تنبيغ من خلايا الإنسان مع البوليمر المعقد Ecotropic الفيروسة البطيئة للسلامة الأحيائية المحسن

Summary

Lentiviruses هي أداة بحث قيما لاستكشاف وظائف الجينات ، إلا أن الباحثين قد ترغب في تجنب إنتاج ترميز الفيروسة البطيئة شمولي التوجه المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم. كبديل ، نقدم أكثر أمانا لاستخدام بروتوكول الفيروسة البطيئة ecotropic على الخلايا البشرية المعدلة للتعبير عن mSlc7a1 مستقبلات ecotropic.

Abstract

الجذعية وبيولوجيا الخلايا السرطانية دراسات غالبا ما تتطلب تنبيغ الفيروسية من الخلايا البشرية والجينات المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، ورفع القضايا الرئيسية لسلامة العاملين في المختبرات. lentiviruses شمولي التوجه ، مثل pseudotype VSV - G شيوعا ، هي أداة قيمة لدراسة وظائف الجينات لأنها يمكن أن تنبيغ أنواع الخلايا عديدة ، بما في ذلك الخلايا غير الانقسام. ومع ذلك ، قد ترغب في تجنب الباحثين الإنتاج والطرد من الفيروسات المسرطنة ترميز شمولي التوجه نتيجة لارتفاع مستوى متطلبات السلامة الأحيائية المناولة وقضايا السلامة. ومن المعروف المسرطنة قوية عدة ، بما في ذلك C - Myc وSV40 المستضد T كبيرة ، لتعزيز إنتاج يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (iPSC). كل أخرى معروفة iPSC الذي يحفز التغيرات الجينية (OCT4 ، SOX2 ، KLF4 ، NANOG ، LIN28 ، وفقدان وظيفة البروتين p53) وأيضا وصلات إلى السرطان ، مما يجعلها ذات الاهتمام سلامة عالية نسبيا أيضا.

في حين أن هذه الفيروسات المرتبطة بالسرطان مفيدة في دراسة إعادة برمجة الخلايا وتعدد القدرات ، لا بد من استخدامها بأمان. لمعالجة هذه القضايا المتعلقة بالسلامة الأحيائية ، ونحن يبرهن على وجود طريقة لتنبيغ الخلايا البشرية ecotropic الفيروسة البطيئة ، مع التركيز على خفض تكلفة إضافية والمناولة المريحة. أنتجنا الفيروسة البطيئة ecotropic مع عيار مرتفع بما فيه الكفاية لتنبيغ أكبر من 90 ٪ من الخلايا المستقبلة للتعبير عن الإنسان يتعرض للفيروس ، والتحقق من فعالية هذا النهج.

ويتركز أغلب الأحيان بواسطة تنبيذ فائق الفيروسة البطيئة ، ولكن هذه العملية تستغرق عدة ساعات ويمكن ان تنتج الهباء المعدية للباحثين الطب الحيوي الإنسان. كما يمكن أن يكون بديلا ، والجسيمات الفيروسية بأمان أكبر الرسوبية على الخلايا complexation مع كبريتات شوندروتن وpolybrene (CS / PB). هذا الأسلوب يزيد من عيار الفيروسية وظيفية تصل إلى أضعاف 3 في خلايا الفئران ستابلي التعبير عن مستقبلات الفيروس الارتجاعي ، مع تذكر الوقت المحتسب بدل الضائع والتكاليف. ومما يعزز من الحد الأقصى تنبيغ الخلايا الليفية الجلد البشري (HDFs) باستخدام CS / PB تركيزات ما يقرب من 4 أضعاف أقل من القيمة المثلى ذكرت سابقا لخطوط الخلايا السرطانية ، مما يوحي معاير ينبغي أن تركيز البوليمر لنوع من الخلايا المستهدفة من الفائدة. وصفنا ذلك استخدام بروميد methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium (MTT) لفحص للسمية البوليمر في نوع من الخلايا الجديدة. نلاحظ بقاء يعادل HDFs بعد تنبيغ الفيروسية باستخدام البوليمر complexation أو جرعة قياسية من polybrene (PB ، 6 ميكروغرام / مل) ، مشيرا إلى الحد الأدنى من السمية الحادة.

