سبع خطوات لخلايا النجمية

Summary

نحن هنا تصف طريقة لعزل الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. لتنقية الخلايا النجمية ، يتم هضمها كبد الفأر في الموقع و في المختبر من جانب pronase - كولاجيناز العلاج قبل الطرد المركزي المتدرج الكثافة. هذه التقنية عالية الغلة نقية الخلايا النجمية الكبدية.

Abstract

الخلايا النجمية الكبدية والكبد وخلايا المقيمين النجوم مثل التشكل وتقع في فضاء Disse بين خلايا الكبد والبطانية الجيبية ^1،2 خلايا الكبد. يتم اشتقاق الخلايا النجمية من السلائف نخاع العظم وتخزين ما يصل الى 80 ٪ من فيتامين A الجسم الكلي ^{1 و 2.} عند التنشيط ، والخلايا النجمية تفرق في myofibroblasts لإنتاج المصفوفة خارج الخلية ، مما يسهم في تليف الكبد ^3. على أساس قدرتهم على العقد ، يمكن أن الخلايا النجمية myofibroblastic ينظم نغمة الأوعية الدموية وارتفاع ضغط الدم يرتبط المدخل ^4. مؤخرا ، أظهرت لنا أن الخلايا الكبدية النجمية هي خلايا مولدة قوية ، ويمكن تقديم تنشيط خلايا NKT فضلا عن الخلايا اللمفية تي التقليدية ^5.

هنا نقدم طريقة لإعداد كفاءة الخلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر. نظرا لتوطين perisinusoidal بهم ، وعزل الخلايا الكبدية النجمية هي عملية متعددة الخطوات. لجعل الخلايا النجمية للوصول إلى العزلة من مساحة Disse ، يتم perfused كبد الفأر في الموقع مع Pronase E الهضمي الانزيمات وكولاجيناز P. التروية بعد ، يخضع للعلاج أنسجة الكبد الأنزيمية إضافية مع Pronase E و P في كولاجيناز المختبر. في وقت لاحق ، وطريقة الاستفادة من كمية هائلة من قطرات الدهون فيتامين A - تخزينها في الخلايا الكبدية النجمية. هذه الميزة تسمح للانفصال عن غيرها من الخلايا النجمية أنواع الخلايا الكبدية بواسطة الطرد المركزي على التدرج Nycodenz 8 ٪. بروتوكول الموصوفة هنا تعطي السكان نقية جدا ومتجانسة من الخلايا النجمية. ويمكن تقييم نقاء استعدادات لتلوين هذا البروتين علامة الدبقية جزيء ييفي الحمضية (GFAP) ، قبل التحليل المجهري مضان أو التدفق الخلوي. مزيد من الضوء ويكشف المجهر مظهر فريد من النجوم على شكل خلايا الكبدية النجمية التي تؤوي على كميات عالية من الدهون قطرات.

أخذت معا ، نقدم بروتوكول مفصلة للعزلة كفاءة الخلايا الكبدية النجمية ، بما في ذلك الصور ممثل مظهرهم المورفولوجية والتعبير GFAP التي تساعد على تحديد الجهة الخلايا النجمية.

Protocol

وينبغي أن تستخدم C57BL / 6 أسابيع في الفئران 20 ~ من العمر أو المسنين. فمن المستحسن استخدام الفئران الذكور وزنها 25 - 30G. ويمكن زيادة الغلة من الخلايا النجمية عن طريق تغذية الفئران فيتامين A - المخصب الوجبة الغذائية لمدة 2 أشهر قبل نجمي العزلة الخلية. يمكن تنقية حوالي 2x10 ⁵ خلايا الكبدية النجمية من كبد الفأر C57BL / 6 واحد ، في حين أن العائد من الخلايا النجمية من BALB / ج الفئران هي أعلى بكثير. ويتم تعديل البروتوكول التالي ل5 الفئران. وأجريت التجارب ورعاية الحيوانات وفقا للرعاية الحيوان وافق المؤسسية وبروتوكولات اللجنة الاستخدام.

