Isolierung und Kultivierung von Avian Embryonale Valvular Progenitorzellen

Zusammenfassung

Dieser Artikel wird eine Methode zur Isolierung und Kultivierung von Wachteln oder Huhn HH14 ^- Ventil endokardiale Zellen und HH25 Ventil Kissen mesenchymalen Zellen.

Zusammenfassung

Korrekte Ausbildung und Funktion der embryonalen Herzklappen ist entscheidend für Entwicklungsfortschritt. Die frühe embryonale Herz ist ein U-förmiges Rohr von Endokard von Myokard umgeben. Der Herzmuskel sondert kardiale Gelee, ein Hyaluronan reichen gallertartige Matrix, in die atrioventrikulären (AV)-Übergang und Ausflusstrakt (OFT) Lumen. Im Stadium HH14 valvulogenesis beginnt, wenn eine Teilmenge von endokardiale Zellen Signale aus dem Myokard zu erhalten, unterziehen endokardiale mesenchymale Transformation (EMT) und dringen in das Herz-Gelee. Im Stadium HH25 die Klappen Kissen sind vollständig mesenchymalized, und es ist dieses Mesenchym, die schließlich bildet die Herzklappen und septalen Apparat des Herzens. Das Verständnis der Mechanismen, und initiieren modulieren den Prozess der EMT und Zelldifferenzierung sind wegen ihrer Verbindung zu schweren angeborenen Herzfehlern wichtig. In dieser Studie präsentieren wir Methoden vor, EMT endokardiale und post-EMT mesenchymalen Zellen, die die beiden verschiedenen Zell-Phänotypen der prevalvular Kissen sind zu isolieren. Pre-EMT endokardiale Zellen können mit oder ohne den Herzmuskel gezüchtet werden. Post-EMT AV Kissen mesenchymalen Zellen können in mechanisch eingeschränkt oder Stress-free Kollagengelen kultiviert werden. Diese 3D-in vitro-Modelle zu imitieren Schlüssel valvular morphogenic Veranstaltungen und sind für die Dekonstruktion der Mechanismen der Früh-und Spätstadium valvulogenesis nützlich.

Protokoll

1. Vorbereitung

1. Inkubieren fruchtbaren Wachtel oder Hühnereier zu Stufe 14 ^- (ca. 2 Tage) oder 25 (ca. 4,5 Tage) bei 60% Luftfeuchtigkeit und 37 ° C.
2. Bereiten Sie sterile Earls Balanced Salt Solution (EBSS)
   1. Add 100 ml 10x EBSS zu 600 ml 18 MOhm Wasser
   2. Add 2,2 g Natriumbicarbonat
   3. Den pH-Wert der Lösung auf 7,2
   4. Bringen Sie die Lösung bis zu 1000 ml
   5. Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter
3. Bereiten Sie sterile M199 Kulturmedium.
   1. Add 1 Packung M199 Pulver zu 700 ml 18 MOhm Wasser.
   2. Add 2,2 g Natriumbicarbonat
   3. Den pH-Wert der Lösung auf 7,2.
   4. Fügen Sie 10 ml (1%) Penicillin-Streptomycin
   5. Bringen Sie die Lösung bis zu 1000 ml
   6. Sterilisieren Sie die Lösung, indem sie durch einen 0,2 um Filter
   7. 1 ml sterile 100X Insulin-Transferrin-Selen-G zu ergänzen
   8. Fügen Sie 10 ml (1%) sterile Hühnerserum
4. Bereiten dreidimensionalen Kollagen-Gelen bei einer Kollagen-Konzentration von 1,5 mg / mL. Frühere Arbeiten in unserem Labor haben gezeigt, dass eine Kollagen-Konzentration von mehr als 1,5 mg / mL eine Matrix, die auch biomechanisch steif ist für die Zellen durch Umzug nach zur Verfügung stellt. Collagen-Gel-Konzentrationen unter 1,5 mg / mL haben so wenige Kollagenfasern, die die Zelle verklumpen die Fasern lokal shred, produziert eine Insel der Zellen.
   1. Fügen Sie die folgenden eiskalten Reagenzien in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen in dieser Reihenfolge:
      • 3X M199: Volume = Gesamtvolumen notwendig / 3
      • Sterile 18 MOhm Wasser: Volume = Gesamtvolumen notwendig (M199 Volumen + Hühnerserum Volumen + 0,1 M NaOH Volumen + Kollagen Volumen)
      • Sterile Hühnerserum: Volume = Gesamtvolumen notwendig * 0,01
      • Rattenschwanz Kollagen I: Volume = (Kollagen-Gel-Konzentration * Volumen erforderlich) / Kollagen Lager Konzentration
      • Sterile 0,1 M NaOH: Volume = Kollagen Volumen * 0,2
        Hinweis: Die Menge an Wasser, 0,1 M NaOH, und Kollagen aufgenommen wird je nach der Konzentration der Kollagen-Stammlösung.
   2. Mischen Sie die Kollagen-Lösung auch mit einer sterilen Pipette.
   3. Sofortüberweisung 0,3 ml der Kollagen-Lösung in 1,9 cm ² Wachstum Bereich Brunnen. Das ist genug Kollagenlösung vollständig decken die gut und zu einem Gel, das ca. 3 mm dick ist bereitzustellen. Ein Gel Dicke von mindestens 250 um, die für Zell-Invasion Studien.
   4. Lassen Sie die Kollagen-Lösung zum Gel für mindestens 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO _2, und 100% Luftfeuchtigkeit.