في هذا البروتوكول ، ونحن تصف استخدام الفيروسة البطيئة لecotropic overexpression من الجينات المسرطنة في الخلايا البشرية ، والحد من مخاطر السلامة البيولوجية وزيادة معدل تنبيغ. نظهر أيضا استخدام complexation البوليمر لتعزيز تنبيغ مع تجنب تشكيل الهباء الطرد المركزي من الجسيمات الفيروسية.

Protocol

1. Lentivirus production, harvest, and freezing

1. Consult your institutional safety official before beginning this protocol, and follow their recommended safety guidelines.
2. Day 1. Start with healthy, rapidly growing 293T cells to produce virus. Plate the cells at 5 x 10⁶ cells per 10 cm plate. Use antibiotic-free 293T medium (high-glucose DMEM with 10% FBS and 4 mM L-glutamine) for virus production.
3. Day 2. In the late afternoon, transfect 293T cells as follows (numbers given are for one 10 cm plate). Let all reagents warm up to room temperature. Pipette 375 μl OptiMEM into a microcentrifuge tube, then add 25 μl Fugene HD. Do not allow undiluted Fugene to contact the surface of the tube.
4. In a microcentrifuge tube, mix:
   • 5 μg transfer plasmid (Slc7a1, target vector, or fluorescent control vector)
   • 3.75 μg packaging plasmid (pCMV-dR8.91 or psPax2)
   • 1.25 μg envelope plasmid (pMD2.G for pantropic, pHCMV-EcoEnv for ecotropic)
   • serum-free OptiMEM to 100 μl
5. Combine the two tubes and incubate the mixture 20-30 minutes at room temperature.
6. Change the medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Add the Fugene/plasmid mix drop-wise to the plate and incubate overnight at 37°C, 5% CO₂.
7. Day 3. Change medium on the 293T cells to 10 ml fresh antibiotic-free 293T medium. Be gentle, because 293T cells adhere only loosely and can slough off by media pipetted too forcefully onto the monolayer. Incubate for two days in a humidified incubator for virus production.
8. Day 5. Harvest virus and filter with a 0.45 mm low protein binding filter. Use immediately or dispense into single-use aliquots and freeze at -80°C. Frozen pantropic and ecotropic virus should be re-titered after it has been stored for six months and one month, respectively.
9. Titer the virus as follows, using cells that are relatively amenable to transduction. Transduce cells with fluorescent control virus overnight using serial dilutions (e.g. 1:10, 1:100, 1:1000) in fresh medium with 6 μg/ml PB. Change to fresh medium the next day. Allow the cells two days after transduction to begin expressing the fluorescent protein, then determine the fraction of transduced cells by FACS. Calculate the titer in transforming units (TU) per ml, based on dilutions that yield < 15% transduction to minimize multiple transduction events.
   

2. Transduction of human target cells with murine retrovirus receptor Slc7a1

1. Select a multiplicity of infection (MOI) = 2 to ensure that most cells will be transduced. For target cells that are resistant to transduction such as HDFs, a higher MOI will be required; we dilute the viral supernatant only 1:2 to achieve transduction of a majority of the cells.
2. Transduce target cells overnight with viral supernatant diluted in fresh culture medium with 6 μg/ml PB, which increases transduction by enhancing electrostatic interaction between the virus and target cell.¹ Ideally one should use a minimal volume of virus, such as 1 ml for a 35 mm plate, because diffusion is a limiting factor in transduction efficiency.
3. Culture cells for at least 48 hours after removing virus before transducing them with ecotropic virus, in order to ensure sufficient expression of the Slc7a1 receptor.
4. (Optional) It is possible to use blasticidin to select for stably transduced cells expressing Slc7a1, if desired. A blasticidin kill curve should be generated in advance to determine the lowest effective concentration, generally between 2 – 10 μg/ml, that kills all untransduced target cells in 7 days. About 2 days after removing the Slc7a1 virus, switch the transduced cells to medium containing blasticidin. Culture the cells in blasticidin-containing medium for 7 days, at which point all remaining cells will stably express the retrovirus receptor at which point they can be transduced with ecotropic virus as well as banked for future use as a stable Slc7a1-expressing line.

