العزلة وثقافة الطيور الجنينية الخلايا الاصلية صمامي

Summary

هذه المادة سوف توفر وسيلة لعزل وزراعة السمان أو الدجاج HH14 ^-- صمام الخلايا الشغاف وسادة HH25 خلايا صمام الوسيطة.

Abstract

تشكيل السليم وظيفة صمامات القلب الجنينية أمر حاسم بالنسبة لتطور التنموي. قلب الجنين في وقت مبكر هو أنبوب على شكل حرف U من البطانة وتحيط بها عضلة القلب. وتفرز عضلة القلب القلب هلام ، ومصفوفة هلامي hyaluronan الغنية ، في مفترق الطرق (AV) والقناة الأذينية البطينية تدفق (OFT) التجويف. في هذه المرحلة تبدأ عندما HH14 valvulogenesis مجموعة فرعية من الخلايا الشغاف تلقي إشارات من عضلة القلب ، والخضوع لعملية التحول الشغاف الوسيطة (EMT) ، وغزو هلام القلب. في هذه المرحلة هي HH25 mesenchymalized بالكامل وسائد الصمامات ، وهذا هو اللحمة المتوسطة التي تشكل في نهاية المطاف الجهاز الصمامات والحاجز للقلب. فهم الآليات التي تعدل والشروع في عملية التمايز الخلوي وEMT مهمة بسبب علاقتهم خطيرة عيوب خلقية في القلب. في هذه الدراسة نقدم طرق لعزل قبل EMT الشغاف وبعد EMT خلايا اللحمة المتوسطة ، والتي هما الظواهر المختلفة للخلية وسادة prevalvular. يمكن تربيتها قبل EMT الخلايا الشغاف مع أو بدون عضلة القلب. يمكن تربيتها بعد EMT خلايا اللحمة المتوسطة وسادة AV المواد الهلامية الكولاجين داخل مقيدة ميكانيكيا أو خالية من الإجهاد. هذه النماذج في 3D المختبر تحاكي الأحداث الرئيسية morphogenic صمامي ومفيدة لتفكيك آليات valvulogenesis المرحلة المبكرة والمتأخرة.

Protocol

1. إعداد

1. احتضان السمان الخصبة أو بيض الدجاج لمرحلة 14 ^-- (حوالي 2 يوما) أو 25 (حوالي 4.5 أيام) عند درجة رطوبة 60 ٪ و 37 درجة مئوية.
2. تحضير محلول معقم للملح ايرل المتوازن (EBSS)
   1. إضافة 100 مل 10X EBSS إلى 600 مليلتر من الماء MΩ 18
   2. إضافة بيكربونات الصوديوم 2.2 غرام
   3. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 7.2
   4. تقديم حل ما يصل إلى 1000 مل
   5. تعقيم الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر
3. تعد عقيمة مستنبت M199.
   1. إضافة 1 حزمة من مسحوق M199 إلى 700 مل ماء MΩ 18.
   2. إضافة بيكربونات الصوديوم 2.2 غرام
   3. ضبط الرقم الهيدروجيني من الحل إلى 7.2.
   4. إضافة 10 مل (1 ٪) البنسلين ، الستربتوميسين
   5. تقديم حل ما يصل إلى 1000 مل
   6. تعقيم الحل عن طريق تمرير من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر
   7. إضافة 1 مل العقيمة 100X الانسولين ترانسفيرين السيلينيوم - G - تكملة
   8. إضافة 10 مل (1 ٪) عقيمة من مصل الدجاج
4. إعداد ثلاث الابعاد المواد الهلامية الكولاجين الكولاجين بتركيز 1.5 ملغ / مل. وقد أظهرت الأعمال السابقة في مختبرنا أن تركيز مادة الكولاجين أكثر من 1.5 ملغ / مل يوفر مصفوفة التي biomechanically قاسية جدا للخلايا للتنقل. هلام الكولاجين تركيزات أقل من 1.5 ملغ / مل من ألياف الكولاجين قليلة بحيث تتجمع الخلايا يمكن أن أجاد الألياف محليا ، وتنتج جزيرة من الخلايا.
   1. إضافة التالية الجليد الباردة الكواشف إلى العقيمة 15 مل أنبوب الطرد المركزي من أجل :
      • 3X M199 : حجم = إجمالي حجم اللازمة / 3
      • MΩ المياه المعقمة 18 : حجم = إجمالي حجم الضرورية (M199 + حجم الدجاج حجم المصل + 0.1 هيدروكسيد الصوديوم حجم M حجم الكولاجين +)
      • معقمة مصل الدجاج : حجم = إجمالي حجم اللازمة * 0.01
      • الفئران الكولاجين الذيل الأول : حجم = (الكولاجين تركيز جل * إجمالي حجم الضرورة) / الكولاجين تركيز الأسهم
      • هيدروكسيد الصوديوم العقيمة 0.1 M : المجلد = 0.2 * حجم الكولاجين
        ملاحظة : كمية المياه ، 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم ، والكولاجين وأضاف سوف تختلف تبعا لتركيز محلول المخزون الكولاجين.
   2. مزيج الكولاجين حل جيد مع ماصة معقمة.
   3. نقل على الفور 0.3 مل من محلول الكولاجين في 1.9 سم ² آبار منطقة النمو. هذا هو ما يكفي لتغطية الحل الكولاجين تماما البئر وتوفير جل أن ما يقرب من 3 مم. وسمك جل ما لا يقل عن 250 ميكرون هو ضروري للدراسات غزو الخلايا.
   4. يسمح الحل الكولاجين لجل ما لا يقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ ، و 100 ٪ الرطوبة.

