الطعوم الوعائية الهندسة البيولوجية ، عن طريق بناء مفاعل حيوي نابض

Summary

وقد وضعت مجموعتنا نظام الثقافة مفاعل حيوي الذي يحاكي تؤكد نابض الفسيولوجية للنظام القلب والأوعية الدموية لتجديد زرع صغيرة قطرها ترقيع الأوعية الدموية.

Abstract

وقد كرس الكثير من الجهد لتطوير وتعزيز منهجية لتجديد وظيفية صغيرة قطرها يتجاوز الشرايين. في البيئة الفسيولوجية ، وكلاهما مطلوب تحفيز الميكانيكية والكيميائية للحفاظ على التنمية السليمة وظيفة ^1،2 الأوعية الشريانية.

تم تصميم أنظمة الثقافة مفاعل حيوي وضعتها مجموعتنا لدعم تجديد السفينة ضمن بيئة الكيماوي والميكانيكية التي تسيطر على وجه التحديد تحاكي السفن الأم. جمعيتنا مفاعل حيوي وإجراءات الصيانة بسيطة نوعا ما ومتكررة للغاية ^3،4. هي المصنفة خلايا العضلات الملساء (SMCs) على حمض polyglycolic أنبوبي (PGA) أن شبكة مترابطة عبر أنابيب من السيليكون ومتوافقة مع مثقف في مفاعل حيوي مع أو بدون تحفيز نابض لمدة تصل إلى 12 أسبوعا. هناك أربع سمات رئيسية تميز مفاعل حيوي لدينا من بعض أسلافه. 1) خلافا للأنظمة التي تحاكي ثقافة أخرى فقط البيوكيميائية المحيطة الأوعية الدموية الأصلية ، مفاعل حيوي لدينا أيضا بإنشاء البيئة الفسيولوجية نابض عن طريق تطبيق سلالة شعاعي دوري للسفن في مجال الثقافة. 2) ويمكن تربيتها السفن المهندسة متعددة في وقت واحد في ظل ظروف الميكانيكية المختلفة داخل بيئة الكيميائية الخاضعة للرقابة. 3) ومفاعل حيوي يسمح طبقة أحادية من الخلايا البطانية (EC) لتكون مغلفة بسهولة على الجانب اللمعية السفن هندسيا لزرع النماذج الحيوانية. 4) يمكن للمفاعل حيوي لدينا تراوحت أيضا السفن الثقافة هندسيا مع حجم قطرها مختلفة من 1 مم إلى 3 مم ، وتوفير الجهد لتكييف كل فرد مفاعل حيوي لتتناسب مع حجم قطرها محددة.

هندسة السفن مثقف في مفاعل حيوي لدينا تشبه الأوعية الدموية الأصلي تشريحيا إلى حد ما. الخلايا الموجودة في جدران الأوعية التعبير عن علامات النضج SMC مقلص مثل العضلات الملساء ميوسين الثقيلة سلسلة (SMMHC) ^3. وتودع وكمية كبيرة من الكولاجين داخل المصفوفة خارج الخلية ، والتي هي المسؤولة عن القوة الميكانيكية النهائي للهندسة السفن ^5. تحليل البيوكيميائية يشير أيضا إلى أن محتوى الكولاجين السفن هندسيا هو مماثلة لتلك الشرايين الأصلية ^6. الأهم من ذلك ، وإعادة إنشاء مفاعل حيوي نابض باستمرار السفن التي يحمل الخواص الميكانيكية التي تسمح التجارب الناجحة في غرس ^3،7 النماذج الحيوانية. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تعديل هذه مفاعل حيوي للسماح للمزيد من الوقت الحقيقي وتقييم ومتابعة إعادة عرض الكولاجين مع مرور الوقت ، غير جراحية ، وذلك باستخدام المجهر الضوئي غير الخطي (NLOM) ^8. وختاما ، ينبغي لهذه مفاعل حيوي بمثابة منصة مثالية لدراسة الآليات الأساسية التي تنظم تجديد الطعوم الصغيرة القطر وظيفية في الأوعية الدموية.