3. Polymer complex titration to determine toxicity

1. Day 1. Plate cells at 5000 cells/well in a 96-well plate, allowing at least triplicate wells for each experimental group. Include untransduced cells in complete medium to provide a baseline value for healthy cells, as well as samples consisting of cells in serum-free medium to induce growth arrest as a control. In parallel, plate cells in an appropriate format (such as a 24-well plate) for microscopic or FACS-based analysis of transduction efficiency in each experimental condition.
2. Day 2. Transduce cells in plates set up for both the MTT and FACS analyses with virus encoding GFP, at an MOI of 0.5 to transduce ~40% of target cells. Test varied concentrations of CS/PB (e.g. 50, 100, 200, 400, 600, and 800 mg/ml of each component), as well as 6 μg/ml PB, to determine optimal amounts. Generate polymer complexes as described in Part 4, below.
3. Day 3. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. Return the plates to a humidified incubator.
4. Day 5. Analyze FACS plate to determine the transduction efficiency with each polymer concentration.
5. Day 6. Remove the medium from all wells of the MTT plate and replace with 100 μl MTT solution (1 mg/ml MTT in complete medium). Culture for three hours in a humidified incubator to allow MTT to be reduced in the mitochondria of metabolically active cells.
6. Remove MTT solution and replace with 200 ml MTT solvent (0.1 N HCl, 0.1% Igepal CA-630 in isopropanol).
7. Incubate for two hours at room temperature or until all of the purple MTT formazan precipitate is dissolved. Read the absorbance on a microplate reader at 570 nm, subtracting the background reading at 690 nm.
8. Select the optimal polymer concentration that produces maximum enhancement of transduction, as determined by FACS, with minimal effect on metabolic activity, as determined by MTT. For HDFs, we selected 100 μg/ml CS/PB based on the data shown in the Representative Results, below.

4. Ecotropic transduction with polymer complexation

1. Prepare sterile-filtered stock solutions of PB and chondroitin sulfate at 20 mg/ml in water. Aliquot and store at -20°C.
2. Pipette viral supernatant into a microcentrifuge tube and dilute to the desired final concentration (e.g. MOI of 2) with fresh culture medium. Add equal volumes of PB and chondroitin sulfate (concentrations determined in step 3 above) in succession, flicking the tube to mix after each addition. The viral mixture will immediately become cloudy as precipitates form. Incubate the viral mixture at room temperature for 5 minutes to allow complex formation.
3. Remove media from the receptor-expressing target cells, replace with the viral mix, and incubate overnight at 37°C, 5% CO2. After removing the viral mix, wash the surface of the cells twice with PBS to aid in removing viral complexes. Complete removal is not necessary; we have observed no adverse effects on cell health from residual polymer complexes.

5. Verifying specificity of ecotropic transduction

1. When producing ecotropic virus for the first time, it is prudent from a safety perspective to verify that the virus is unable to transduce unmodified human cells. Transduce human cells with ecotropic lentivirus at relatively high concentration (only a 1 to 2-fold dilution of viral supernatant in fresh medium) overnight with 6 μg/ml PB or optimized CS/PB concentration.
2. Remove virus-containing medium and replace with fresh medium. After incubating cells for 2 days, validate transgene expression by FACS using fluorescent vectors and/or by RT-PCR with transgene-specific primers.