2. قبل EMT عزل خلية الشغاف والثقافة

1. جنين العزلة
   1. مكان قطعة واحدة طويلة شبر من الشريط على أكبر مختبر نهاية البيض. هذا هو المكان الذي يقع الخلية الهواء. الشريط استقرار البويضة السمان الهشة قذيفة.
   2. ثقب بلطف المنطقة مسجلة للبويضة في الخلية الهواء مع غيض من مقص منحني تعقيمها.
   3. قطع ثقب في الجزء مسجلة للبويضة كبيرة بما يكفي للسماح للصفار بالمرور. بدء ثقب في ثقب وقطع الخارج في شكل حلزوني. تأكد من قطع طريق الغشاء الخارجي ، ولكن تجنب اختراق صفار.
   4. عندما ثقب في وعاء كاملة ، تصور الجنين السمان. يقع عادة الجنين في الجانب العلوي من صفار البيض.
   5. البدء في صب صفار من خلال ثقب في قطع البيض مع يد واحدة. عقد منتاش # 55 في اليد الأخرى. كما الجنين خروجها من البيض في الجانب العلوي من صفار البيض ، حرك بلطف ملاقط # 55 تحت الجنين وإزالته من صفار البيض. ملاحظة : للحصول على بيض الدجاج ، وعزل الجنين تتضمن تكسير البيض الدجاج على سطح نظيف الحاد وكسر البيض في صحن بيتري 100 ملم. يجب أن يكون موجودا في الجنين في الجانب العلوي من صفار البيض. الشريحة بلطف # 55 ملاقط تحت الجنين وإزالته من صفار البيض.
   6. وضع الجنين في طبق بتري 100 ملم تحتوي على الجليد الباردة ، EBSS العقيمة.
2. مرحلة الأجنة وفقا لمعايير همبرغر وهاميلتون ^1. الأجنة في مرحلة 14 ^-- 13 من المرحلة الماضية ، ولكن لم نصل بعد إلى المرحلة 15 ، مع 20-21 somites وبرعم الذيل. ومن الخصائص الرئيسية لمرحلة 14 ^-- الأجنة هي الزاوية الرأس ، وهو أكبر قليلا من 90 درجة الى الجسم.
3. إزالة قلوب من الأجنة في مرحلة السمان 14 ^-- عن طريق قطع بالعرض حيث قناة AV OFT واجراء اتصالات مع جدار الصدر مع ملاقط # 55. مكان قلوب معا على جانب واحد من طبق بيتري.
4. جمع قلوب معزولة مع ماصة نقل معقمة ووضعها في صحن بيتري الجديدة 100 مم مملوءة العقيمة EBSS الجليد الباردة.
5. قطع OFTs والقنوات AV بالعرض من البطينين مع ملاقط # 55.
6. قسم القنوات المتبقية للمركبات و / أو مساحات تدفق (OFTs) طوليا.
7. تعيين ماصة لحجم 20 ماي. استخدام هذا ماصة لنضح six طوليا قطع قنوات AV وOFTs.
8. طرد القنوات AV وOFTs على الجل الكولاجين. نضح أي EBSS الزائدة من سطح هلام.
9. استخدام ملاقط ل# 55 explants المشرق بحيث تكون مسطحة وبالتالي فإن الجانب التجويف يواجه الجل الكولاجين. ليس محاولة لثقب هلام الكولاجين مع ملاقط.
10. بعد 2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO ₂ ، إزالة عضلة القلب من explants مع ملاقط # 55. ينبغي ترك الخلايا وراء الشغاف على سطح الجل الكولاجين. بدلا من ذلك ، يمكن ترك لعضلة القلب على ازدراع. مع إزالة عضلة القلب ، والخلايا الشغاف مع عدم الخضوع EMT دون تدخل. عضلة القلب مع الحاضر ومجموعة فرعية من خلايا اللحمة المتوسطة تتحول الشغاف ، ولكن درجة التحول يمكن التضمين مع العوامل الخارجية. ملاحظة : حتى لو ستترك على عضلة القلب ، ويجب أن يسمح لازدراع لا يقل عن 2 ساعة لنعلق على الجل قبل إضافة المتوسط.
11. إضافة 0.4 مل M199 المتوسط ​​وتحتوي على كل explants جيدا.
12. ثقافة الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ ، و 100 ٪ الرطوبة.