1. نضح في الموقع من كبد الفأر مع الإنزيمات الهضمية

1. تدفئة العازلة SC1 والحلول نضح الانزيم في حمام ماء C ° 37.
2. شن مجموعة التسريب المجنح على أنبوب السيليكون من مضخة تمعجية.
3. معايرة المضخة مع برنامج تلفزيوني للحصول على تدفق الصفحي من 6.5ml/min ، وهو معدل التدفق الذي سيتم استخدامه لنضح في الوضع الطبيعي للكبد. يوازن أنبوب السيليكون مع SC1 الحل.
4. تخدير الماوس عن طريق الحقن داخل الصفاق من الكيتامين (90 ملغ / كلغ) وزيلازين (10 ملغ / كلغ) حل واختبار ردود الافعال عن خسارة لضمان التخدر عميقة.
5. الإصلاح الماوس في موقف ضعيف على قاعدة مناسبة.
6. استخدام المقص والملقط لإجراء شق طولي في جلد البطن وفضح البريتوني.
7. فتح بعناية الصفاق وتحريك الأمعاء خارج تجويف البطن إلى الجانب الأيمن من الحيوانات من أجل فضح الوريد البابي.
8. إدراج قنية التسريب من مجموعة إلى الوريد البابي. لهذه الخطوة ، فمن المستحسن استعمال stereomicroscope.
9. بدء نضح من الكبد مع الحل SC1 30ml. فتح الوريد الأجوف السفلي مباشرة بعد بدء التدفق. يشار بيغ النجاح في الكبد عن طريق فقدان لون أنسجة الكبد.
10. يروي الكبد مع 30ml Pronase حل E. على الهضم ناجحة ، سوف فصوص الكبد تضخم ، وسوف تظهر فصيصات متميزة من خلال الكبسولة.
11. يروي الكبد مع 30ml كولاجيناز حل ف. فقد الكبد عند هذه النقطة يبدو شكله ونائي وغير متبلور.
12. بعناية فصل الكبد من الحجاب الحاجز والأجهزة المحيطة بها وتخزينها في 70ml SC2 الحل على الجليد.
13. كرر الإجراء بالنسبة للفئران إضافية.

2. في الهضم من كبد فأر المختبر

وينبغي تنفيذ جميع الخطوات الأخرى العاملة تحت ظروف معقمة في تدفق الصفحي هود.

1. قطع الكبد إلى قطع ما يقرب من ³ 2x2x2mm باستخدام مقص حاد.
2. الجمع بين تعليق 70ml SC2 بما في ذلك قطع الكبد مع 50ml من محلول Pronase P - E كولاجيناز وإضافة 1ml من محلول أنا الدناز.
3. هضم للكبد في 37 20min C مع التحريك درجة.

3. تنبيذ متدرج الكثافة

1. تعليق تصفية خلية خلية من خلال مصافى 70μm في أنابيب فالكون 6 50ml وتضيف ما يصل الى 50ml مع SC2 العازلة. الطرد المركزي ل10min في 600G و 4 درجات مئوية.
2. نضح بعناية 40ml من طاف ، ثم تضاف حل 150μl أنا الدناز لكل أنبوب وresuspend الخلايا.
3. تجمع تعليق خلية في أنابيب فالكون 4 50ml وتغسل مع GBSS - B ، في الطرد المركزي ل10min 600G و 4 درجات مئوية.
4. نضح بعناية أكبر قدر من طاف ممكن من دون إزعاج بيليه وإضافة 150μl أنا الدناز حل لكل أنبوب. Resuspend الكريات خلية في 10ML GBSS - B في الأنبوب.
5. تجمع الخلايا في أنابيب فالكون 2 50ml وإضافة GBSS - B إلى إجمالي حجم 36ml في الأنبوب. إضافة 14ml Nycodenz حل لكل أنبوب وتخلط جيدا.
6. نقل 10ML لتعليق خلية في واحدة 12ml التدرج أنبوب الطرد المركزي ، مما أدى في 10 أنابيب في المجموع. تراكب بلطف مع التعليق الخلية في أنبوب 1.5ml GBSS - B.
7. أجهزة الطرد المركزي ل15min التدرجات في 1500g و 4 درجات مئوية دون فرامل. في وقت لاحق ، وسوف تكون مكعبات الكبد في الجزء السفلي من الأنبوب في حين تم العثور على الخلايا النجمية في الطور البيني باعتباره حلقة بيضاء.
8. الحصاد بعناية الطور البيني الذي يحتوي على الخلايا النجمية ، ويغسل لهم GBSS - B ؛ ل10min الطرد المركزي في 600G و 4 درجات مئوية.
9. نضح في وطاف resuspend الخلايا في DMEM 20ml تستكمل مع الحرارة المعطل FBS 10 ٪ ، 1 ٪ HEPES البنسلين / الستربتوميسين ، L - 2mm والجلوتامين ، البيروفات 1MM الصوديوم ، و10MM. نقل الخلايا في قوارير زراعة الأنسجة مع تركيز 2x10 ⁴ خلية / سم ^2. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5 ٪ CO _2.
10. تغيير وسائل الإعلام في أقرب وقت الخلايا الكبدية النجمية هي ملتصقة (حوالي 2H بعد الإعداد) ليغسل خلايا ميتة والحطام الخلية.
11. في اليوم التالي ، الخلية النجميةوينبغي ليالي تطوير قدراتها المميزة على شكل نجمة التشكل مع حويصلات فيتامين A - محيط بالنواة الدهون تخزينها.
12. لتجارب لاحقة ، يمكن بسهولة الخلايا الكبدية النجمية يمكن فصل من السطوح البلاستيكية غير المغلفة باستخدام حلول الأنزيمية خفيفة مثل Accutase ، على سبيل المثال