Protocol

الأوتوكلاف

تجميع والأوتوكلاف أنابيب لنظام تدفق ومكونات مفاعل حيوي (مفاعل حيوي نفسها وغطاء سدادة سيليكون) كما أمرهم في الشكل 1 والشكل 2. تغذية أنبوب موصل الذكور واحدة على نهاية ونهاية مفتوحة على الجانب الآخر. يتم إدراج ثلاثة أجزاء قصيرة من خلال أنابيب من السيليكون غطاء لتبادل الغاز.

1. شبكة الخياطة PGA

1. شبكة لخفض PGA 1.1cm X ~ ورقة 8cm (هذا يعتمد على حجم مفاعل حيوي).
2. تنظيف أنابيب السيليكون (3mm القطر الداخلي) مع الماء المقطر (dH20) ، والهواء الجاف قبل الاستخدام.
3. استخدام Dexon 6.0 خياطة لحياكة شبكة PGA حول أنابيب السيليكون نظيفة تبدأ مع ثلاثة عقدة جراحية يليها غرزة واحدة.

2. PGA السقالات معالجة السطح

1. تراجع السقالات PGA في هيدروكسيد الصوديوم 1M ل2min - 1 ، وسجل في الوقت معالجة واستخدام نفس الوقت بالنسبة لجميع السقالات PGA.
2. شطف PGA السقالات في الحمامات dH2O لمدة 2 دقيقة 3 مرات.
3. بات PGA السقالات الجاف مع Kimwipes بين كل تراجع في الحمامات درهم O _2.
4. PGA الجافة السقالات تحت غطاء زراعة الأنسجة في الهواء الجاف لمدة 15 دقيقة مع منفاخ جرا.

3. الأسلحة الداكرون الخياطة

1. استخدام Prolene 4.0 خياطة لحياكة قطع صغيرة من الأصفاد الداكرون (1cm) على كل طرف من طرفي الشبكة مع شبكة تداخل 3mm - 2. ملاحظة : يجب الحرص على عدم ثقب أنابيب السيليكون (الشكل 3).
2. استخدام نفس خياطة لحياكة ثلاث غرز في حوالي نهاية خالية من الداكرون الأصفاد. تأكد من أن تترك ما يكفي من الغرز في نهايات خالية من الدرز Prolene للخطوة 5.1 (الشكل 3).

4. التجمع من تفاعلات الاحيائية (اليوم قبل بداية ثقافة مفاعل حيوي)

1. نقع شبكة أنابيب مخيط والسيليكون ، والأدوات الجراحية ، وسلك رقيق في حمام الإيثانول 70 ٪ لمدة 20-30 دقيقة.
2. فتح الحقائب التي تحتوي على مفاعل حيوي الأوتوكلاف ويغرق في حمام الايثانول 70 ٪ على الأقل 30 دقيقة قبل التجميع. تأكد من تدفق مفاعل حيوي تماما مع الايثانول. التعرض لجميع مكونات مفاعل حيوي لالايثانول 70 ٪ خطوة التعقيم بالإضافة إلى ذلك. هذه الخطوة كما يزيل الذيفان الداخلي ، والتي لا تزال من قبل التعقيم ومؤذية للخلايا الأوعية الدموية.
3. سحب أنابيب السيليكون من خلال استخدام السلاح جنبا إلى سلك رقيقة من خلال سحب.
4. أخذ حمام مفاعل حيوي من الإيثانول (الحفاظ على شبكة الغارقة في الايثانول). إصلاح سقالة داخل مفاعل حيوي الشبكة بواسطة الربط الأصفاد الداكرون على الشفاه من خلال تشديد الزجاج اشتعل وربط الغرز Prolene أسفل (الشكل 3).
5. ربط جانب واحد من الأسلحة إلى جانب مفاعل حيوي الروابط عبر أنابيب السيليكون.
6. سحب الجانب الآخر من أنبوب السيليكون مع ما يكفي من التوتر وإدراج المتبقيين الموصلات في أنابيب السيليكون. الابقاء على أنابيب السيليكون بإحكام عند إدراج الروابط!
7. معاودة مفاعل حيوي في حمام الإيثانول والاحمرار مع الإيثانول عن طريق سحب بلطف موصلات من الأسلحة الجانبية.
8. مفاعل حيوي على الوجه والسماح لينقع لمدة 10 دقيقة.
9. مفاعل حيوي الوجه الجانب الأيمن وحتى نقع لمدة 10 دقائق إضافية.
10. استنزاف جميع الايثانول.
11. إقامة ثلاثة أطباق بتري كبير (10 سم) في السلسلة ، ومكان مفاعل حيوي في وسط الطبق لعقد الايثانول الزائد يسيل من نهايات الأنابيب.
12. تدفق مفاعل حيوي وشبكات المياه مع PGA زراعة الأنسجة باستخدام 5ml أو ماصة 10ML. زراعة الأنسجة أيضا تدفق المياه في أنابيب السيليكون.
13. هجرة شاملة في جميع المياه الزائدة إلى أطباق بتري على جانبي مفاعل حيوي.
14. الجافة مفاعل حيوي بين عشية وضحاها في هود مع منفاخ وإيقاف الأشعة فوق البنفسجية.
15. ملاحظات إضافية : التأكد من تعقيم بقضيب في مفاعل حيوي. تأكد من عدم "تحوم" على مفاعل حيوي من هذه النقطة إلى الأمام ، لتفادي التلوث. تقطيع الكثير من شرائط parafilm ونقع عليها في حمام صغير الايثانول 70 ٪ (كبير طبق بتري يعمل بشكل جيد).