6. Representative results:

Fig. 1A shows the lentivirus production process, and Fig. 1B shows transduction of human cells with ecotropic lentivirus, including pre-transduction with murine retrovirus receptor Slc7a1. For titering virus, we use a human rhabdomyosarcoma cell line stably transduced with Slc7a1 (Slc-hRMS). When using fluorescent control vectors to monitor transduction efficiency, we routinely achieve > 90% transduction efficiency of Slc-hRMS with ecotropic virus, as shown in Fig. 2A and 2B. Transduction rates of HDFs are generally lower because the cells have not been blasticidin-selected for receptor expression (Fig. 2C). Titers of ecotropic lentivirus are generally 10-20% of VSV-pseudotyped virus when measured on Slc-hRMS (Fig. 2D).

One freeze-thaw cycle reduces titer of ecotropic virus by 16 - 3%, equal to titer loss during a single freeze-thaw cycle of VSV-pseudotyped virus (p > 0.05). Contrary to previous reports,² we observe no positive effect on virus titer from flash freezing in dry ice. Rather, we achieve higher post-thaw titers of either pseudotype by simply placing tubes of virus into a -80°C freezer (data not shown).

The MTT viability assay allows sensitive detection of growth arrest in target cells. Transduction with virus plus concentrations of CS/PB up to 800 μg/ml has no effect on HDF metabolism (Fig. 3A). Exposure to CS/PB without virus also has no toxic effect on cells (data not shown). FACS analysis of HDFs transduced with virus plus various concentrations of CS/PB shows enhancement of transduction compared to PB alone (Fig. 3B). The maximum enhancement occurs at 100 μg/ml CS/PB (Fig. 3C), several-fold lower than previously reported values.³ Thus, it is important to optimize conditions for any given target cell type.

Complexation with CS/PB enhances the observed titer roughly 3-fold in Slc-hRMS (Fig. 4A, p < 0.01). In practice, this yields a greater effect on transduction efficiency at low virus concentrations than at higher concentrations (Fig. 4B), which is most likely due to multiply transduced cells and receptor saturation at higher virus concentrations.

Transduction with ecotropic virus is specific for cells expressing murine retrovirus receptor. When transducing unmodified human cells with ecotropic virus, we have not observed fluorescence greater than the untransduced background whether using PB or CS/PB, as shown in Fig. 5A. Microscopically, HDFs show no transduction in the absence of receptor (Fig. 5B) while pre-transduction with receptor results in fluorescent cells (Fig. 5C).

Figure 1. Schematic view of (A) the virus production process and (B) transduction of human cells with murine retrovirus receptor followed by ecotropic lentivirus.

Figure 2. High-efficiency transduction of human cells with ecotropic lentivirus encoding GFP. Cells were pre-transduced with murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) Human rhabdomyosarcoma cell line blasticidin-selected for Slc7a1 (Slc-hRMS), transduced (blue) or untransduced (pink) with GFP. (B) Fluorescent micrograph of ecotropic-transduced Slc-hRMS (4X). (C) HDFs transduced (blue) and untransduced (pink) with ecotropic GFP lentivirus; cells were transduced with Slc7a1 two days prior to ecotropic transduction. (D) Titer of VSV-G pseudotyped and ecotropic lentivirus, measured on Slc-hRMS.

Figure 3. Optimizing chondroitin sulfate/polybrene (CS/PB) concentrations in human dermal fibroblasts. (A) Viability of HDFs measured by MTT assay after transduction in the presence of PB only or with varied concentrations of CS/PB. (B) Enhancement of transduction efficiency in HDFs by different concentrations of CS/PB, measured by FACS. (C) Quantification of transduction enhancement, showing that maximum transduction occurs at 100 μg/ml CS/PB.

Figure 4. Effect of 400 μg/ml CS/PB on transduction of Slc-hRMS with ecotropic lentivirus. (A) Titer enhancement, and (B) fold change in transduction rate compared to 6 μg/ml polybrene alone.