4. ممثل النتائج :

بعد إعداد الخلايا الكبدية النجمية باستخدام بروتوكول المقدمة ، ويمكن اختبار نقاء السكان المعزولين النظر في ثلاث خصائص رئيسية من هذا نوع من الخلايا ، مثل النجوم التي تشبه شكل ، قطرات الدهون محيط بالنواة ، والتعبير عن بروتين الدبقية ييفي الحمضية (GFAP ). وصفت الصور ممثل لظهور سمات نجمي الخلايا الكبدية 2H بعد عزل الخلايا ، وكذلك في يوم 1 و 3 من الثقافة في المختبر في الشكل 1. الشكل 2 يبين تلطيخ ممثل المناعي للخلايا النجمية GFAP في الكبد ، والتي تم تربيتها لمدة 3 أيام بعد عزل الخلية. الخلايا النجمية في الخلايا الكبدية التفريق myofibroblastic في المختبر خلال الثقافة. ومن السمات المميزة لهذه الخاصية تنشيط الخلايا النجمية هو تعبير عن العضلات ألفا أكتين السلس (αSMA). الشكل 3 يبين تلطيخ المناعي للأسماء وIIA الميوسين في تنشيط الخلايا النجمية في يوم 7 من الثقافة في المختبر.

الشكل 1. التشكل المميزة من الخلايا النجمية الكبدية. تم عزل الخلايا النجمية من كبد فأر باستخدام بروتوكول المقدمة. وتصور هذه المشاهد الخلايا النجمية 2H بعد عزل الخلية (أ ، ب) ، وكذلك في يوم 1 (ج) ويوم 3 (د) من الثقافة في المختبر. الخلايا النجمية الكبدية يحمل كميات كبيرة من الدهون في مواقع حويصلات محيط بالنواة واكتساب المتميزة مثل نجمي التشكل خلال الأيام الأولى من المختبر في الثقافة (التكبير 200X).

الشكل 2. الخلايا النجمية الكبدية أعرب GFAP تحديدا في الكبد. وكانت الخلايا النجمية معزولة والملون لimmunofluorescently GFAP (الحمراء) في يوم 3 من الثقافة في المختبر. وصفت نواة خلية في الزرقاء (هويشت صمة عار).

الشكل 3. خلايا الكبد النجمية تفرق في myofibroblasts. ومثقف الخلايا النجمية الكبدية المعزولة من الفئران C57BL / 6 لمدة 7 أيام. في وقت لاحق ، تم نقلهم إلى غرفة الشرائح والملون لأسماء (كما هو موضح باللون الأحمر) والميوسين IIA (كما هو مبين باللون الأخضر). وكانت نواة الخلية counterstained مع هويشت (الأزرق).