5. يوم 1 : إعداد تفاعلات الاحيائية

1. طبق بتري مكان معقم على افتتاح كل مفاعل حيوي لحماية الشبكة من داخل سقالة الملوثات.
2. تجميع نظام تدفق لمفاعل حيوي كما هو مبين في الشكل (4) وparafilm جميع مفاصل الصدد.
   1. مسح الروابط الأولى مع مناديل الكحول.
   2. إرفاق منفذ الحقن لتسليح والثالث غير المستخدمة من مفاعل حيوي.
   3. إزالة أنابيب الفظ وربطة عنق زرقاء قبالة نهاية التخفيف المالحة النحو بالقرب من مفترق - Y ممكن. سحب المشبك أنبوب في المكان لضمان عدم تحويل السائل الى هذا الجزء من الأنبوب
   4. رابعا إزالة كيس ، ونعلق أنابيب الفظ (الحمراء) إلى نهاية بكثير من حقيبة الرابع. تأكد من أن يمسح الميناء الإدراج مع الكحول يمسح الأولى.
   5. نعلق الفظ من جانب واحد من نظام التدفق (عبر أنبوب نهاية بيضاء).
   6. إدراج 3 محبس الطريقة في نظام التدفق.
   7. إزالة محول الضغط والاتصال ثلاثي محبس.
   8. إرفاق الطرف الآخر من محول الضغط لفتح في منتصف الحقيبة.
3. ربطفي مفاعل حيوي لنظام تدفق عبر تقاطع ص. استخدام حقنة 60ml إضافة 350ml من 1 ٪ fungizone (المزيج fungizone 5ml مع 495ml من PBS) للكيس الرابع.
4. رابعا ضغط كيس لطرد نظام تتدفق من خلال تعديل للسماح الديوك وقف تدفق PBS. ملاحظة : الاختيار داخل مفاعل حيوي لضمان عدم وجود تسرب.
5. اعادة تعليق 8 X10 ⁶ SMCs (حوالي واحد متموجة T75) في 1.25ml المتوسط ​​والبذور على كل scafffold PGA. تأكد من تم تعليق خلية يسيل بشكل موحد على شبكة مفترق - الداكرون PGA كذلك على الجانب السفلي من شبكة PGA.
6. مسح حافة مفاعل حيوي مع الكحول يمسح عن طريق تناوب مفاعل حيوي تجنب تحوم جانبية.
7. سيليكون التجمع غطاء سدادة (الشكل 2)
   1. قشر كيس الأوتوكلاف بعناية مرة أخرى ، والتأكد من عدم تعرض الجزء السفلي من الغطاء.
   2. إرفاق منفذ الحقن لأنبوب تغذية في الموصل الذكور.
   3. إرفاق مرشحات 0.20 ميكرون PTFE إلى كل من المنافذ الجوية الثلاث.
   4. يجب الحرص على عدم تعريض / لمس الجزء السفلي من الغطاء أثناء هذه العملية.
   5. Parafilm منفذ الحقن.
8. تضاف غطاء سدادة السيليكون في مفاعل حيوي والزجاج ، وتأكد من أن أنبوب تغذية داخل مفاعل حيوي لا تلمس PGA السقالات المصنفة. Parafilm حول الغطاء.
9. مكان مفاعل حيوي مع نظام التدفق داخل الحاضنة (على جنب) وتدوير مفاعل حيوي كل 5 دقائق لمدة 25-30 دقيقة.
10. ملء الغرفة مفاعل حيوي مع 400ml من وسائل الإعلام ثقافتنا 40-10 كما هو موضح في الجدول (1). هو "تحسين" هذه الوسيلة للثقافة الشرايين الخنزيري هندسيا.