Figure 5. Lack of ecotropic transduction of HDFs in the absence of murine retrovirus receptor Slc7a1. (A) FACS plot of BJ human fibroblasts, untransduced (pink) or transduced (blue) with ecotropic GFP lentivirus in both cases in the absence of receptor Slc7a1. BJ human fibroblasts transduced with ecotropic GFP lentivirus, without (B) and with (C) pre-transduction with receptor Slc7a1 (4X).

Discussion

ودرس المؤتلف gammaretrovirus ecotropic استنادا فيروس ابيضاض الدم الفأري مولوني (MLV) ومستقبلات mSlc7a1 لها جيدا وعلى نطاق واسع ، بعد أن استخدمت لأكثر من 20 عاما لتوصيل الجينات المحورة إلى خلايا الفئران. كما تم استخدام أكثر gammaretrovirus Ecotropic مؤخرا لتقديم المسرطنة إلى الخلايا البشرية ؛ في سياق إعادة برمجة الخلايا ، واستخدام mSlc7a1 لتجنب توليد فيروس amphotropic بايواء المسرطنة الإنسان راسخة ^4،5 ومع ذلك ، الفيروسة البطيئة يوفر مزايا هامة على gammaretrovirus transducing السكان في خلية صهر ⁽⁶⁾ ، بما في ذلك الخلايا الأولية التي غالبا ما تكون الأهداف المرغوب فيه لإعادة البرمجة ، وذلك لأن lentiviral قبل الاندماج المعقدة تسمح للخلايا تنبيغ عدم تقسيم ⁷

وقد تم إنتاج Lentiviruses مع العشرات من pseudotypes مختلفة ، بما في ذلك MLV ، في محاولة لتغيير tropism الفيروس ، والسمية ، وغيرها من الممتلكات. استخدمت ⁸ الفيروسة البطيئة ecotropic MLV - pseudotyped لتنبيغ خلايا فأر ، ⁹ ولكن نادرا ما كانت تستخدم على الخلايا البشرية ¹⁰ لذلك نحن نقترح استخدام MLV - pseudotyped الفيروسة البطيئة ecotropic كوسيلة آمنة وفعالة من حيث التكلفة وعالية الكفاءة لتقديم المسرطنة المعروفة أو المشتبه بهم ، بما في ذلك عوامل إعادة برمجة الخلايا ، والخلايا البشرية.

فمن الأهمية بمكان أن نلاحظ أن هذا البروتوكول لا تقضي تماما على الحاجة إلى إنتاج واستخدام الفيروسة البطيئة شمولي التوجه ، بل يفصل بين هذا البروتوكول الجين الورمي (ق) من الفيروس شمولي التوجه ، وعزل باحثون من امكاناتها الذاتية التلقيح مع السرطان المرتبطة الفيروسات. وأعرب بتواجد مطلق في mSlc7a1 البروتين وhSlc7a1 لها نديد الإنسان نقل الأحماض الأمينية مع عدم وجود tumorigenicity معروفة أو القدرة على منح ميزة انتقائية على نمو خلايا المتلقي ، ¹¹ mSlc7a1 صنع منخفضة المخاطر نسبيا لإدراجها في amphotropic الفيروس. هذه الخطوة قد تكون مفيدة بشكل خاص وأضاف في المختبرات تفتقر إلى مرافق مخصصة أو الفيروس زراعة الأنسجة من مستوى السلامة الحيوية المطلوبة.

في بعض الحالات قد يكون من الممكن أن تقضي تماما على استخدام فيروس شمولي التوجه من قبل وtransfecting Slc7a1 البلازميد مباشرة إلى الخلايا المستهدفة ، إلا أن العديد من الخلايا التي من شأنها أن تكون مفيدة لأهداف هذه التقنية أيضا لصهر ترنسفكأيشن. كبديل ، والقدرة على عزل الخلايا Slc7a1 - transduced عن طريق الانتقاء blasticidin الوسائل التي يمكن استخدامها VSV - G الفيروسة البطيئة pseudotyped مرة واحدة لإنشاء مخزون من خلايا مستقبلات معربا عن بعد والتي يمكن استخدامها بشكل روتيني لفيروس ecotropic تنبيغ هذه الخلايا بالنسبة لكثير التجارب. وينبغي أن تتبع دائما المبادئ التوجيهية الباحثين سلامتهم المؤسسية للعمل مع أي الفيروسة البطيئة ، بغض النظر عن tropism والخمسين.