3. بعد EMT AV عزل خلية سائد الوسيطة والثقافة

1. كسر بيضة الدجاج على سطح نظيف الحاد وكسر البيض في صحن بيتري 100 ملم. يجب أن يكون موجودا في الجنين في الجانب العلوي من صفار البيض. التقاط الجنين مع # 5 بواسطة ملاقط الاستيلاء على الأغشية التي تحيط بالجنين ثم ضع الجنين في طبق بتري 100 مم مملوءة EBSS والثلج الباردة العقيمة.
2. مرحلة الأجنة وفقا لمعايير همبرغر وهاميلتون ^1. ملامح الجنين وتشمل 25 مرحلة متميزة الكوع والمفاصل في الركبة وتصبغ طفيف العين.
3. عزل من جميع قلوب الأجنة ومكان HH25 قلوب معا على جانب واحد من طبق بيتري.
4. جمع قلوب معزولة مع ماصة نقل معقمة ووضعها في صحن بيتري الجديدة 100 مم مملوءة العقيمة EBSS الجليد الباردة.
5. عزل المنطقة AV من كل القلوب في آن واحد. وضع الهلال معا في جانب واحد من طبق بيتري. تستنهض الهمم المنطقة بلطف لإزالة جميع مركبات الدم ، التي يمكن أن تؤثر على بقاء الخلية.
6. جمع الهلال مع معزولة ماصة نقل معقمة ووضعها في صحن بيتري الجديدة 100 مم مملوءة العقيمة EBSS الجليد الباردة.
7. عزل بالتسلسل وسائد من AV. تأكد من عدم وجود الحاضر على عضلة القلب وسائد AV.
8. جمع وسائد معزولة مع ماصة نقل معقمة ووضعها في أنبوب 15 مل العقيمة الطرد المركزي.
9. تدور في الوسائد إلى أسفل أنبوب الطرد المركزي في 15 XG لمدة 3 دقائق.
10. استخدام غيض العقيمة مل 1000 لإزالة أكبر قدر من طاف EBSS ممكن من دون إزعاج الوسائد.
11. إضافة 1 مل من 0.25 ٪ التربسين - EDTA الذي تم قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. السماح للسائد في لاحتضان التربسين حتى تذوب تماما والتي هي عادة حوالي 3-5 دقائق.
12. إضافة 100 ميكرولتر من مصل الدجاج إلى أنبوب الطرد المركزي لإخماد التربسين.
13. بيليه الخلايا في 160 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع طرف عقيمة ، ميكرولتر 1000.
14. Resuspend الخلايا في 2 مل من مزيج M199 المتوسطة والتي pipetting. يستغرق 10 ميكرولتر لتعليق الخلية إلى الاعتماد على عدادة الكريات وتحديد عدد الخلايا التي تم عزلها
15. تحديد عدد وستتاح المواد الهلامية الكولاجين استنادا إلى عدد من الخلايا المعزولة. الخلايا تحتاج إلى مطلي في كثافة الخلايا 2 × ⁵ 10 / مل مع حجم 250 هلام ميكرولتر.
16. بيليه الخلايا في 160 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف مع طرف عقيمة ، ميكرولتر 1000.
17. باستخدام بروتوكول المذكورة أعلاه ، إضافة M199 3X ، والمياه ، والدجاج مصل ، والكولاجين ، وهيدروكسيد الصوديوم 0،1 م ، في هذا النظام ، لبيليه الخلية. مزيج لطيف من قبل pipetting.
18. إضافة إلى 250 ميكرولتر كل مجال من مجالات النمو 1.9 سم ² أيضا.
19. يسمح الحل الكولاجين لجل ما لا يقل عن 1 ساعة عند 37 درجة مئوية ، 5 ٪ CO ₂ ، و 100 ٪ الرطوبة.
20. إضافة 0.4 مل من وسائل الإعلام والثقافة ، واحتضان بين عشية وضحاها.
21. الاستمرار في زراعة المواد الهلامية في ظروف خالية من الإجهاد ، وتحرير المواد الهلامية من جوانب الثقافة باستخدام بئر العقيمة 200 غيض ميكرولتر ماصة. ثقافات مقيدة ميكانيكيا والمواد الهلامية التي لا تزال تعلق على جوانب الثقافة أيضا.