6. يوم 07/06 : تشغيل المضخة ، وتغذية الأولى

1. نمو ثابت السقالات المصنف دون أي نابض الضخ عبر أنابيب للسيليكون 6-7 أيام. ليست هناك حاجة للتغيير أو متوسطة أو فيتامين C خلال هذا الوقت.
2. تأكد من عدم وجود تسرب في برنامج تلفزيوني أو مجعد أنابيب نظام تدفق قبل تشغيل المضخة.
3. بدوره على مضخة لنظام تدفق وتأكد من ضبط وضع مضخة الضغط بحيث يقرأ 270/-30mmHg تقريبا.
4. سجل الضغوط اليومية في جميع أنحاء الثقافة والمحافظة على الضغط في 270/-30mmHg. يمكن توصيل محول الضغط على جهاز كمبيوتر لقراءة ورصد الضغط.

أولا تغذية

5. تجميع وحقن ميناء تصفية PTFE على تغذية أغطية لكل تغيير والمتوسطة والمتوسطة إفادة أغراض النفايات.
6. وضع أنبوب تغذية بحزم على مضخة واحدة من نهاية إلى إدراج التغذية منفذ لمفاعل حيوي والطرف الآخر للغطاء التغذية. تأكد من مسح المنافذ الحقن مع مناديل الايثانول.
7. استخدام مضخة Masterflex ثنائي الاتجاه لضخ 200ml من المتوسط. ثم استخدام أنبوب تغذية جديدة لضخ 200ml المتوسطة الطازجة العودة الى مفاعل حيوي. تبدأ دائما مع سرعة بطيئة جدا ، وخصوصا عندما يعود ضخ المتوسطة لمفاعل حيوي.
8. تغيير متوسطة و2x/week مكملات حمض الاسكوربيك. لإضافة حامض الاسكوربيك ، واستخدام حقنة لإخراج 30ml 25ml المتوسطة وضعه جانبا في غطاء محرك السيارة الأنسجة. حل 25mg حامض الاسكوربيك في 5ml من برنامج تلفزيوني والتصفية عليه من خلال 0،22 ميكرون التصفية. أولا حقن حمض الاسكوربيك العقيمة في أنبوب التغذية وإضافة دعم المتوسطة 25ml اتخذت في وقت سابق. يعطى صفة المتوسطة في الجدول رقم 1.

7. ممثل النتائج :

الشكل 1. يظهر الأنابيب والموصلات لتدفق التجمع النظام المذكور أعلاه.

الشكل 2. يظهر غطاء سدادة التجمع السيليكون أعلاه.

الشكل 3. وتظهر الرسومات التجمع مفاعل حيوي أعلاه. الداخل يتم تثبيتها في الأصفاد الداكرون مفاعل حيوي على الأسلحة الزجاج مع عقدة الخيط الأزرق.

الشكل 4. ويبين نظام تدفق متصلة أنابيب ومفاعل حيوي أعلاه ، كما سيتم ضخ أنابيب L/S18 بواسطة مضخة Masterflex والقيادة وبالتالي التدفق. سوف محول الضغط قياس الضغط قبل دخول مفاعل حيوي في مجرى العلوي.

الشكل 5. صورة لسفينة المهندسة المقطوع. سوف السفن المهندسة يبدو أن مبهمة وتحقيق سمك جدار 250μm بعد حوالي 8 أسابيع في ظل ظروف ثقافة نابض.

الشكل 6. وHaematoxylin يوزين ملطخة المقاطع العرضية للسفن هندسيا. A و B - 8 الاسبوع غير نابض ونابض السفن ، على التوالي.C و D والتي تستمر 4 أسابيع السفن غير نابض ونابض ، على التوالي. L يشير الجانب اللمعية من السفن. شريط جداول و100μm.