التتر من فيروس ecotropic يتحقق مع هذا البروتوكول هي أقل نسبيا من VSV - pseudotyped الفيروس ، عادة 10-20 ٪ من عيار الفيروس شمولي التوجه ، بالاتفاق مع الدراسات السابقة. قيست ⁹ هذه التتر في الخلايا البشرية transduced ستابلي مع Slc7a1 ، وبالتالي فإن انخفاض وقد لاحظ لفيروس عيار ecotropic أن يعزى ذلك جزئيا إلى التعبير متنوعة من الجين في مستقبلات الخلايا المستهدفة. ومع ذلك ، فإن التتر الفيروسية التي تحققت في بروتوكول لدينا هي أكثر من كافية بالنسبة لمعظم التطبيقات ، وتؤدي إلى تنبيغ غالبية الخلايا ، في بعض الحالات> 90 ٪ من الخلايا.

ويشيع استخدام التقنيات المعتمدة على الطرد المركزي لتركيز الجسيمات الفيروسية. ويمكن استخدام ومع ذلك ، تتطلب عدة ساعات الطرد المركزي ، ويولد الهباء المعدية ، ويمكن أن يتسبب في خسائر كبيرة من الجزيئات الفيروسية ^(12). وكبديل ، مع complexation CS / PB لتعزيز تنبيغ دون تغيير tropism الفيروسية. ³ هذا الأسلوب السريع (5 دقائق ) وغير مكلفة (0.03 دولار للفيروس مل 10) ، في حين أن ثلاثة أمثالها تقريبا عيار ملاحظتها. وهناك حاجة إلى معدات خاصة أو الكواشف الملكية ، لاحظنا والحد الأدنى من السمية الحادة بعد التعرض للHDFs إلى CS / PB ، بالاتفاق مع الأعمال السابقة في خطوط الخلايا الأخرى. ¹³ عيب واحد المحتملة لهذا البروتوكول هو أن بعض مرئية المجهر مجمعات البوليمر التمسك الخلايا لعدة أيام في الثقافة. لا يمكننا استبعاد احتمال ان هذه المجمعات ، في حين لا علنا ​​السامة للخلايا ، قد يكون لها آثار أكثر مكرا على العمليات الخلوية.

هنا قد وصفنا منهجية لبأمان وكفاءة الخلايا البشرية transducing مع عوامل أنكجنيك. هذا النهج ينبغي أن تكون ذات فائدة كبيرة للباحثين الذين يدرسون الجينات المسرطنة وبيولوجيا الخلايا الجذعية بما في ذلك خلايا الجذع.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
اسم كاشف	شركة	فهرس العدد	تعليقات
pLenti6/UbC/mSlc7a1	Addgene	17224	فأري MLV مستقبلات
pMD2.G	Addgene	12259	VSV - G مغلف
pCMV - dR8.91	دال Trono مختبر 14		التغليف البلازميد (ما يعادل psPax2 البلازميد هو متاح من Addgene ، القط. رقم 12260)
pHCMV - EcoEnv	Addgene	15802	Ecotropic مغلف
FUGW	Addgene	14883	GFP السيطرة البلازميد
OptiMEM	Invitrogen	31985
Fugene HD	روش	04 709 705 001
Hexadimethrine بروميد (Polybrene)	سيغما الدريخ	H9268
شوندروتن كبريتات الصوديوم من غضروف سمك القرش	سيغما الدريخ	C4384
Blasticidin S	الصياد	BP 2647100
Methylthiazolyldiphenyl - tetrazolium بروميد (MTT)	سيغما الدريخ	M2128
Igepal CA - 630	سيغما الدريخ	I3021