子的象征标记。
   DNA梯状提供了一个黄色的雪山管的DNA 1000试剂盒。
4. 对于每一个DNA样本，吸管1μL酶切反应每个12芯片的样品孔，根据下图中的的指导方针之一。使用这种方法，3反应为阳性对照样品的消化，井1-3 4-6井的3个试验样品1，井7-9消化反应为3个测试样本2的消化反应， 10-12井3.Analyze安捷伦2100生物分析仪上的酶切反应测试样品，以确定在消化过程中产生的片段长度为3消化反应。安捷伦DNA 1000工具包指南上运行的生物分析实验室芯片的完整说明。为方便起见，下面提供了一个简短的协议。
   
   
   图2。组织芯片的样品。
   
   如果您有未使用的水井不到4个DNA样本，吸管1μL水 。 如果你有超过4个DNA样本，你将需要运行多个芯片 。 请注意，它是没有必要的每一块芯片上运行的阳性对照样品。
5. 水平放置的芯片，在2400转的德国IKA旋涡混合器和60秒的旋涡适配器。
6. 安捷伦2100生物分析仪芯片插入并启动芯片运行。传入的原始信号显示在仪器中。
   运行完成后，峰被确定为所有使用的高峰期的设置，发现算法的样本。 如果您认为该算法无法检测到真正的高峰，你可能会降低高度阈值的设定值，允许该算法确定高峰。
7. 转到的含量范围内，选择芯片的摘要“选项卡。在“样品名称”字段中，输入一个如下图所示的12口井在芯片上的所有样品名称。
   
   
   图3。摘要标签芯片的样品名称条目。

7：确定使用RFLP分析比对测试样品的物种

安捷伦软件应用RFLP解码器可用于为基于在消化反应所产生的片段长度的DNA样本测试，以确定鱼的种类。表7阳性对照限制性内切酶预期的产品尺寸117（BP）DdeI DNA片段大小340，332，459 NlaIII HaeIII 40，105，333，这里提供的指示RFLP匹配器使用的默认分析设置。请参考软件的帮助系统上运行软件和解释显示的详细信息。

1. 启动RFLP解码程序。
2. 点击文件>打开> XAD文件。
   打开对话框WILL打开。
3. 选择XAD文件，其中包括酶切反应的DNA芯片。点击“ 打开 ”。
   将打开一个对话框，列出了在芯片上加载的样品。
4. 每个样品用酶 “栏下的下拉菜单选择相应的一个DNA样本的三个消化反应，并指定相应的限制性内切酶。在下图中，已填写的酶列的DNA样本1。
   
   
   图4。指定对每一个样品的限制性内切酶。
   
   
5. 标记为较低的标记“％分钟的峰高的领域，默认值是10.0％，如果需要的话，这可能会降低价值，以确定被错过的小峰，或提出放弃在从非特定的噪音造成的峰电泳。点击作出任何调整，以最小的峰高值后，重新融入社会。
   
   
   图5。分配的最小峰值高度。
   
   
6. 单击对话框底部的计算器 。
   片段长度从生物分析仪运行获得的数据将填充的软件领域。
7. 在比分在屏幕上方左上角的下拉列表，选择合适的算法对数据的分析。如果由一个单一的鱼种鱼样品正在分析中，选择在下拉列表中的得分骰子（李内）。如果样本包括物种的混合物中， 选择 “混合“。
   在屏幕底部的标记的综合评分表列出了最好的品种匹配所有三个消化反应的结果为基础。表中列出的物种名称，以及共同的名字（见下文）。以绿色突出显示的完美匹配（1分）。以黄色突出显示的比赛被认为是附近的匹配。您可以双击一个物种的名称，使该物种的FishBase网页。
   
   
   图6。基于对消化物种鉴定。
   
   
8. 在较低的截止和匹配公差域在屏幕的上方，你可以调整默认设置，以改善物种的最佳匹配得分。 较低的临界值是用来丢弃任何比在现场指定的长度较短的片段。本场比赛的公差值决定如何关闭一个片段长度必须被认为是匹配的预测片段。
9. 其余的，这同一个芯片上的DNA样本4重复步骤8。

8：代表性的成果：

一个Bioanlyzer凝胶图像与来自4个不同的鱼种的限制性消化样品如下图所示。预期结果为阳性的DNA样本，总结于下表。


图7。限制性内切酶消化反应样品的生物分析仪凝胶图像。每个凝胶泳道是在这一反应中所用的限制性内切酶标记。

三文鱼阳性对照预期的DNA片段大小

图8。三文鱼阳性对照预期的DNA片段大小。

讨论

我们展示一个海鲜产品中的鱼类物种的识别简单，快速，准确的DNA为基础的筛查方法。这强大的方法提供了在不到一个工作日的重复性好，精确的结果，它可以在商业测试设施，由于简化的协议和进行简单的设置实现。它的特点是客观数据分析多态性解码器软件使用实验衍生的鱼类型材的可扩展数据库的生成。

这种测试方法与常规的实施，有潜力，以防止错误标签的海鲜产品，并协助在保持合适的准确记录与政府法规。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agilent 2100 Bioanalyzer (with chip priming station and IKA vortex mixer)	Agilent Technologies	G2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer laptop & Expert Software	Agilent Technologies	G2953CA	G2950CA - desktop PC & Expert Software
Agilent Bioanalyzer DNA 1000 Reagent Kit (part #5067-1504)	Agilent Technologies	5067-1504
Thermal Cycler	Various	Various
PCR Strip Tubes	Agilent Technologies	401428
PCR Strip Caps	Agilent Technologies	401425
96-Well Working Rack	Agilent Technologies	410094
Fish Species Identification System DNA Isolation Kit	Agilent Technologies	Contact
Fish Species Identification System PCR-RFLP Reagent Kit	Agilent Technologies	Contact
RFLP Matcher Software	Agilent Technologies	Contact
100% ethanol, 200 proof (USP grade or equivalent)	Various	Various
Sterile, nuclease-free water	Various	Various
Pipettors	Various	Various
Incubator or water bath set to 65°C	Various	Various
Sterile glass bottle or polypropylene tube (e.g. 14-ml BD Falcon polypropylene)	Various	Various
round-bottom tubes or 50-ml BD Falcon polypropylene conical tubes)	Various	Various
Vortex mixer	Various	Various
Microcentrifuge	Various	Various
Microcentrifuge tubes 1.5ml	Various	Various
Tube rack 1.5ml	Various	Various
Pipette Tips	Various	Various