الشكل 7. ثلاثي الألوان والبقع ماسون لالكولاجين (الأزرق) لقطاعات عرضية من السفن هندسيا. A و B هي 8 أسابيع السفن غير نابض ونابض ، على التوالي. C و D والتي تستمر 4 أسابيع السفن غير نابض ونابض ، على التوالي. علما بأن السفينة لمدة 4 أسابيع نابض يظهر المزيد من الكولاجين من نظيره غير نابض والخمسين. السهام البيضاء المتبقية أشر إلى شظايا PGA في السفن. شريط جداول و100μm.

الشكل 8. كيمياء مناعية تلطيخ علامات SMC في الشرايين المهندسة البقري. العضلات الملساء α - أكتين ، calponin - 1 ، وعلى نحو سلس العضلات سلسلة الميوسين الثقيلة (SMMHC) يتم في وقت مبكر ، وسيطة ، وأواخر علامات مقلص SMC ، على التوالي. بحلول نهاية الأسبوع ال 12 والثقافة ، والخلايا في جدار الوعاء الدموي أعرب SM - α أكتين وكميات معتدلة من Calponin - 1 و SMMHC. شريط جداول و20μm.

مكون	مبلغ
DMEM (DME / منخفضة معدلة)	500 مل
FBS (الجنين مصل الأبقار) الحرارة المعطل	100 مل
HEPES 1.0 M	5ml
فيتامين C (المنحلة في برنامج تلفزيوني أو DMEM)	25 ملغ
البرولين / جليكاين / ألانين mg/25 mg/10 25 ملغ (المنحلة في 5ml من PBS)	5ml
4 كبريتات النحاس 1.5 ميكروغرام (المنحلة in1 مل من PBS)	1ml
البنسلين G في 10000 وحدة / مل	5ml
PDGF - BB (صفائح المستمدة عامل النمو - BB) في 10ng/ml	5μg
bFGF (عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية) في 10ng/ml	5μg

الجدول 1. وتظهر عناصر المتوسط ​​"4-10" في الجدول أعلاه. فباستثناء PDGF - BB وbFGF ، وجميع المكونات الأخرى لتتم تصفيته من خلال مرشح 0.2μm قبل الاستخدام.

Discussion

نوعية السفن هندسيا هو في جزء كبير منه تمليه نوعية SMCs المستخدمة في زراعة الأنسجة. الجوانب الحاسمة في النمط الظاهري SMC تشمل مورفولوجيا مقلص ، وانخفاض عدد الممر ، والقدرة على التكاثر داخل مفاعل حيوي. نوصي بأن يكون أكبر عدد ممر لا يتجاوز P3 في وقت البذر الخلية على السقالة ا...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف / مواد	المزود	رقم كتالوج
FBS (الجنين المصل البقري) الحرارة المعطل	HyClone	SH30071
DMEM	GIBCO	11885
rhFGF - الأساسية	R & B	234 - FSE
rrPDGF - BB	R & B	520 - BB
Penicilin G	سيغما	بينا
النحاس (II) سلفات	سيغما	C8027
Gylcine	سيغما	C8790
L - ألانين	سيغما	A7469 - 25G
L - برولين	سيغما	P5607 - 25G
حمض الأسكوربيك	سيغما	A4544 - 25G
HEPES	سيغما	H3375 - 100G
سيليكون سدادة	كول - Parmer	06298-24
Masterflex أنابيب L / S	كول - Parmer	06508-16 ، 06508-18
Masterflex مضخة	كول - Parmer	7553-80
الداكرون الكفة	ماكيه	174406
ورأى PGA	كونكورديا	MO000877 - 01
1.5 متري 4-0 Surgipro الثاني خياطة	Syneture	VP - 557 - X
6-0 0.7 خياطة Dexon متري	Syneture	7538-11
0.22μm PTFE مرشحات	Whatman	6780-2502
ثلاثة الطريق وقف الديك	ادواردز Lifesciences	593WSC
محول الضغط	ادواردز Lifesciences	PX212
أكياس الرابع	باكستر	R4R2110
تخفيف المالحة تعيين	سهم	W20030
سيليكون أنابيب	سان جوبان	F05027