2. Pre-EMT Endocardial Zellisolation und Kultur

1. Embryo isoliert
   1. Legen Sie ein Zoll langes Stück Labor Klebeband über das größere Ende des Eies. Hier wird die Luft-Zelle befindet. Das Band stabilisiert das fragile Wachtelei Shell.
   2. Gently Punktion der abgeklebt Bereich der Eizelle in der Luft-Zelle mit der Spitze des sterilisiert gebogene Schere.
   3. Schneiden Sie ein Loch in den abgeklebten Teil der Eier, die groß genug, damit das Eigelb passieren wird. Starten Sie das Loch an der Einstichstelle und schneiden nach außen in Form einer Spirale. Achten Sie darauf, durch die äußere Membran geschnitten, aber vermeiden piercing das Eigelb.
   4. Wenn das Loch in der Schale abgeschlossen ist, visualisieren die Wachtel Embryo. Der Embryo wird in der Regel auf der Oberseite des Dotters liegt.
   5. Beginnen Sie das Eigelb durch das Loch geschnitten in das Ei gießen mit einer Hand. Halten Sie ein # 55 Pinzette in der anderen Hand. Da der Embryo verlässt das Ei auf der Oberseite des Dotters, schieben Sie die Nr. 55 Pinzetten unter dem Embryo und entfernen Sie es aus dem Eigelb. Hinweis: Bei Hühnereiern, geht der Embryo isoliert Knacken des Hühnereis auf eine scharfe, saubere Oberfläche und bricht das Ei in eine 100 mm Petrischale. Der Embryo ist auf der Oberseite des Eigelbs befinden. Schieben Nr. 55 Pinzetten unter dem Embryo und entfernen Sie es aus dem Eigelb.
   6. Setzen Sie den Embryo in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem, sterilen EBSS.
2. Stufe die Embryonen nach den Kriterien der Hamburger und Hamilton ^1. Embryonen im Stadium 14 ^- sind vorbei Stufe 13, aber noch nicht im Stadium 15, mit 20-21 Somiten und einem Schwanz Knospe. Ein wesentliches Merkmal der Stufe 14 ^- Embryonen ist der Kopf Winkel, der etwas größer ist als 90 °, um den Körper ist.
3. Entfernen Sie die Herzen von Wachteln Embryonen im Stadium 14 ^- mit Nr. 55 Pinzetten, indem quer, wo der AV-Kanal und OFT Kontakt mit der Brustwand. Legen Sie die Herzen zusammen auf einer Seite der Petrischale.
4. Sammeln Sie die isolierten Herzen mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in eine neue 100 mm-Petrischale mit sterilem, eiskaltem EBSS gefüllt.
5. Schneiden Sie die OFTs und AV Kanälen quer aus dem Ventrikel mit Nr. 55 Pinzetten.
6. Section der übrigen AV Kanäle und / oder Abfluss Traktate (OFTs) in Längsrichtung.
7. Set einer Pipette auf ein Volumen von 20 uL. Mit dieser Pipette absaugen zu sechs längs geschnitten AV Kanäle und OFTs.
8. Vertreibt die AV Kanäle und OFTs auf die Kollagen-Gel. Absaugen überschüssigen EBSS von der Oberfläche des Gels.
9. Verwenden Sie # 55 Pinzetten zur Ausrichtung der Explantate, so dass sie flach sind und so das Lumen Seitenflächen der Kollagen-Gel. Versuchen Sie nicht, Punktion der Kollagen-Gel mit der Pinzette.
10. Nach 2 Stunden bei 37 ° C und 5% CO _2, entfernen Sie das Myokard von der Explantate mit Nr. 55 Pinzetten. Die endokardiale Zellen sollten hinter der Oberfläche des Kollagen-Gel gelassen werden. Alternativ kann der Herzmuskel auf dem Explantat gelassen werden. Mit dem Myokard entfernt, durchlaufen die endokardiale Zellen mit nicht EMT ohne Intervention. Mit dem Myokard stellen eine Teilmenge der Endokard-Zellen werden in Mesenchym zu verwandeln, aber der Grad der Transformation moduliert werden kann mit externen Faktoren. Hinweis: Auch wenn das Myokard auf gelassen werden, das Explantat muss eine Frist von mindestens 2 Stunden, um das Gel zu befestigen, bevor Medium zugegeben.
11. Fügen Sie 0,4 ml M199 Medium in jede Vertiefung mit Explantaten.
12. Kultur der Zellen bei 37 ° C, 5% CO _2, und 100% Luftfeuchtigkeit.