SC1 العازلة
EGTA	190mg
جلوكوز	900mg
HEPES	10 مل من محلول المخزون 1M
بوكل	400mg
غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O	151mg
كلوريد الصوديوم	8G
ناه 2 ص 4 × H 2 O	78mg
NaHCO 3	350mg
الفينول الأحمر	6mg
DH 2 O	ملء تصل إلى 1L
SC2 العازلة
CaCl 2 × 2H 2 O	560mg
HEPES	10ML من محلول المخزون 1M
بوكل	400mg
غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O	151mg
كلوريد الصوديوم	8G
ناه 2 ص 4 × H 2 O	78mg
NaHCO 3	350mg
الفينول الأحمر	6mg
DH 2 O	ملء تصل إلى 1L
GBSS - A العازلة
بوكل	370mg
CaCl 2 × 2H 2 O	225mg
جلوكوز	991mg
KH 2 PO 4	30mg
MgCl 2 × 6 H 2 O	210mg
MgSO 4 × 7 H 2 O	70mg
غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O	75mg
NaHCO 3	227mg
الفينول الأحمر	6mg
DH 2 O	ملء تصل إلى 1L
GBSS - B العازلة
CaCl 2 × 2H 2 O	225mg
جلوكوز	991mg
بوكل	370mg
KH 2 PO 4	30mg
MgCl 2 × 6 H 2 O	210mg
MgSO 4 × 7 H 2 O	70mg
غ 2 هبو 4 × 2 H 2 O	75mg
كلوريد الصوديوم	8G
NaHCO 3	227mg
الفينول الأحمر	6mg
DH 2 O	ملء تصل إلى 1L
Pronase الحل E الإرواء
Pronase E	100mg (4000 PU / دقيقة ملغ)
SC2 العازلة	200ml
كولاجيناز الحل ف الإرواء
ف كولاجيناز	85mg (1.78 U / ليو ملغ)
SC2 العازلة	200ml
Pronase الحل P - E كولاجيناز
Pronase E	50mg (4000 PU / دقيقة ملغ)
ف كولاجيناز	85mg (1.78 U / ليو ملغ)
SC2 العازلة	50ml
الدناز أنا الحل
أنا الدناز	6mg (2000U/mg كاليفورنيا.)
GBSS - B	3ml
Nycodenz الحل
Nycodenz	8G
GBSS - A	28ml

الجدول 1. مخازن والحلول المطلوبة لانزيم عزل الخلايا النجمية الكبدية. ينبغي تعديل الرقم الهيدروجيني للجميع المخازن المؤقتة إلى 7،3-7،4. وعلاوة على ذلك ، فمن المستحسن الترشيح معقمة من جميع المخازن. فمن المهم للتكيف مع كمية الانزيم المستعملة وفقا لنشاط الأنزيمي معين.

Discussion

الخلايا النجمية الكبدية تنظيم العمليات الأساسية الفسيولوجية والمرضية في جسم المريض في الكبد. علاوة على ذلك ، تمتلك خصائص الخلايا النجمية تقديم المستضد ، جعلها عنصرا هاما من عناصر الاستجابة الكبد المناعي. على الرغم من أن الخلايا الكبدية النجمية تشكل 10-15 ٪ من إجمالي ع...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم الكاشف	شركة	رقم الكتالوج
70μm خلية مصفاة	دينار بحريني	352350
CaCL 2 × 2H 2 O	سيغما الدريخ	C3306
ف كولاجيناز	روش	11249002001
DMEM	Gibco	11960
أنا الدناز	روش	10104159001
DPBS	Cellgro	21-031 - CV
EGTA	Fluka	3777
المصل البقري الجنين	Gibco	16000
جلوكوز	سيغما الدريخ	G7528
أنابيب الطرد المركزي الانحدار	غرينر بيو واحد	163160
HEPES	Gibco	15630
بوكل	سيغما الدريخ	P9541
KH 2 PO 4	سيغما الدريخ	P9791
L - الجلوتامين	Gibco	25030
MgCl 2 × 6H 2 O	Fluka	63068
MgSO 4 × 7H 2 O	سيغما الدريخ	M2773
غ 2 هبو 4 × 2H 2 O	Fluka	71643
كلوريد الصوديوم	سيغما الدريخ	S3014
ناه 2 ص 4 × H 2 O	Fluka	71507
NaHCO 3	Fluka	71628
Nycodenz	Accudenz AG	AN7050/BLK
البنسلين / الستربتوميسين	Gibco	15140
مضخة تمعجية	كول Parmer	HV - 7523-70
الفينول الأحمر	سيغما الدريخ	P4633
Pronase E	Calbiochem	7433-2
سيليكون الخراطيم	Masterflex	HV - 96440-14
الصوديوم البيروفات	Gibco	11360
نسيج قارورة الثقافة (25cm 2)	دينار بحريني	353108
المجنح تسريب مجموعة	Terumo	1SV27EL