4. ممثل النتائج

الشكل 1 : يتم عرض أمثلة للأجنة (أ) الجنين HH14 - السمان ، و (ب) الجنين الدجاج HH25 هنا.

fig2.jpg "بديل =" الشكل 2 "/>
الشكل 2 : HH14 صمام explants الشغاف بعد 2 ساعة من ثقافة (A) مع الحاضر عضلة القلب ، أو (ب) مع إزالة عضلة القلب.

الشكل 3 : HH14 صمام explants الشغاف (A) مع الحاضر عضلة القلب ، والعديد من الخلايا الشغاف الخضوع لعملية التحول الوسيطة ويكون على شكل مغزلي ، النمط الظاهري الوسيطة بعد 48 ساعة من الثقافة. (ب) عند إزالة عضلة القلب كافة الخلايا الحفاظ على الحصوه الشكل ، النمط الظاهري الشغاف بعد 48 ساعة في الثقافة.

يتم تقريب الخلايا خلايا اللحمة المتوسطة صمام HH25 في هلام الكولاجين مباشرة بعد الغرس : الشكل 4.

الشكل 5 : HH25 خلايا اللحمة المتوسطة في الثقافة (A) بعد 48 ساعة من الثقافة في جل الكولاجين مقيدة الخلايا HH25 الوسيطة هي بداية لانتشار المرض. (B) وضغط HH25 خلايا الكولاجين في هلام خالية من التوتر بعد 7 أيام من البذر و 6 ايام بعد التحرير الجل إلى ما يقرب من 50 ٪ من المساحة الأصلية.

Discussion

طريقة لعزل خلايا الشغاف من مرحلة HH14 ^-- قلوب ضعت أصلا من قبل وRunyan Markwald يوفر للرقابة ، في بيئة المختبر لدراسة العوامل التي تشرع وتعدل EMT الجنينية ^2. HH14 ^-- سوف explants الشغاف مثقف دون الخضوع لعضلة القلب لا EMT النشاط الحيوي دون تدخل أو البيوكيميائية. إ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55	World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5	World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S
4-well culture plates	Nalge Nunc international	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane	Nalge Nunc international	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm	VWR international	25384-342
Laboratory tape	VWR international	89097-920
Rat-tail collagen I	BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution	Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder	Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)	Invitrogen	41400-045
Chicken serum	Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)	Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)	Cornell University Poultry Farm