3. Post-EMT AV Cushion mesenchymalen Zellen Isolation und Kultur

1. Crack the Hühnerei auf eine scharfe, saubere Oberfläche und brechen das Ei in eine 100 mm Petrischale. Der Embryo ist auf der Oberseite des Eigelbs befinden. Nehmen Sie den Embryo mit Nr. 5 Pinzette durch Greifen der Membranen um den Embryo und dann den Embryo in eine 100 mm Petrischale mit eiskaltem, sterilen EBSS gefüllt.
2. Stufe die Embryonen nach den Kriterien der Hamburger und Hamilton ^1. Merkmale einer Stufe 25 Embryos sind ausgeprägte Ellenbogen-und Kniegelenke und leichte Auge Pigmentierung.
3. Isolieren Sie die Herzen von allen HH25 Embryonen und legen Sie die Herzen zusammen auf einer Seite der Petrischale.
4. Sammeln Sie die isolierten Herzen mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in eine neue 100 mm-Petrischale mit sterilem, eiskaltem EBSS gefüllt.
5. Isolieren Sie die AV Region aus allen Herzen auf einmal. Legen Sie die AVs zusammen auf einer Seite der Petrischale. Vorsichtig geschwenkt, die AV-Region für alle Blut, das die Lebensfähigkeit der Zellen beeinflussen können, zu entfernen.
6. Sammeln Sie die isoliert AVs mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in eine neue 100 mm-Petrischale mit sterilem, eiskaltem EBSS gefüllt.
7. Sequenziell isolieren die Kissen aus dem AV. Stellen Sie sicher, es gibt keine Myokard auf dem AV Kissen.
8. Sammeln Sie die isoliert Kissen mit einer sterilen Transferpipette und legen Sie sie in ein steriles 15 ml Zentrifugenröhrchen.
9. Drehen Sie das Kissen auf den Boden der Zentrifugenröhrchen bei 15 xg für 3 Minuten.
10. Verwenden Sie eine sterile 1000 mL Spitze, so viel von der EBSS Überstand wie möglich, ohne die Kissen zu entfernen.
11. 1 ml 0,25% Trypsin-EDTA, die auf 37 vorgewärmten ° C. Lassen Sie das Kissen in Trypsin inkubiert, bis sie vollständig gelöst sind, ist in der Regel ca. 3-5 Minuten.
12. Add 100 L Hühnerserum die Zentrifugenröhrchen, um das Trypsin zu stillen.
13. Pellet die Zellen bei 160 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen, 1000 ul Spitze.
14. Resuspendieren der Zellen in 2 ml M199 Medium und durch Pipettieren gründlich mischen. Nehmen Sie sich 10 ul der Zellsuspension auf Zählkammer zählen und bestimmen die Gesamtzahl der Zellen, die isoliert wurden
15. Ermitteln Sie, wie viele Kollagengelen basierend auf der Anzahl der Zellen isoliert gemacht werden. Zellen müssen bei einer Dichte von 2 x 10 ⁵ Zellen / ml mit einer 250 ul Gelvolumen beschichtet werden.
16. Pellet die Zellen bei 160 xg für 5 Minuten. Entfernen Sie den Überstand mit einer sterilen, 1000 ul Spitze.
17. Mit dem Protokoll aufgeführten, fügen 3X M199, Wasser-, Hühner-Serum, Kollagen und 0,1 M NaOH, in dieser Reihenfolge, um das Zellpellet. Mix von sanften Pipettieren.
18. Add 250 ul jeder 1,9 cm ² Wachstum Gegend sehr gut.
19. Lassen Sie die Kollagen-Lösung zum Gel für mindestens 1 Stunde bei 37 ° C, 5% CO _2, und 100% Luftfeuchtigkeit.
20. Fügen Sie 0,4 ml Kulturmedium und Inkubation über Nacht.
21. Um weiterhin die Kultivierung der Gele in stressfreien Bedingungen, befreien die Gele von den Seiten der Kultur und mit einer sterilen 200 ul Pipettenspitze. Mechanisch eingeschränkt Kulturen sind Gele, die auf die Seiten der Kultur verbunden bleiben gut.

4. Repräsentative Ergebnisse

Abbildung 1:. Beispiele von Embryonen (A) HH14-Wachtel Embryo, und (B) HH25 Hühnerembryo werden hier gezeigt.

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Abbildung 2: HH14-Ventil endokardiale Explantate nach 2 Stunden der Kultur (A) mit dem Myokard vorhanden ist, oder (B) mit dem Myokard entfernt..

Abbildung 3:. HH14-Ventil endokardiale Explantate (A) Mit dem Myokard präsentieren, haben viele der Zellen endokardiale mesenchymale Transformation und haben einen spindelförmigen, mesenchymalen Phänotyp nach 48 Stunden Kultur. (B) Wenn der Herzmuskel ist alles von den Zellen entfernt halten einen Pflasterstein-förmig, endokardiale Phänotyp nach 48 Stunden in Kultur.

Abbildung 4:. HH25 Ventil mesenchymalen Zellen in einem Kollagen-Gel Zellen werden sofort nach der Aussaat abgerundet.

Abbildung 5:. HH25 mesenchymalen Zellen in Kultur (A) Nach 48 Stunden Kultur in einem eingeschränkten Kollagengel der HH25 mesenchymalen Zellen beginnen sich zu verbreiten. (B) HH25 Zellen in einer stressfreien Kollagengel 7 Tage nach der Aussaat und 6 Tage nach der Befreiung habe das Gel auf ca. 50% der ursprünglichen Fläche verdichtet.

Diskussion

Das Verfahren zur Isolierung von Zellen aus endokardiale Bühne HH14 ^{- hearts} ursprünglich von Runyan und Markwald entwickelt eine kontrollierte, in vitro Umgebung, um die Faktoren, und initiieren modulieren embryonalen ^{EMT-2-Studie.} HH14 ^- endokardiale Explantate ohne Myokard kultiviert wird nicht unterziehen EMT ohne biomechanische oder biochemische Intervention. Wenn der Herzmuskel auf dem Explantat linken Seite ist es Signal eine Teilmenge von endokardiale Zellen mesenchyma...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Extra fine Bonn scissors, curved	Fine Science Tools	14085-08
Dumont tweezers #55	World Precision Instruments, Inc.	14099
Dumont tweezers #5	World Precision Instruments, Inc.	14098
Sterile transfer pipettes	Samco Scientific, Thermo Fisher Scientific	2041S
4-well culture plates	Nalge Nunc international	176740
Sterile disposable filter units, PES, 0.2 μm pore size membrane	Nalge Nunc international	566-0020
Sterile 15 mL centrifuge tubes	Corning	430828
Sterile petri dishes, 100 mm x 15 mm	VWR international	25384-342
Laboratory tape	VWR international	89097-920
Rat-tail collagen I	BD Biosciences	354236
10X Earl’s Balanced Salt Solution	Quality Biological, Inc.	119-064-131
M199 powder	Invitrogen	31100-035
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-122
Insulin-Transferrin-Selenium-G supplement (100X)	Invitrogen	41400-045
Chicken serum	Invitrogen	16110-082
0.25% Trypsin-EDTA	Invitrogen	25200-056
Sodium bicarbonate	Sigma-Aldrich	S5761
Sodium hydroxide solution, 1.0 N	Sigma-Aldrich	S2770
Fertile quail eggs (Coturnix coturnix)	Lake Cumberland Game Bird Farm
Fertile chicken eggs (Gallus gallus)	Cornell University Poultry Farm